Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
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Les auteurs tiennent à remercier Lorenzo Sewanan et Jorge Nunez pour leur travail de développement de la conception de cassettes de culture tissulaire utilisée dans ce protocole, le laboratoire Kaminski pour l’utilisation de leur vibratome, Maurizio Chioccioli et Jessica Nouws pour l’aide au tranchage des poumons, Allie LaRocco pour l’aide aux expériences pilotes initiales et Hong Qian pour la lecture attentive du protocole. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH F30HL143880 (K.L.L.), la subvention de formation du programme de formation des scientifiques médicaux T32GM136651 (K.L.L.) et U01HL145567 (L.E.N.); et par un don de recherche sans restriction de Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. est fondateur et actionnaire de Humacyte, Inc., une société de médecine régénérative. Humacyte produit des vaisseaux sanguins artificiels à partir de cellules musculaires lisses allogéniques pour la chirurgie vasculaire. Le conjoint de L.E.N. détient des participations dans Humacyte, et L.E.N. siège au conseil d’administration de Humacyte. L.E.N. est une inventrice de brevets concédés sous licence à Humacyte et qui produisent des redevances pour L.E.N. L.E.N. a reçu un don de recherche sans restriction pour soutenir la recherche dans son laboratoire de Yale. Humacyte n’a pas influencé la conduite, la description ou l’interprétation des conclusions du présent rapport.

Cet article décrit l’utilisation de tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision comme plate-forme pour générer des tissus pulmonaires modifiés in vitro, qui contiennent des structures alvéolaires multi-lignées. En combinant les stratégies que nous avons précédemment développées pour repeupler des échafaudages pulmonaires ECM acellulaires haute fidélité pour l’ingénierie pulmonaire entière22,31, avec notre système robuste pour la culture de tissus cardiaques modifiés à petite échelle30, ce protocole permet l’utilisation d’ECM pulmonaire physiologiquement pertinent comme substrat de culture tissulaire, de manière reproductible et à débit modéré.
Les méthodes présentées ici détaillent la préparation de l’échafaudage ELT à partir de poumons de rat, qui sont facilement accessibles, peuvent être extraites en bloc avec un accès direct aux voies respiratoires intactes pour l’inflation de l’agarose, et sont de plus grande taille que le poumon de souris. Cependant, tout tissu pulmonaire qui peut être gonflé avec de l’agarose et donner des tranches d’au moins 9 mm de longueur peut être utilisé dans ce système. Quelle que soit la source de tissu, le gonflage uniforme du tissu pulmonaire avec l’agarose est l’étape la plus critique pour assurer le succès du tranchage, de l’écrêtage et de la manipulation des tissus en aval. Le tissu pulmonaire sous-gonflé a tendance à ne pas trancher proprement, tandis que le tissu surgonflé peut se déchirer lors de la coupe. Après la gélification de l’agarose, les régions tissulaires gonflées de manière appropriée sont fermes, mais donnent un peu de répit lorsqu’elles sont pressées doucement avec une pince. Pour les poumons de rats intacts, nous avons constaté que le prégonflage des poumons extraits avec de l’air plusieurs fois, suivi d’une inflation de l’agarose dès que possible après l’extraction, donne les meilleurs résultats de tranchage et la meilleure qualité des échafaudages tissulaires résultants. Le volume approprié d’agarose doit être optimisé empiriquement; pour un poumon de rat, le volume nécessaire pour gonfler le poumon à la capacité pulmonaire totale est d’environ 30 mL/kg de masse animale (p. ex., 10,5 ml d’agarose pour les poumons d’un rat de 350 g). Pour les tissus pulmonaires réséqués plus gros avec un accès moins simple aux voies respiratoires (comme ceux de donneurs humains), un dépannage supplémentaire peut être nécessaire pour gonfler le tissu via une bronche32. Lors du tranchage ultérieur des poumons, la sélection et l’orientation du tissu sur le piston est une autre étape importante pour 1) s’assurer que les tranches sont suffisamment grandes pour générer des bandelettes de tissu qui peuvent être clipsées dans des cassettes de culture tissulaire et 2) maximiser la zone tissulaire parenchymateuse (alvéolaire), à l’exclusion des grandes voies respiratoires ou des vaisseaux.
Couper le PCLS dans des cassettes de culture tissulaire peut être une étape difficile au début, mais les cassettes simplifient considérablement la manipulation des tissus pendant la décellularisation et l’ensemencement. Deux problèmes potentiels qui peuvent survenir sont la déchirure des tissus (soit pendant le processus de coupe, soit pendant la décellularisation), ou le positionnement des tissus dans les clips qui entraîne un mauvais ensemencement en aval (par exemple, pas d’ensemencement ou ensemencement juste aux extrémités). La déchirure peut être le résultat d’une surinflation de l’agarose, d’un étirement excessif du tissu lors de l’insertion de la languette ou d’un surplomb trop faible pour fournir une adhérence adéquate des tissus lors de l’insertion des languettes. Notez que les tranches qui se déchirent à une extrémité du clip peuvent être ensemencées avec succès, cependant, elles sont difficiles à visualiser au microscope pendant la culture car le tissu n’est pas plat. Un mauvais ensemencement des tissus (comme celui de la figure 6C) est probablement le résultat du fait que la tranche ne se trouve pas à plat entre les deux clips et qu’elle entre donc mal en contact avec la base du bain d’ensemencement lorsqu’elle est retournée à l’envers. Une autre cause possible est une mauvaise assise de la cassette dans le fond du puits de bain d’ensemencement. En termes de coupe, appliquez un peu plus de tension dans le tissu lorsque vous placez le deuxième clip pour l’aider à rester à plat. Certaines tranches ont une légère concavité; dans ces cas, coupez la tranche avec le côté convexe vers le haut. Avec de la pratique, nous constatons généralement un ensemencement raté avec moins de 2% de tranches.
L’une des limites de ce protocole est l’exigence d’un équipement spécialisé - une découpeuse laser et une imprimante 3D - pour générer les matériaux initiaux pour la préparation elT. Cependant, une fois que les cassettes de culture tissulaire et les bains d’ensemencement sont créés, aucun matériau spécial supplémentaire n’est nécessaire. Les étapes de tranchage et de décellularisation des poumons de la préparation de l’échafaudage ELT prennent modérément du temps; cependant, ces étapes peuvent être effectuées à l’avance, ou en nombre suffisant pour préparer plusieurs expériences en même temps. De nombreux PCLS (>100 si l’optimisation pour les régions parenchymateuses) peuvent être coupés à partir d’un seul poumon et congelés pour une utilisation ultérieure. Bien qu’un seul cycle de gel-dégel puisse causer des dommages ultrastructuraux mineurs à l’ECM46, il a été démontré que même plusieurs cycles de gel-dégel ne causent pas de perte significative dans l’ECM 23,47. Le PCLS peut également être coupé et décellularisé avant une expérience, pour être utilisé dans un délai d’un mois. (Notamment, le protocole de décellularisation décrit peut être accompli en environ 6 heures, ce qui représente un avantage significatif par rapport aux méthodes décrites précédemment qui nécessitent un jour ou plus27,28.) Une fois les échafaudages préparés, le processus d’ensemencement cellulaire est simple et rapide, et la culture des ELT ne nécessite pas de techniques spécialisées.
Une mise en garde de la méthode ELT décrite est l’absence d’ensemencement spécifique à la région, c’est-à-dire l’administration d’AEC2 spécifiquement à l’espace alvéolaire ou de cellules endothéliales spécifiquement à l’espace vasculaire. Néanmoins, bien que les cellules soient simplement ensemencées au-dessus des échafaudages tissulaires, le modèle de recellularisation n’est pas aléatoire, avec un semblant d’organisation alvéolaire, y compris des anneaux épithéliaux. Nous soupçonnons que les interactions cellule-cellule, ainsi que les différences locales dans la composition et la géométrieecm 20,21, contribuent probablement aux modèles de recellularisation observés. À l’appui de cette hypothèse, une étude publiée précédemment, dans laquelle les fibroblastes ont été ensemencés non spécifiquement sur des tranches pulmonaires décellularisées, a démontré que le modèle de repeuplement tissulaire et les phénotypes cellulaires associés variaient considérablement selon la région tissulaire microscopique et la source d’échafaudage ECM (par exemple, sain ou malade)27. On a également observé que les fibroblastes envahissaient l’interstitium - l’endroit où ils résident dans le tissu pulmonaire natif 1,27. La principale méthode alternative que nous pouvons imaginer pour cultiver des cellules sur des tranches de poumon d’une manière vraiment spécifique à la région consisterait à ensemencer des poumons décellularisés intacts via les voies respiratoires31,48 et les compartiments vasculaires49,50, puis à trancher le tissu recellularisé. Cependant, cette solution de rechange 1) est beaucoup plus coûteuse, plus longue et plus coûteuse en ressources; 2) est un débit inférieur; 3) nécessite un nombre accru d’animaux; et 4) est associé à un risque accru de contamination en raison des défis liés à la culture pulmonaire entière et au tranchage ultérieur du poumon ensemencé. Bien qu’elle ne récapitule pas tous les aspects de l’organisation cellulaire native, la plate-forme ELT permet la culture de cellules pulmonaires sur un substrat ECM physiologiquement pertinent, d’une manière accessible à de nombreux autres laboratoires.
La flexibilité du système ELT est un avantage majeur de cette plate-forme et devrait permettre la culture de tissus pulmonaires à petite échelle avec un nombre illimité d’échafaudages tissulaires, de cellules ou de milieux de culture d’intérêt. L’utilisation d’échafaudages dérivés de tissus malades ou de modèles de blessures peut permettre d’étudier les interactions cellule-cellule ou cellule-matrice dans le cadre de l’ECM 27,29,51 altéré par la maladie. Cependant, notez que le protocole de décellularisation devra peut-être être adapté pour tenir compte des différences matricielles entre les espèces52. La stratégie d’ensemencement décrite peut être utilisée pour n’importe quel type de cellule et la chronologie de culture adaptée aux besoins du chercheur. Comme point de départ, 1 x 106 cellules par échafaudage devraient produire un tissu hautement cellulaire dans les 7 jours suivant la culture, tandis que 1 x 105 cellules totales entraînent une mauvaise cellularité. Dans toute adaptation de la chronologie, les cassettes de culture tissulaire doivent être retirées du bain d’ensemencement 24 heures après le dernier ensemencement tissulaire. Ici, dans le but de modéliser une partie de la complexité cellulaire de l’alvéole pulmonaire, nous décrivons une stratégie de recellularisation tri-culture qui soutient le maintien d’AEC2 néonatals bien différenciés dans des structures alvéolaires pendant au moins 7 jours. Nos résultats démontrent également la greffe réussie de fibroblastes et de cellules endothéliales dans les ELT, soulignant la large applicabilité du substrat de culture et sa pertinence pour les études de co-culture. L’ensemencement de cellules adultes dans des ELT peut faciliter la modélisation de structures alvéolaires plus reposantes, tandis que l’ensemencement d’AEC2 humains dérivés de PSC, y compris ceux présentant des modifications génétiques, pourrait faciliter les études translationnelles de la maladie humaine13,53. En général, l’approche ascendante permise par la plate-forme ELT offre la possibilité d’étudier les contributions de types de cellules particuliers à des lectures d’intérêt - telles que l’état de prolifération ou de différenciation AEC2.
En résumé, ce protocole décrit un système robuste pour générer des tissus pulmonaires modifiés pour des études de co-culture d’AEC2, de fibroblastes et de cellules endothéliales dans des échafaudages de tranches pulmonaires ECM acellulaires. Les ELT représentent une nouvelle stratégie de culture 3D pour les AEC2 primaires, qui jusqu’à présent se sont généralement appuyées sur des matrices de type gel moins physiologiques pour maintenir un phénotype 6,11,12 bien différencié. La plate-forme actuelle s’appuie sur des travaux antérieurs dans le repeuplement de tranches pulmonaires décellularisées 24,25,26,27,28,29, mais offre plusieurs avantages: 1) un système de cassette de culture tissulaire pour faciliter la manipulation de l’ELT pendant la décellularisation, l’ensemencement et la culture; 2) un bain d’ensemencement personnalisé pour ensemencer avec précision un nombre connu de cellules sur chaque échafaudage de tranches; et 3) une stratégie de réensemencement en trois cultures qui permet le repeuplement des tissus alvéolaires avec des cellules épithéliales, mésenchymateuses et endothéliales. Ainsi, les ELT représentent une étape importante vers la création de modèles in vitro reproductibles qui capturent la complexité cellulaire et du substrat de l’alvéole native et de la niche des cellules souches AEC2.

Les alvéoles sont les unités fonctionnelles du poumon distal, comprenant un maillage d’espaces aériens échangeant des gaz bordés de cellules épithéliales alvéolaires de type 1 (AEC1) et de cellules de type 2 (AEC2). Derrière l’épithélium se trouve un réseau dense de capillaires ainsi que du mésenchyme de soutien, le tout soutenu par un échafaudage à matrice extracellulaire (ECM) qui fournit à la fois force et flexibilité à ces sacs aériens délicats1. Les alvéoles sont également le site de blessures dans de nombreuses pathologies pulmonaires, y compris la fibrose pulmonaire idiopathique2, le syndrome de détresse respiratoire aiguë3 et la maladie à coronavirus sévère-19 (COVID-19)4. Bien que les travaux de la dernière décennie aient révélé une plasticité remarquable dans l’épithélium pulmonaire, les mécanismes qui permettent la réparation pulmonaire distale dans certains contextes - et qui empêchent la réparation dans d’autres - restent un domaine d’investigation intense5. Le développement de plateformes in vitro améliorées pour modéliser l’alvéole faciliterait les études de biologie alvéolaire, de régénération et de thérapeutique.
Les AEC2 s’auto-renouvellent et se différencient en AEC1, et sont donc considérés comme la cellule souche primaire du poumon distal 6,7,8. Cependant, ces cellules posent un défi particulier à l’étude in vitro étant donné les difficultés associées à la culture d’AEC2 primaires sans perte de phénotype9. Dans la culture conventionnelle en 2 dimensions (2D), les AEC2 s’aplatissent et adoptent certaines caractéristiques des cellules de type AEC110. En revanche, les stratégies de culture 3D, le plus souvent des organoïdes, soutiennent le maintien de caractéristiques différenciées dans les AEC2 primaires 6,11,12 et permettent la culture à long terme d’AEC2s dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC)13,14. Les organoïdes ont été utilisés pour modéliser le développement pulmonaire distal15, l’infection virale11,15 et la maladie génétique liée à l’AEC2 13,16,17, permettant ainsi d’obtenir des informations importantes sur la biologie et la régénération de l’AEC2. Cependant, ces modèles de culture ne comprennent généralement qu’une ou deux lignées cellulaires et intègrent les cellules dans des matrices de type gel qui ne parviennent pas à récapituler l’architecture ou le substrat ECM de l’alvéole pulmonaire native.
L’ECM est un régulateur critique du phénotype et du comportement cellulaires via des indices moléculaires, topologiques et mécaniques; comprend un élément clé des niches spécifiques aux tissus régulant le devenir des cellules souches; et sert de réservoir qui module la disponibilité des facteurs de croissance sécrétés localement 18,19,20,21. La culture de cellules sur ECM natif peut ainsi augmenter la capacité prédictive des systèmes in vitro à modéliser la biologie des tissus in vivo. La décellularisation, un processus qui élimine le matériel cellulaire des tissus via des détergents, des enzymes ou des méthodes physiques ou autres, peut préserver en grande partie l’échafaudage ECM d’un organe natif, lorsqu’elle est soigneusement effectuée22,23. De tels échafaudages peuvent être repeuplés avec des cellules pour la culture biomimétique 3D. Cependant, bien que les échafaudages décellularisés soient largement utilisés pour les applications d’ingénierie tissulaire, leur utilisation pour la culture cellulaire de routine a été limitée. Plusieurs études antérieures ont rapporté la décellularisation et la recellularisation de tranches pulmonaires ou de petits segments de tissu pulmonaire. En plus des études de preuve de concept 24,25,26, des tranches pulmonaires repeuplées ont été utilisées pour étudier l’adhésion de la matrice des fibroblastes 27,28 et pour étudier l’effet des matrices pulmonaires malades sur le phénotype de fibroblastes27,29. Grâce aux technologies améliorées disponibles pour générer des tranches de tissu découpées avec précision, les tranches pulmonaires décellularisées pourraient offrir une plate-forme pratique et à petite échelle avec laquelle cultiver des cellules, tout en préservant les sous-structures alvéolaires, des voies respiratoires et vasculaires. L’intégration de plusieurs types de cellules permettrait d’étudier les interactions cellule-cellule dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. Cependant, des stratégies améliorées sont nécessaires pour faciliter la manipulation des tissus tout au long du processus de culture et pour assurer un ensemencement contrôlé et reproductible des tissus avec un nombre connu de cellules.
Ici, nous présentons un protocole pour générer des tissus pulmonaires modifiés (ELT) en repeuplant des tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision (PCLS) avec des cellules endothéliales primaires, des AEC2 et des fibroblastes. Dans une adaptation de notre système de tissu cardiaque30 et de nos stratégies de décellularisation-recellularisation des poumons entiers22,31, nous décrivons les procédures permettant de couper le PCLS des poumons de rats et de clipser les tranches dans des cassettes de culture tissulaire réutilisables qui simplifient et normalisent les manipulations en aval. Les tranches coupées sont décellularisées pour former des échafaudages ECM acellulaires, qui sont repeuplés dans des bains de semis personnalisés. Les échafaudages en tranches pulmonaires préservent les composants et l’architecture critiques de l’ECM et soutiennent la croissance des AEC2 dans des structures alvéolaires multi-lignées pendant au moins 7 jours. Les ELT représentent un nouveau système de co-culture alvéolaire au sein d’une matrice 3D physiologiquement pertinente, qui devrait soutenir le développement de stratégies d’ingénierie tissulaire pulmonaire, tout en facilitant les études biologiques de base des AEC2 et de l’alvéole.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Il est nécessaire d’améliorer les modèles pulmonaires en 3 dimensions (3D) qui récapitulent la complexité architecturale et cellulaire de l’alvéole pulmonaire native ex vivo. Des modèles organoïdes récemment développés ont facilité l’expansion et l’étude des progéniteurs épithéliaux pulmonaires in vitro, mais ces plates-formes reposent généralement sur une matrice et/ou un sérum dérivés de tumeurs de souris et n’incorporent qu’une ou deux lignées cellulaires. Nous décrivons ici un protocole de génération de tissus pulmonaires modifiés (ELT) basé sur la recellularisation multi-lignée de tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision (PCLS). Les ELT contiennent des structures de type alvéolaire comprenant l’épithélium alvéolaire, le mésenchyme et l’endothélium, dans un substrat de matrice extracellulaire (ECM) ressemblant étroitement à celui du poumon natif. Pour générer les tissus, les poumons de rat sont gonflés avec de l’agarose, tranchés en tranches de 450 μm d’épaisseur, coupés en bandes et décellularisés. Les échafaudages ECM acellulaires résultants sont ensuite réensemencés avec des cellules endothéliales primaires, des fibroblastes et des cellules épithéliales alvéolaires de type 2 (AEC2). Les AEC2 peuvent être maintenus en culture ELT pendant au moins 7 jours avec un milieu de croissance sans sérum et chimiquement défini. Tout au long du processus de préparation et de culture des tissus, les tranches sont clipsées dans un système de cassette qui facilite la manipulation et l’ensemencement cellulaire normalisé de plusieurs ELT en parallèle. Ces ELT représentent une plateforme de culture organotypique qui devrait faciliter l’étude des interactions cellule-cellule et cellule-matrice au sein de l’alvéole ainsi que des signaux biochimiques régulant les AEC2 et leur niche.

La figure 3 présente un aperçu du processus de génération d’ELT - comprenant le tranchage des poumons, l’écrêtage et la décellularisation des tranches et le repeuplement de l’échafaudage. Les ELT présentées ici ont été cultivées à l’aide de cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires primaires de rat (voir tableau des matériaux), d’AEC2 de rat néonatal et de fibroblastes pulmonaires néonatals de rat enrichis en lipofibroblastes36. Les AEC2 ont été fraîchement isolés par tri magnétique à base de billes, comme décrit précédemment37; d’autres protocoles d’isolement ont été détaillés et discutés ailleurs 38,39,40. La pureté des AEC2 isolés chez le rat peut être évaluée par cytométrie en flux pour le marqueur de surface AEC2 spécifique au rat RTII-7041, ou par coloration d’un échantillon de cellules cytocentrifugées pour RTII-70 ou protéine pro-tensioactif C (pSPC). Les fibroblastes pulmonaires de rat ont été isolés chez des ratons postnatals de jour 7 à 9 selon une adaptation d’un protocole42 publié et utilisés aux passages 1-2; d’autres protocoles d’isolement ont été décrits ailleurs43,44. La pureté des fibroblastes isolés peut être évaluée par coloration de cellules cultivées ou cytocentrifugées pour la vimentine marqueur mésenchymateux, et l’enrichissement en lipofibroblastes peut être évalué par coloration pour Oil Red O45.
Lorsque le tissu pulmonaire est uniformément gonflé avec de l’agarose et que des morceaux de tissu sont stratégiquement sélectionnés et orientés pour le tranchage afin de maximiser la surface totale et parenchymateuse du tissu, un poumon de rat peut produire du tissu pour >100 ELT alvéolaires. Les bandes de PCLS présentent une intégrité mécanique suffisante pour être clipsées dans des cassettes de tissu avec peu (<5%) cas de déchirure (figure 3B).
Le protocole de décellularisation des tranches pulmonaires est étroitement basé sur notre protocole de décellularisation pulmonaire entière publié précédemment, qui, par protéomique quantitative, a démontré qu’il préserve de nombreux composants ECM à des niveaux non significativement différents de ceux du poumon natif22. Les échafaudages en tranches décellularisées préservent l’architecture native des alvéoles, telle que vue par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) (Figure 4A, B) et par microscopie à contraste de phase (Figure 4C). Nous excluons généralement les échafaudages contenant de grandes voies respiratoires ou des vaisseaux (figure 4D) ou des déchirures, bien que les premiers puissent être inclus s’ils intéressent le chercheur. La décellularisation entraîne une réduction de 96 % de la teneur en ADN tissulaire mesurée par un essai pour l’ADN double brin (voir tableau des matériaux; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg dans les tissus natifs vs décellularisés, respectivement, moyenne ± SEM) (Figure 5A), sans ADN visible par coloration à l’hématoxyline (Figure 4B). La coloration histologique et immunofluorescente des échafaudages décellularisés révèle le maintien des protéines ECM collagène, élastine, collagène IV et laminine avec une architecture et une quantité similaires à celles des tranches pulmonaires natives (Figure 5B-E). Notez que les noyaux des tissus natifs tachent en bleu/noir avec des taches de trichome (pour le collagène) et d’EVG (pour l’élastine). La coloration immunofluorescente a été effectuée comme décrit précédemment, en utilisant des méthodes standard pour colorer les tissus37. Les anticorps utilisés et leurs concentrations respectives sont énumérés dans le tableau 4.
Un repeuplement réussi de l’échafaudage conduit à des ELT hautement cellulaires après 7 jours, avec un modèle de repeuplement de type alvéolaire visible par microscopie optique (Figure 6A-C). Dans certains cas, avec une très grande cellularité, des structures de type organoïde peuvent être visibles (Figure 6A,B). L’ensemencement tissulaire infructueux peut être visualisé par microscopie à contraste de phase pendant la culture (Figure 6C). Après avoir cultivé des échafaudages tissulaires avec des AEC2, des fibroblastes et des cellules endothéliales, les ELT sont densément repeuplés avec des structures alvéolaires comprenant les trois lignées cellulaires (Figure 6D, E). Au jour 7 ou 8, les AEC2 maintiennent la morphologie cuboïdale et expriment la protéine B du surfactant (SPB) et la protéine du corps lamellaire ABCA3, sans preuve de différenciation significative par rapport aux AEC1 (Figure 6E,F). Les AEC2 sont très prolifératifs dans les ELT, comme le démontre l’incorporation de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) après une impulsion de 2 h à 10 μM (Figure 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figure 1: Schéma du système de perfusion pour l’extraction et le nettoyage des poumons. (A) Le système de perfusion comprend un membre gravitaire, utilisé pour la canulation initiale de l’artère pulmonaire sous écoulement; et un membre entraîné par pompe, utilisé pour nettoyer efficacement les poumons après la canulation initiale. La conduite de pompe comprend un « amortisseur d’impulsions » qui amortit les pics de pression causés par la pompe. La conception des canules artérielles trachéales et pulmonaires est détaillée à gauche. SNP = nitroprusside de sodium. (B) Détails de l’ensemble de l’amortisseur d’impulsions. BpT et silicone se réfèrent à des types de tubes. (C) Positions des canules artérielles trachéales et pulmonaires placées lors de l’extraction pulmonaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figure 2 : Chronologie de la culture pour la recellularisation des trilignes. Calendrier proposé pour l’ensemencement et la culture d’ELT tri-lignées, y compris le calendrier de l’ensemencement en deux phases. Le nombre de cellules pour l’ensemencement et le milieu de culture pour chaque phase sont indiqués. Voir les détails des milieux culturels dans le tableau 3. AEC2 = cellule épithéliale alvéolaire de type 2. EC = cellule endothéliale. FB = fibroblaste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figure 3: Schéma de la préparation du tissu pulmonaire modifié. (A) Le tissu pulmonaire natif est coupé en tranches à l’aide d’un vibratome. (B) Les tranches pulmonaires coupées avec précision sont découpées en bandes normalisées de 3 mm de large, clipsées dans des cassettes de culture tissulaire en polytétrafluoréthylène (PTFE) et décellularisées par détergent pour produire des échafaudages de matrice extracellulaire acellulaire. (C) Les échafaudages sont réensemencés dans des bains d’ensemencement spécialisés qui confinent la zone d’ensemencement à la zone du tissu, puis cultivés dans une plaque de puits standard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figure 4 : Structure des échafaudages pulmonaires décellularisés. Coloration H&E des tranches pulmonaires natives (A) et décellularisées (B) montrant la préservation de l’architecture alvéolaire après décellularisation. (C,D) Exemples d’échafaudages ECM décellularisés vus à grossissement 5x par microscopie à contraste de phase, comprenant principalement du tissu alvéolaire (C) ou contenant de grandes voies respiratoires et vaisseaux ramifiés (D, pointes de flèches noires et rouges). Barres d’échelle, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figure 5 : Retrait de l’ADN et préservation de la matrice dans les échafaudages pulmonaires décellularisés. (A) Quantification de l’ADN dans les tranches pulmonaires natives et décellularisées (moyenne ± SEM, n = 5). Test t de Welch, **P < 0,01. Decell = décellularisé. (B,C) Coloration histologique des tranches pulmonaires natives et décellularisées pour le collagène (B) et l’élastine (C). Pointes de flèches, élastine conservée dans des anneaux d’entrée alvéolaires de tissu décellularisé. (D,E) Coloration immunofluorescente de tranches pulmonaires natives et décellularisées pour le collagène IV (D) et la laminine (E). Barres d’échelle, 50 μm. Dans tous les panneaux, des zones en pointillés dessinent la région de l’image agrandie vers la droite dans chaque panneau respectif. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figure 6 : Repeuplement cellulaire des tissus pulmonaires modifiés. (A-C) Exemples d’ELT recellularisées au jour 7 de la culture, telles que visualisées pendant la culture par microscopie à contraste de phase. Le modèle de recellularisation reflète la structure alvéolaire du tissu. Dans certaines zones de haute cellularité, des structures organoïdes peuvent se former (pointes de flèche). (A) et (B) représentent un repeuplement cellulaire réussi, tandis que (C) représente un faible niveau de recellularisation après 7 jours de culture. (D-G) Coloration des ELT recellularisées au jour 7 ou 8 de la culture. (D) Coloration H&E montrant un repeuplement cellulaire des septa alvéolaires. (E) Étiquettes de coloration immunofluorescente greffées de fibroblastes proCollagenIα1+, d’ABCA3+ AEC2 et de cellules endothéliales CD31+. (F) Les tissus contiennent des SPB+ AEC2 abondants mais peu de RTI-40 (podoplanine)+ AEC1 dans ces conditions. (G) De nombreux AEC2 prolifèrent dans les ELT, tels que mesurés par l’incorporation d’EdU. Barres d’échelle, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Solutions de décellularisation. Détails de préparation pour les solutions de décellularisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Protocole de décellularisation. Détails du protocole de décellularisation des tranches pulmonaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Milieux culturels. Détails de préparation pour les milieux de croissance endothéliaux et AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 4 : Anticorps utilisés pour l’immunocoloration. Détails des anticorps et de leurs concentrations utilisés pour l’immunocoloration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Conception pour la découpe au laser de cadres de cassettes de culture tissulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : Conception pour la découpe au laser de clips de cassettes de culture tissulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 3 : Conception pour la découpe laser d’onglets de cassettes de culture tissulaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 4 : Fichier CAO pour la base de moule de bain d’ensemencement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 5 : Fichier CAO pour l’anneau de moule de bain d’ensemencement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Ce protocole décrit une méthode pour générer des tissus pulmonaires modifiés reproductibles à petite échelle, en repeuplant des tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision avec des cellules épithéliales alvéolaires de type 2, des fibroblastes et des cellules endothéliales.

Tissus pulmonaires modifiés préparés à partir de tranches pulmonaires décellularisées

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Ce protocole permet l’utilisation reproductible de la matrice extracellulaire pulmonaire intacte comme substrat de culture tissulaire tridimensionnelle et à débit modéré. Le principal avantage du système de tissu pulmonaire artificiel est la flexibilité de la plate-forme. Les ELT peuvent être adaptées pour utiliser divers échafaudages tissulaires, cellules ou milieux de culture d’intérêt.Une fois les poumons extraits, remplissez une seringue de 10 millilitres avec de l’agarose et du HBSS sans rouge phénol. Gonfler les poumons avec environ 10 millilitres d’air via la canule de la trachée, puis injecter immédiatement l’agarose préparée via la canule de la trachée jusqu’à ce que les extrémités les plus distales des lobes pulmonaires soient gonflées. Coiffez la trachée en attachant le capuchon blanc d’un robinet d’arrêt à quatre voies à la serrure femelle de la canule trachéale.Placez le poumon dans une boîte de Petri de 150 millimètres sur de la glace pour permettre à l’agarose de se solidifier. Préparez les tranches de poumon selon le protocole du manuscrit, puis remplissez une boîte de Petri de 100 millimètres avec 1/3 de volume de PBS. Transférez les cassettes et les languettes dans le plat à l’aide de pinces.Si les tranches sont congelées, décongeler un plat à la fois en versant sur du PBS à température ambiante. Ensuite, transférez une tranche décongelée dans une boîte de Petri de 150 millimètres. Déplier doucement la tranche à l’aide d’une pince fine ou d’un hémostat et aspirer soigneusement l’excès de PBS autour du tissu.Ensuite, coupez une bande de trois millimètres de large et d’au moins neuf millimètres de long de la tranche en appuyant fermement sur toute la longueur d’une lame de rasoir contre le plat et en le berçant légèrement d’un côté à l’autre. Pour clipser la bande de tissu dans la cassette, faites-la flotter au-dessus de la cassette, en la centrant soigneusement pour l’étendre au-delà des trous dans les clips à chaque extrémité. Placez une languette en partie dans le trou à une extrémité avec une pince fine, redressez doucement le tissu et réglez la deuxième languette.Enfin, utilisez des pinces pour appuyer complètement sur chaque languette afin de sécuriser le tissu. Après avoir coupé tous les côtés, transférez la parabole de 100 millimètres contenant les cassettes dans une hotte à flux laminaire. Transférez les cassettes sur des plaques à six puits contenant la première solution de décellularisation à l’aide d’un hémostat incurvé pour saisir les côtés entaillés.Ensuite, placez la plaque à six puits sur un agitateur orbital à 30 tr / min pendant 10 minutes. Aspirer le liquide de chaque puits, puis le remplacer par trois millilitres de la deuxième solution de décellularisation par puits. Placez la plaque sur un agitateur orbital à 30 tr/min et incubez pendant cinq minutes.Répétez ce processus avec chaque solution comme indiqué dans le protocole de décellularisation du manuscrit. Après le rinçage final avec du PBS, transférer les tissus dans des plaques stériles à six puits contenant du PBS frais avec des antibiotiques et des antimycotiques et incuber à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Après la stérilisation avec des antibiotiques et des antimycotiques, les échafaudages de tissus pulmonaires peuvent être ensemencés immédiatement ou stockés à quatre degrés Celsius pendant 30 jours.Avant de les utiliser pour la culture, incuber des échafaudages stockés à quatre degrés Celsius avec du PBS frais et des antibiotiques et antimycotiques pendant la nuit à 37 degrés Celsius comme étape de stérilisation supplémentaire. Ensuite, rincez les échafaudages avec du PBS stérile, cinq millilitres par puits, trois fois, pendant cinq minutes chacun. Examinez les échafaudages sous un microscope à contraste de phase avec un grossissement de 5X pour sélectionner les tissus à ensemencer.Préparer la suspension de cellules endothéliales en milieu endothélial à 5 millions de cellules par millilitre avec suffisamment de cellules pour ensemencer 500 000 cellules endothéliales par tranche. Placez les bains de semis autoclavés dans des boîtes de Petri de 100 millimètres et transférez soigneusement les échafaudages de rinçage à l’envers dans les bains de semis. Faites tourbillonner doucement la suspension cellulaire préparée pour mélanger.Ensuite, pipetez soigneusement 100 microlitres de cellules directement sur chaque tissu à la base des puits, en prenant soin de ne pas endommager le tissu avec la pointe de la pipette. Transférer les tissus ensemencés dans l’incubateur de culture cellulaire. 24 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales, ajouter 900 microlitres de milieu de culture préchauffé à chaque puits à l’aide d’une pipette manuelle, puis remettre la plaque à l’incubateur.Après 24 heures d’ensemencement cellulaire, retirez le milieu et remplacez le millilitre de milieu endothélial frais par puits. 72 heures après l’ensemencement des cellules endothéliales, comptez les cellules AEC2 ou épithéliales alvéolaires de type II, et les fibroblastes à l’aide d’un hémocytomètre et préparez une suspension cellulaire 1:1 dans un milieu de croissance AEC2 à 5 millions de cellules par millilitre. Pipettez bien le milieu de chaque bain d’ensemencement et faites tourbillonner doucement la suspension cellulaire préparée.Pipette 100 microlitres de cellules directement sur chaque tissu à la base du puits. Transférer les tissus ensemencés dans l’incubateur de culture cellulaire. Après deux heures, ajoutez 900 microlitres de milieu de croissance AEC2 préchauffé à chaque puits, puis retournez la plaque à l’incubateur.Après 24 heures de culture avec des AEC2 et des fibroblastes, préparer une plaque de 12 puits avec un millilitre de milieu de croissance AEC2 préchauffé par puits, par cassette. Pipette 800 microlitres de milieu de chaque puits du bain d’ensemencement, puis retirez les cassettes du bain d’ensemencement et transférez-les du côté droit vers la plaque préparée de 12 puits, une cassette par puits. Changez soigneusement le milieu de culture à l’aide d’une pipette Pasteur en verre tous les deux jours pendant la durée de culture souhaitée.Surveillez le degré de repeuplement des tissus par microscopie à contraste de phase à un grossissement de 5X pendant toute la durée de la culture. La coloration H et E des échafaudages tissulaires a montré une architecture alvéolaire préservée après décellularisation sans noyaux cellulaires visibles. Le tissu alvéolaire a été observé lorsque des échafaudages de matrice extracellulaire décellularisés ont été vus à un grossissement de 5X par microscopie à contraste de phase.De grandes voies respiratoires et des navires ramifiés étaient également visibles dans certaines tranches. Le septième jour de la culture, la microscopie à contraste de phase a montré que le modèle de recellularisation dans les tissus pulmonaires modifiés émulait la structure alvéolaire des tissus en cas de repeuplement réussi. Une mauvaise recellularisation était également visible.La coloration H et E le septième ou le huitième jour a montré un repeuplement des septa alvéolaires. L’immunofluorescence debout a révélé des fibroblastes pro-collagène de type I alpha 1 positifs, des AEC2 ABCA3 positifs, des cellules endothéliales CD31 positives et des AEC2 positifs SPB abondants. De plus, le test de thymidine a montré de nombreuses proliférations d’AEC2.Cette technique a facilité le développement de stratégies pour l’ingénierie des tissus pulmonaires et a permis des recherches dans les files d’attente soutenant la prolifération et la différenciation des cellules de type II au sein de l’alvéole.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Procédure pour l&#39;ingénierie du poumon

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Recherche

Bio-ingénierie

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Un système expérimental pour étudier mécanotransduction dans les cellules des poumons du foetus

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

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Construction des Défini humaines Engineered cardiaques Tissues pour étudier les mécanismes de la thérapie cellulaire cardiaque

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Un tissu combiné 3D Conçu<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor modèle de prévision de l&#39;efficacité des médicaments dans le Fond mutationnelles spécifiques

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

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Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Cathéter de lumière à tir latéral intra-cardiaque pour la surveillance du métabolisme cellulaire à l'aide de la spectroscopie d'absorption transmurale des cœurs de mammifères perfusés

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Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Préparation de tissus cardiaques en forme de maille dérivés de cellules iPS humaines pour la réparation myocardique in vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Tests précliniques de médicaments dans des tissus musculaires 3D évolutifs

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissection et isolement de tissu pulmonaire décellularisé spécifique à une région

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...