Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
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Die Autoren danken Lorenzo Sewanan und Jorge Nunez für ihre Arbeit bei der Entwicklung des in diesem Protokoll verwendeten Gewebekulturkassettendesigns, dem Kaminski-Labor für die Verwendung ihres Vibratoms, Maurizio Chioccioli und Jessica Nouws für die Unterstützung beim Lungenschneiden, Allie LaRocco für die Unterstützung bei ersten Pilotexperimenten und Hong Qian für das sorgfältige Lesen des Protokolls. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse F30HL143880 (K.L.L.), das Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) und U01HL145567 (L.E.N.) unterstützt; und durch ein uneingeschränktes Forschungsgeschenk von Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. ist Gründer und Aktionär von Humacyte, Inc., einem Unternehmen für regenerative Medizin. Humacyte produziert künstliche Blutgefäße aus allogenen glatten Muskelzellen für die Gefäßchirurgie. Der Ehepartner von L.E.N. ist an Humacyte beteiligt, und L.E.N. ist Mitglied des Board of Directors von Humacyte. L.E.N. ist eine Erfinderin von Patenten, die an Humacyte lizenziert sind und Lizenzgebühren für L.E.N. L.E.N. erhalten haben, um die Forschung in ihrem Labor in Yale zu unterstützen. Humacyte hatte keinen Einfluss auf das Verhalten, die Beschreibung oder die Interpretation der Ergebnisse in diesem Bericht.

Dieses Papier beschreibt die Verwendung von dezellularisierten, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten als Plattform zur Erzeugung von künstlich hergestelltem Lungengewebe in vitro, das alveolarähnliche Strukturen mit mehreren Linien enthält. Durch die Kombination von Strategien, die wir zuvor entwickelt haben, um hochgenaue azelluläre ECM-Lungengerüste für das gesamte Lungen-Engineering22,31 mit unserem robusten System zur Kultivierung von kleinräumigem Herzgewebe 30 neu zu besiedeln, ermöglicht dieses Protokoll die Verwendung von physiologisch relevanter Lungen-ECM als Gewebekultursubstrat in einer wiederholbaren und moderaten Durchsatzweise.
Die hier vorgestellten Methoden beschreiben die ELT-Gerüstvorbereitung aus Rattenlungen, die leicht erreichbar sind, en bloc mit direktem Zugang zu intakten Atemwegen für Agaroseinflation extrahiert werden können und größer sind als die Mauslunge. Innerhalb dieses Systems kann jedoch jedes Lungengewebe verwendet werden, das mit Agarose aufgeblasen werden kann und Scheiben von mindestens 9 mm Länge ergibt. Unabhängig von der Gewebequelle ist eine gleichmäßige Aufblasung des Lungengewebes mit Agarose der kritischste Schritt, um den Erfolg des nachgeschalteten Gewebeschneidens, Clippings und Gewebehandlings sicherzustellen. Unteraufgeblasenes Lungengewebe neigt dazu, nicht sauber zu schneiden, während überblasenes Gewebe während des Clippings reißen kann. Nach der Agarosegelierung sind entsprechend aufgeblasene Geweberegionen fest, geben aber ein wenig nach, wenn sie sanft mit einer Pinzette gedrückt werden. Für intakte Rattenlungen fanden wir heraus, dass das mehrmalige Voraufblasen der extrahierten Lungen mit Luft, gefolgt von einer Agaroseinflation so bald wie möglich nach der Extraktion, zu den besten Schneideergebnissen und der besten Qualität der resultierenden Gewebegerüste führt. Die entsprechende Menge an Agarose muss empirisch optimiert werden; für eine Rattenlunge beträgt das Volumen, das benötigt wird, um die Lunge zur Gesamtlungenkapazität aufzublasen, etwa 30 ml/kg Tiermasse (z. B. 10,5 ml Agarose für Lungen von einer 350 g Ratte). Bei größeren resezierten Lungengeweben mit weniger einfachem Zugang zu den Atemwegen (z. B. von menschlichen Spendern) kann eine zusätzliche Fehlerbehebung erforderlich sein, um das Gewebe über einen Bronchus32 aufzublasen. Während des anschließenden Lungenschneidens ist die Auswahl und Orientierung des Gewebes auf dem Kolben ein weiterer wichtiger Schritt, um 1) sicherzustellen, dass die Scheiben groß genug sind, um Gewebestreifen zu erzeugen, die in Gewebekulturkassetten geschnitten werden können, und 2) die parenchymale (alveolar) Gewebefläche zu maximieren, mit Ausnahme großer Atemwege oder Gefäße.
Das Einschneiden des PCLS in Gewebekulturkassetten kann zunächst ein schwieriger Schritt sein, aber die Kassetten vereinfachen die Gewebehandhabung während der Dezellularisierung und Aussaat erheblich. Zwei mögliche Probleme, die auftreten können, sind das Reißen von Gewebe (entweder während des Clippings oder während der Dezellularisierung) oder die Gewebepositionierung in den Clips, die zu einer schlechten nachgeschalteten Aussaat führt (z. B. keine Aussaat oder Aussaat nur an den Enden). Ein Reißen kann das Ergebnis einer Überinflation von Agarose, einer Überdehnung des Gewebes während des Einführens der Lasche oder eines zu geringen Überhangs sein, um beim Einsetzen der Laschen einen ausreichenden Gewebegriff zu gewährleisten. Beachten Sie, dass Scheiben, die an einem Clip-Ende reißen, erfolgreich gesät werden können, jedoch sind sie während der Kultur unter dem Mikroskop schwer zu visualisieren, da das Gewebe nicht flach ist. Eine schlechte Gewebeaussaat (wie in Abbildung 6C) ist wahrscheinlich das Ergebnis davon, dass die Scheibe nicht flach zwischen den beiden Clips liegt und somit einen schlechten Kontakt mit der Basis des Aussaatbades hat, wenn sie auf den Kopf gestellt wird. Eine weitere mögliche Ursache ist das unsachgemäße Sitzen der Kassette im Boden des Aussaatbadbrunnens. Wenden Sie in Bezug auf das Clipping etwas mehr Spannung in das Gewebe an, wenn Sie den zweiten Clip platzieren, damit er flach liegt. Einige Scheiben haben eine leichte Konkavität; In diesen Fällen schneiden Sie die Scheibe mit der konvexen Seite nach oben ab. Mit der Praxis erleben wir in der Regel eine fehlgeschlagene Aussaat mit weniger als 2% der Scheiben.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Anforderung einiger Spezialgeräte - ein Laserschneider und ein 3D-Drucker -, um die Ausgangsmaterialien für die ELT-Vorbereitung zu generieren. Sobald jedoch die Gewebekulturkassetten und Aussaatbäder erstellt sind, sind keine zusätzlichen Spezialmaterialien erforderlich. Die Lungenschneide- und Dezellularisierungsschritte der ELT-Gerüstvorbereitung sind mäßig zeitaufwendig; Diese Schritte können jedoch im Voraus oder in ausreichender Anzahl durchgeführt werden, um mehrere Experimente gleichzeitig vorzubereiten. Viele PCLS (>100 bei Optimierung für Parenchymregionen) können aus einer einzigen Lunge geschnitten und für den späteren Gebrauch eingefroren werden. Während ein einzelner Frost-Tau-Zyklus geringfügige ultrastrukturelle Schäden am ECM46 verursachen kann, hat sich gezeigt, dass selbst mehrere Frost-Tau-Zyklen keinen signifikanten Verlust in ECM 23,47 verursachen. PCLS kann auch vor einem Experiment abgeschnitten und dezellularisiert werden, um innerhalb eines Monats verwendet zu werden. (Insbesondere kann das beschriebene Dezellularisierungsprotokoll in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, was einen erheblichen Vorteil gegenüber zuvor beschriebenen Methoden darstellt, die einen Tag oder mehr erfordern27,28.) Sobald die Gerüste vorbereitet sind, ist der Zellaussaatprozess einfach und schnell, und die Kultur von ELTs erfordert keine speziellen Techniken.
Ein Vorbehalt der beschriebenen ELT-Methode ist das Fehlen einer regionsspezifischen Aussaat, d. h. der Abgabe von AEC2s spezifisch an den Alveolarraum oder Endothelzellen spezifisch an den Gefäßraum. Obwohl Zellen einfach auf den Gewebegerüsten gesät werden, ist das Muster der Rezellularisierung nicht zufällig, mit einem Anschein einer alveolarähnlichen Organisation, einschließlich Epithelringen. Wir vermuten, dass Zell-Zell-Interaktionen sowie lokale Unterschiede in der ECM-Zusammensetzung und -Geometrie20,21 wahrscheinlich zu den beobachteten Rezellularisierungsmustern beitragen. Zur Unterstützung dieser Hypothese zeigte eine zuvor veröffentlichte Studie, in der Fibroblasten unspezifisch auf dezellularisierte Lungenschnitte ausgesät wurden, dass das Muster der Geweberepopulation und der assoziierten zellulären Phänotypen signifikant nach mikroskopischer Geweberegion und ECM-Gerüstquelle (z. B. gesund versus krank) variierte27. Es wurde auch beobachtet, dass Fibroblasten in das Interstitium eindringen - den Ort, an dem sie sich im nativen Lungengewebe befinden 1,27. Die primäre alternative Methode, die wir uns vorstellen können, um Zellen auf Lungenschnitten in einer wirklich regionsspezifischen Weise zu kultivieren, würde darin bestehen, intakte dezellularisierte Lungen über die Atemwege31,48 und Gefäßkompartimente 49,50 zu säen und dann das rezellularisierte Gewebe zu schneiden. Diese Alternative 1) ist jedoch deutlich kosten-, zeit- und ressourcenintensiver; 2) ist ein geringerer Durchsatz; 3) erfordert eine erhöhte Anzahl von Tieren; und 4) ist mit einem erhöhten Kontaminationsrisiko aufgrund der Herausforderungen der gesamten Lungenkultur und des anschließenden Schneidens der ausgesäten Lunge verbunden. Die ELT-Plattform rekapituliert zwar nicht alle Aspekte der nativen zellulären Organisation, ermöglicht jedoch die Lungenzellkultur auf einem physiologisch relevanten ECM-Substrat auf eine Weise, die für viele weitere Labore zugänglich ist.
Die Flexibilität des ELT-Systems ist ein großer Vorteil dieser Plattform und sollte eine kleinräumige Lungengewebekultur mit einer beliebigen Anzahl von Gewebegerüsten, Zellen oder Kulturmedien von Interesse ermöglichen. Die Verwendung von Gerüsten, die aus erkranktem Gewebe oder aus Verletzungsmodellen gewonnen werden, kann die Untersuchung von Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Interaktionen unter Berücksichtigung der krankheitsveränderten ECM27,29,51 ermöglichen. Beachten Sie jedoch, dass das Dezellularisierungsprotokoll möglicherweise angepasst werden muss, um Matrixunterschiede zwischen Spezies52 zu berücksichtigen. Die beschriebene Seeding-Strategie kann für jeden Zelltyp verwendet werden, und die Kulturzeitleiste kann an die Bedürfnisse des Forschers angepasst werden. Als Ausgangspunkt sollten 1 x 106 Zellen pro Gerüst innerhalb von 7 Tagen nach der Kultur ein hochzelliges Gewebe ergeben, während 1 x 105 Gesamtzellen zu einer schlechten Zellularität führen. Bei jeder Anpassung des Zeitrahmens sollten die Gewebekulturkassetten 24 h nach der letzten Gewebeaussaat aus dem Aussaatbad entfernt werden. Mit dem Ziel, einen Teil der zellulären Komplexität des Lungenalveolus zu modellieren, beschreiben wir hier eine Trikultur-Rezellularisierungsstrategie, die die Aufrechterhaltung gut differenzierter neonataler AEC2s in alveolarähnlichen Strukturen für mindestens 7 Tage unterstützt. Unsere Ergebnisse zeigen auch die erfolgreiche Transplantation von Fibroblasten und Endothelzellen innerhalb von ELTs, was die breite Anwendbarkeit des Kultursubstrats und seine Eignung für Co-Kulturstudien unterstreicht. Die Aussaat adulter Zellen in ELTs kann die Modellierung ruhigerer alveolarer Strukturen erleichtern, während die Aussaat humaner PSC-abgeleiteter AEC2s, einschließlich solcher mit genetischen Modifikationen, translationale Studien der menschlichen Krankheiterleichtern könnte 13,53. Im Allgemeinen bietet der Bottom-up-Ansatz, der durch die ELT-Plattform ermöglicht wird, die Beiträge bestimmter Zelltypen zu Auslesungen von Interesse zu untersuchen - wie z.B. AEC2-Proliferation oder Differenzierungszustand.
Zusammenfassend skizziert dieses Protokoll ein robustes System zur Erzeugung von künstlichem Lungengewebe für Co-Kulturstudien von AEC2s, Fibroblasten und Endothelzellen in azellulären ECM-Lungenschnittgerüsten. ELTs stellen eine neuartige 3D-Kulturstrategie für primäre AEC2s dar, die sich bisher typischerweise auf weniger physiologische Gel-Matrizen stützten, um einen gut differenzierten Phänotyp 6,11,12 aufrechtzuerhalten. Die aktuelle Plattform baut auf früheren Arbeiten zur Wiederbesiedlung von dezellularisierten Lungenschnitten 24,25,26,27,28,29 auf, bietet aber mehrere Vorteile: 1) ein Gewebekultur-Kassettensystem, um die ELT-Handhabung während der Dezellularisierung, Aussaat und Kultur zu erleichtern; 2) ein maßgeschneidertes Aussaatbad, um eine bekannte Anzahl von Zellen auf jedem Scheibengerüst präzise zu säen; und 3) eine Tri-Kultur-Reseeding-Strategie, die eine Wiederbesiedlung von Alveolargewebe mit Epithel-, mesenchymalen und Endothelzellen ermöglicht. Somit stellen ELTs einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Erstellung reproduzierbarer In-vitro-Modelle dar, die die Zell- und Substratkomplexität der nativen Alveole und der AEC2-Stammzellnische erfassen.

Alveolen sind die funktionellen Einheiten der distalen Lunge, die ein Geflecht aus gasaustauschenden Lufträumen umfassen, die von alveolären Epithelzellen (AEC1s) und Typ-2-Zellen (AEC2s) ausgekleidet sind. Dem Epithel liegt ein dichtes Netzwerk von Kapillaren sowie Stützmesenchym zugrunde, die alle durch ein extrazelluläres Matrixgerüst (ECM) gestützt werden, das diesen empfindlichen Luftsäcken sowohl Stärke als auch Flexibilität verleiht1. Die Alveolen sind auch der Ort der Verletzung bei zahlreichen Lungenerkrankungen, einschließlich idiopathischer Lungenfibrose2, akutem Atemnotsyndrom3 und schwerer Coronavirus-Krankheit-19 (COVID-19)4. Obwohl die Arbeit in den letzten zehn Jahren eine bemerkenswerte Plastizität im Lungenepithel aufgedeckt hat, bleiben die Mechanismen, die in einigen Situationen eine distale Lungenreparatur ermöglichen - und die eine Reparatur in anderen ausschließen - ein Bereich intensiver Untersuchungen5. Die Entwicklung verbesserter In-vitro-Plattformen zur Modellierung des Alveolus würde Studien der alveolären Biologie, Regeneration und Therapeutika erleichtern.
AEC2s erneuern sich selbst und differenzieren sich zu AEC1s und gelten somit als primäre Stammzelle der distalen Lunge 6,7,8. Diese Zellen stellen jedoch eine besondere Herausforderung für die In-vitro-Studie dar, da es schwierig ist, primäre AEC2s ohne Verlust des Phänotyps9 zu kultivieren. In konventioneller 2-dimensionaler (2D) Kultur flachen AEC2s ab und übernehmen einige Merkmale von AEC1-ähnlichen Zellen10. Im Gegensatz dazu unterstützen 3D-Kulturstrategien, am häufigsten Organoide, die Aufrechterhaltung differenzierter Merkmale in primären AEC2s 6,11,12 und ermöglichen die langfristige Kultur von pluripotenten Stammzellen (PSC)-abgeleiteten AEC2s13,14. Organoide wurden verwendet, um die distale Lungenentwicklung 15, die Virusinfektion 11,15 und die AEC2-bedingte genetische Erkrankung13,16,17 zu modellieren, was wichtige Einblicke in die Biologie und Regeneration von AEC2 ermöglicht. Diese Kulturmodelle umfassen jedoch typischerweise nur ein oder zwei zelluläre Linien und betten die Zellen in gelartige Matrizen ein, die weder die Architektur noch das ECM-Substrat der nativen Lungenalveole rekapitulieren.
Das ECM ist ein kritischer Regulator des Zellphänotyps und des Verhaltens über molekulare, topologische und mechanische Hinweise; umfasst eine Schlüsselkomponente gewebespezifischer Nischen, die das Stammzellschicksal regeln; und dient als Reservoir, das die Verfügbarkeit von lokal sezernierten Wachstumsfaktoren 18,19,20,21 moduliert. Die Kultivierung von Zellen auf nativem ECM kann somit die Vorhersagefähigkeit von In-vitro-Systemen erhöhen, die Biologie von In-vivo-Geweben zu modellieren. Dezellularisierung, ein Prozess, bei dem Zellmaterial durch Reinigungsmittel, Enzyme oder physikalische oder andere Methoden aus Geweben entfernt wird, kann bei sorgfältiger Durchführung zu einem großen Teil das EZM-Gerüst eines nativen Organs erhalten22,23. Solche Gerüste können mit Zellen für die biomimetische 3D-Kultur wieder bevölkert werden. Während dezellularisierte Gerüste jedoch häufig für Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet werden, war ihre Verwendung für die routinemäßige Zellkultur begrenzt. Mehrere frühere Studien haben über die Dezellularisierung und Rezellularisierung von Lungenschnitten oder kleinen Lungengewebesegmenten berichtet. Zusätzlich zu den Proof-of-Concept-Studien 24,25,26 wurden wiederbesiedelte Lungenschnitte verwendet, um die Fibroblasten-Matrix-Adhäsion 27,28 zu untersuchen und die Wirkung erkrankter Lungenmatrizen auf den Fibroblasten-Phänotyp27,29 zu untersuchen. Mit verbesserten Technologien zur Erzeugung von präzisionsgeschnittenen Gewebeschnitten könnten dezellularisierte Lungenschnitte eine bequeme und kleinräumige Plattform bieten, mit der Zellen kultiviert werden können, während Alveolar-, Atemwegs- und Gefäßsubstrukturen erhalten bleiben. Die Einbeziehung mehrerer Zelltypen würde Studien von Zell-Zell-Interaktionen innerhalb einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung ermöglichen. Es sind jedoch verbesserte Strategien erforderlich, um die Handhabung von Geweben während des gesamten Kulturprozesses zu erleichtern und eine kontrollierte und reproduzierbare Aussaat von Geweben mit bekannter Anzahl von Zellen sicherzustellen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von künstlich hergestelltem Lungengewebe (ELTs) vor, indem dezellularisierte präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (PCLS) mit primären Endothelzellen, AEC2s und Fibroblasten neu besiedelt werden. In einer Adaption unseres zuvor beschriebenen technischen Herzgewebesystems 30 und der Dezellularisierungs-Recellularisierungsstrategien der ganzen Lunge 22,31 beschreiben wir Verfahren zum Schneiden von PCLS aus der Lunge von Ratten und zum Schneidender Scheiben in wiederverwendbare Gewebekulturkassetten, die nachgelagerte Manipulationen vereinfachen und standardisieren. Beschnittene Scheiben werden dezellularisiert, um azelluläre EZM-Gerüste zu bilden, die in maßgeschneiderten Aussaatbädern wieder bevölkert werden. Lungenschnittgerüste bewahren kritische ECM-Komponenten und -Architektur und unterstützen das Wachstum von AEC2s in multi-lineage alveolar-ähnlichen Strukturen für mindestens 7 Tage. ELTs stellen ein neuartiges alveoläres Kokultursystem innerhalb einer physiologisch relevanten 3D-Matrix dar, das die Entwicklung von Lungengewebe-Engineering-Strategien unterstützen und gleichzeitig grundlegende biologische Studien von AEC2s und der Alveole erleichtern soll.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Es besteht ein Bedarf an verbesserten 3-dimensionalen (3D) Lungenmodellen, die die architektonische und zelluläre Komplexität des nativen Lungenalveolus ex vivo rekapitulieren. Kürzlich entwickelte Organoidmodelle haben die Expansion und Untersuchung von Lungenepithelvorläufern in vitro erleichtert, aber diese Plattformen basieren typischerweise auf Maustumor-abgeleiteter Matrix und / oder Serum und umfassen nur ein oder zwei zelluläre Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von technisch hergestelltem Lungengewebe (ELTs), das auf der Multi-Lineage-Rezellularisierung von dezellularisierten, präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (PCLS) basiert. ELTs enthalten alveolarähnliche Strukturen, bestehend aus Alveolarepithel, Mesenchym und Endothel, in einem extrazellulären Matrixsubstrat (ECM), das dem der nativen Lunge sehr ähnlich ist. Um das Gewebe zu erzeugen, werden die Lunge der Ratten mit Agarose aufgeblasen, in 450 μm dicke Scheiben geschnitten, in Streifen geschnitten und entzelluliert. Die resultierenden azellulären EZM-Gerüste werden dann mit primären Endothelzellen, Fibroblasten und alveolären Epithel-Typ-2-Zellen (AEC2s) neu gesät. AEC2s können in ELT-Kultur für mindestens 7 Tage mit einem serumfreien, chemisch definierten Wachstumsmedium gehalten werden. Während des gesamten Gewebevorbereitungs- und Kulturprozesses werden die Scheiben in ein Kassettensystem geschnitten, das die Handhabung und standardisierte Zellaussaat mehrerer ELTs parallel ermöglicht. Diese ELTs stellen eine organotypische Kulturplattform dar, die die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen innerhalb der Alveole sowie von biochemischen Signalen, die AEC2s und ihre Nische regulieren, erleichtern soll.

Ein Überblick über den Prozess zur Generierung von ELTs - einschließlich Lungenschnitt, Slice-Clipping und Dezellularisierung sowie Gerüst-Repopulation - ist in Abbildung 3 dargestellt. Die hier vorgestellten ELTs wurden unter Verwendung von primären mikrovaskulären Endothelzellen der Rattenlunge (siehe Materialtabelle), neonatalen Ratten-AEC2s und Lipofibroblasten-angereicherten neonatalen Rattenlungenfibroblasten36 kultiviert. AEC2s wurden frisch isoliert durch magnetische Perlensortierung, wie zuvor beschrieben 37; Alternative Isolationsprotokolle wurden detailliert beschrieben und an anderer Stellediskutiert 38,39,40. Die Reinheit isolierter Ratten-AEC2s kann mittels Durchflusszytometrie für den rattenspezifischen AEC2-Oberflächenmarker RTII-7041 oder durch Färbung einer zytozentrifugierten Zellprobe für RTII-70 oder Pro-Tensidprotein C (pSPC) beurteilt werden. Rattenlungenfibroblasten wurden von postnatalen Tag 7-9 Rattenwelpen gemäß einer Anpassung eines veröffentlichten Protokolls42 isoliert und in Passage 1-2 verwendet; Alternative Isolationsprotokolle wurden an anderer Stellebeschrieben 43,44. Die Reinheit isolierter Fibroblasten kann durch Färbung von kultivierten oder zytozentrifugierten Zellen für den mesenchymalen Marker Vimentin beurteilt werden, und die Lipofibroblastenanreicherung kann durch Färbung für Oil Red O45 beurteilt werden.
Wenn das Lungengewebe gleichmäßig mit Agarose aufgeblasen ist und Gewebestücke strategisch ausgewählt und für das Schneiden ausgerichtet sind, um die Gesamt- und Parenchymgewebefläche zu maximieren, kann eine Rattenlunge Gewebe für >100 alveoläre ELTs ergeben. PCLS-Streifen weisen eine ausreichende mechanische Integrität auf, um in Gewebekassetten mit wenigen (<5 %) Rissen (Abbildung 3B) eingeklemmt zu werden.
Das Protokoll zur Dezellularisierung von Lungenschnitten basiert eng auf unserem zuvor veröffentlichten Dezellularisierungsprotokoll für die ganze Lunge, von dem durch quantitative Proteomik gezeigt wurde, dass es viele ECM-Komponenten auf einem Niveau bewahrt, das sich nicht signifikant von denen in der nativen Lunge22 unterscheidet. Dezellularisierte Schichtgerüste bewahren die native Architektur der Alveolen, wie sie durch Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung (Abbildung 4A, B) und durch Phasenkontrastmikroskopie (Abbildung 4C) betrachtet wird. Wir schließen typischerweise Gerüste aus, die große Atemwege oder Gefäße (Abbildung 4D) oder Risse enthalten, obwohl erstere einbezogen werden können, wenn sie für den Forscher von Interesse sind. Die Dezellularisierung führt zu einer 96%igen Reduktion des DNA-Gehalts an Gewebe, gemessen durch einen Assay für doppelsträngige DNA (siehe Materialtabelle; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs. 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg in nativem vs. dezellularisiertem Gewebe, je ± REM) (Abbildung 5A), wobei keine DNA durch Hämatoxylinfärbung sichtbar ist (Abbildung 4B). Die histologische und immunfluoreszierende Färbung von dezellularisierten Gerüsten zeigt die Erhaltung der EZM-Proteine Kollagen, Elastin, Kollagen IV und Laminin mit einer ähnlichen Architektur und Menge wie in nativen Lungenschnitten (Abbildung 5B-E). Beachten Sie, dass die Kerne des nativen Gewebes blau / schwarz mit Trichom (für Kollagen) und EVG (für Elastin) Flecken färben. Die Immunfluoreszenzfärbung wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Standardmethoden zur Färbung von Gewebendurchgeführt 37. Die verwendeten Antikörper und ihre jeweiligen Konzentrationen sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Eine erfolgreiche Gerüst-Repopulation führt nach 7 Tagen zu hochzelligen ELTs mit einem alveolarartigen Repopulationsmuster, das durch Lichtmikroskopie sichtbar ist (Abbildung 6A-C). In einigen Fällen können bei sehr hoher Zellularität organoidartige Strukturen sichtbar sein (Abbildung 6A,B). Eine erfolglose Gewebeaussaat kann durch Phasenkontrastmikroskopie während der Kultur sichtbar gemacht werden (Abbildung 6C). Nach der Kultivierung von Gewebegerüsten mit AEC2s, Fibroblasten und Endothelzellen werden ELTs dicht mit alveolarähnlichen Strukturen wiederbesiedelt, die alle drei Zelllinien umfassen (Abbildung 6D, E). An Tag 7 oder 8 behalten AEC2s die quaderförmige Morphologie bei und exprimieren Tensidprotein-B (SPB) und das lamellare Körperprotein ABCA3, ohne dass eine signifikante Differenzierung zu AEC1s nachgewiesen wird (Abbildung 6E, F). AEC2s sind in ELTs sehr proliferativ, wie der Einbau von 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU) nach einem 2-h-Puls bei 10 μM zeigt (Abbildung 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Perfusionssystems für die Lungenextraktion und -reinigung. (A) Das Perfusionssystem besteht aus einer schwerkraftgetriebenen Gliedmaße, die für die anfängliche Kanülierung der Lungenarterie unter Strömung verwendet wird; und ein pumpengetriebenes Glied, das verwendet wird, um die Lunge nach der ersten Kanülierung effizient zu reinigen. Die Pumpenleitung enthält einen "Impulsdämpfer", der die von der Pumpe verursachten Druckspitzen dämpft. Das Design der trachealen und pulmonalen arteriellen Kanülen ist links detailliert. SNP = Natriumnitroprussid. (B) Einzelheiten der Montage des Impulsdämpfers. BPT und Silikon beziehen sich auf Schlauchtypen. (C) Positionen der trachealen und pulmonalen arteriellen Kanülen, die während der Lungenextraktion platziert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Abbildung 2: Kulturzeitachse für die Tri-Lineage-Rezellularisierung. Vorgeschlagener Zeitplan für die Tri-Lineage-ELT-Aussaat und -Kultur, einschließlich des Zeitpunkts der zweiphasigen Aussaat. Zellnummern für Seeding und Kulturmedium für jede Phase werden angegeben. Details zu Kulturmedien finden Sie in Tabelle 3. AEC2 = alveoläre Epithel-Typ-2-Zelle. EC = Endothelzelle. FB = Fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Abbildung 3: Schematische Darstellung der technischen Vorbereitung von Lungengewebe. (A) Natives Lungengewebe wird mit einem Vibratom in Scheiben geschnitten. (B) Präzisionsgeschnittene Lungenscheiben werden in standardisierte 3 mm breite Streifen geschnitten, in Gewebekulturkassetten aus Polytetrafluorethylen (PTFE) geclippt und dezellularisiert, um azelluläre extrazelluläre Matrixgerüste zu erhalten. (C) Gerüste werden in spezialisierten Aussaatbädern, die den Aussaatbereich auf den Bereich des Gewebes beschränken, neu ausgesät und dann in einer Standard-Brunnenplatte kultiviert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Abbildung 4: Struktur der dezellularisierten Lungengerüste. H & E-Färbung von nativen (A) und dezellularisierten (B) Lungenschnitten, die die Erhaltung der alveolären Architektur nach der Dezellularisierung zeigen. (C,D) Beispiele für dezellularisierte ECM-Gerüste, die bei 5-facher Vergrößerung durch Phasenkontrastmikroskopie betrachtet werden, die überwiegend alveoläres Gewebe (C) umfassen oder große verzweigte Atemwege und Gefäße (D, schwarze und rote Pfeilspitzen) enthalten. Maßstabsstäbe, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Abbildung 5: DNA-Entfernung und Matrixkonservierung in dezellularisierten Lungengerüsten. (A) Quantifizierung der DNA in nativen und dezellularisierten Lungenschnitten (Mittelwert ± REM, n = 5). Welch's t test, **P < 0,01. Decell = dezellularisiert. (B,C) Histologische Färbung von nativen und dezellularisierten Lungenschnitten auf Kollagen (B) und Elastin (C). Pfeilspitzen, Elastin konserviert in alveolären Eingangsringen von dezellularisiertem Gewebe. (D,E) Immunfluoreszierende Färbung von nativen und dezellularisierten Lungenschnitten für Kollagen IV (D) und Laminin (E). Maßstabsstäbe, 50 μm. In allen Bedienfeldern umreißen gepunktete Kästchen den Bildbereich, der im jeweiligen Panel nach rechts vergrößert wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Abbildung 6: Zelluläre Repopulation von künstlich hergestelltem Lungengewebe. (A-C) Beispiele für rezellularisierte ELTs am Tag 7 der Kultur, wie sie während der Kultur durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert wurden. Das Rezellularisationsmuster spiegelt die alveoläre Struktur des Gewebes wider. In einigen Bereichen mit hoher Zellularität können sich organoidartige Strukturen bilden (Pfeilspitzen). (A) und (B) eine erfolgreiche Zellrepopulation darstellen, während (C) nach 7 Tagen Kultur ein schlechtes Maß an Rezellularisierung darstellt. (D-G) Färbung von rezellularisierten ELTs am 7. oder 8. Tag der Kultur. (D) H & E-Färbung, die eine zelluläre Repopulation der Alveolarsepten zeigt. (E) Immunfluoreszierende Färbemarkungen aufgepfropfte proCollagenIα1+ Fibroblasten, ABCA3+ AEC2s und CD31+ Endothelzellen. (F) Gewebe enthalten reichlich SPB+ AEC2, aber nur wenige RTI-40 (Podoplanin) + AEC1 unter diesen Bedingungen. (G) Viele AEC2 vermehren sich in ELTs, gemessen an der EdU-Integration. Maßstabsstäbe, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Tabelle 1: Dezellularisierungslösungen. Vorbereitungsdetails für Dezellularisierungslösungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Dezellularisierungsprotokoll Details des Protokolls zur Dezellularisierung von Lungenschnitten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 3: Kulturmedien. Vorbereitungsdetails für Endothel- und AEC2-Wachstumsmedien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 4: Antikörper, die zur Immunfärbung verwendet werden. Details zu Antikörpern und deren Konzentrationen, die zur Immunfärbung verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Zusatzakte 1: Design für das Laserschneiden von Gewebekulturkassettenrahmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsakte 2: Design für das Laserschneiden von Tissue-Kultur-Kassettenclips. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsakte 3: Design für das Laserschneiden von Gewebekulturkassetten-Tabs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzakte 4: CAD-Datei für die Aussaat von Badformbasis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Zusatzdossier 5: CAD-Datei zur Aussaat Badformring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung reproduzierbarer, kleinräumiger künstlicher Lungengewebe, indem dezellularisierte, präzisionsgeschnittene Lungenschnitte mit alveolären Epithel-Typ-2-Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen neu besiedelt werden.

Technisches Lungengewebe aus dezellularisierten Lungenscheiben

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Dieses Protokoll ermöglicht die wiederholbare Verwendung der intakten extrazellulären Lungenmatrix als dreidimensionales Gewebekultursubstrat und moderaten Durchsatz. Der Hauptvorteil des technischen Lungengewebesystems ist die Flexibilität der Plattform. ELTs können angepasst werden, um verschiedene Gewebegerüste, Zellen oder Kulturmedien von Interesse zu verwenden.Sobald die Lunge extrahiert ist, füllen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit Agarose und HBSS ohne Phenolrot. Blähen Sie die Lunge mit ca. 10 Millilitern Luft über die Luftröhrenkanüle auf und injizieren Sie dann sofort die vorbereitete Agarose über die Luftröhrenkanüle, bis die distalen Spitzen der Lungenlappen aufgeblasen sind. Verschließen Sie die Luftröhre, indem Sie die weiße Kappe eines Vier-Wege-Absperrhahns an der weiblichen Luer-Sperre der Trachealkanüle befestigen.Die Lunge in eine 150 Millimeter große Petrischale auf Eis legen, damit sich die Agarose verfestigen kann. Bereiten Sie die Lungenscheiben gemäß dem Protokoll im Manuskript vor und füllen Sie dann eine 100-Millimeter-Petrischale mit 1/3 Volumen PBS. Übertragen Sie Kassetten und Tabs mit einer Pinzette auf die Schüssel.Wenn die Scheiben gefroren sind, tauen Sie ein Gericht nach dem anderen auf, indem Sie PBS bei Raumtemperatur gießen. Anschließend eine aufgetaute Scheibe in eine 150-Millimeter-Petrischale geben. Entfalten Sie die Scheibe vorsichtig mit einer feinen Pinzette oder einer Hämostat und saugen Sie vorsichtig überschüssiges PBS aus dem Gewebe ab.Schneiden Sie dann einen drei Millimeter breiten, mindestens neun Millimeter langen Streifen aus der Scheibe, indem Sie die gesamte Länge einer Rasierklinge fest gegen die Schale drücken und sie leicht von einer Seite zur anderen schaukeln. Um den Gewebestreifen in die Kassette zu klemmen, schweben Sie ihn über die Kassette und zentrieren Sie ihn vorsichtig, um über die Löcher in den Clips an beiden Enden hinauszugehen. Platzieren Sie eine Lasche teilweise in das Loch an einem Ende mit einer feinen Pinzette, richten Sie das Gewebe vorsichtig auf und setzen Sie die zweite Lasche ein.Verwenden Sie schließlich eine Pinzette, um jede Lasche vollständig zu drücken, um das Gewebe zu sichern. Nachdem Sie alle Seiten beschnitten haben, geben Sie die 100-Millimeter-Schale mit den Kassetten auf eine laminare Haube. Übertragen Sie Kassetten auf Platten mit sechs Vertiefungen, die die erste Dezellularisierungslösung enthalten, indem Sie einen gekrümmten Hämostat verwenden, um die gekerbten Seiten zu greifen.Legen Sie dann die Sechs-Well-Platte bei 30 U / min für 10 Minuten auf einen Orbitalschüttler. Saugen Sie die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung ab und ersetzen Sie sie dann durch drei Milliliter der zweiten Dezellularisierungslösung pro Welle. Legen Sie die Platte bei 30 U / min auf einen Orbitalschüttler und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jeder Lösung, wie im Dezellularisierungsprotokoll im Manuskript beschrieben. Nach der letzten Spülung mit PBS das Gewebe auf sterile Six-Well-Platten mit frischem PBS mit Antibiotika und Antimykotika übertragen und 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Sterilisation mit Antibiotika und Antimykotika können Lungengewebegerüste sofort ausgesät oder bei vier Grad Celsius bis zu 30 Tage gelagert werden.Inkubieren Sie vor der Verwendung für die Kultur Gerüste, die bei vier Grad Celsius gelagert werden, mit frischem PBS und Antibiotika und Antimykotika über Nacht bei 37 Grad Celsius als zusätzlichen Sterilisationsschritt. Dann spülen Sie die Gerüste mit sterilem PBS, fünf Milliliter pro Well, dreimal, für jeweils fünf Minuten. Untersuchen Sie Gerüste unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 5-facher Vergrößerung, um Gewebe für die Aussaat auszuwählen.Bereiten Sie die Endothelzellsuspension in Endothelmedium bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter mit ausreichend Zellen vor, um 500.000 Endothelzellen pro Scheibe zu säen. Stellen Sie autoklavierte Aussaatbäder in 100-Millimeter-Petrischalen und geben Sie die Spülgerüste vorsichtig kopfüber in die Aussaatbäder. Schwenken Sie vorsichtig die vorbereitete Zellsuspension zum Mischen.Dann pipettieren Sie vorsichtig 100 Mikroliter Zellen direkt auf jedes Gewebe an der Basis der Vertiefungen und achten Sie darauf, das Gewebe nicht mit der Pipettenspitze zu beschädigen. Übertragen Sie das ausgesäte Gewebe in den Zellkultur-Inkubator. Geben Sie 24 Stunden nach der Aussaat der Endothelzellen 900 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium mit einer manuellen Pipette in jede Vertiefung und bringen Sie die Platte dann in den Inkubator zurück.Entfernen Sie nach 24 Stunden Zellaussaat das Medium und ersetzen Sie den einen Milliliter frisches Endothelmedium pro Well. 72 Stunden nach der Aussaat der Endothelzellen zählen Sie AEC2s oder alveoläre Epithel-Typ-II-Zellen und Fibroblasten mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine 1: 1-Zellsuspension in AEC2-Wachstumsmedium bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter vor. Das Medium aus jedem Aussaatbad gut pipettieren und die vorbereitete Zellsuspension vorsichtig schwenken.Pipettieren Sie 100 Mikroliter Zellen direkt auf jedes Gewebe an der Basis des Brunnens. Übertragen Sie das ausgesäte Gewebe in den Zellkultur-Inkubator. Fügen Sie nach zwei Stunden 900 Mikroliter vorgewärmtes AEC2-Wachstumsmedium zu jeder Vertiefung hinzu und bringen Sie die Platte dann in den Inkubator zurück.Nach 24 Stunden Kultur mit AEC2s und Fibroblasten bereiten Sie eine 12-Well-Platte mit einem Milliliter vorgewärmtem AEC2-Wachstumsmedium pro Well, pro Kassette vor. Pipettieren Sie 800 Mikroliter Medium aus jedem Brunnen des Aussaatbades, entfernen Sie dann die Kassetten aus dem Aussaatbad und geben Sie sie mit der rechten Seite auf die vorbereitete 12-Well-Platte, eine Kassette pro Well. Wechseln Sie das Kulturmedium sorgfältig mit einer Pasteur-Pipette aus Glas jeden zweiten Tag für die gewünschte Kulturdauer.Überwachen Sie den Grad der Geweberepopulation mittels Phasenkontrastmikroskopie bei 5-facher Vergrößerung während der gesamten Kulturdauer. Die H- und E-Färbung von Gewebegerüsten zeigte nach der Dezellularisierung eine konservierte alveoläre Architektur ohne sichtbare Zellkerne. Alveolargewebe wurde beobachtet, als dezellularisierte extrazelluläre Matrixgerüste bei 5-facher Vergrößerung durch Phasenkontrastmikroskopie betrachtet wurden.Große verzweigte Atemwege und Gefäße waren auch in einigen Scheiben sichtbar. Am siebten Tag der Kultur zeigte die Phasenkontrastmikroskopie, dass das Muster der Rezellularisierung in künstlich hergestellten Lungengeweben die alveoläre Struktur des Gewebes bei erfolgreicher Repopulation nachahmte. Eine schlechte Rezellularisierung war ebenfalls sichtbar.H- und E-Färbungen am siebten oder achten Tag zeigten eine Wiederbesiedlung der Alveolarsepten. Die stehende Immunfluoreszenz zeigte Pro-Kollagen Typ I alpha 1-positive Fibroblasten, ABCA3-positive AEC2s, CD31-positive Endothelzellen und reichlich vorhandene SPB-positive AEC2s. Darüber hinaus zeigte der Thymidin-Assay viele proliferierende AEC2s.Diese Technik hat die Entwicklung von Strategien für das Lungengewebe-Engineering erleichtert und Untersuchungen von Warteschlangen ermöglicht, die die Proliferation und Differenzierung von Typ-II-Zellen innerhalb der Alveole unterstützen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Vorgehensweise für Lung Technik

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Forschung

Biotechnik

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ein experimentelles System, um Mechanotransduktion in fetalen Lunge Zellen zu untersuchen

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bau von Defined Menschen Engineered Herzgewebe zur Untersuchung Mechanismen der Herzzelltherapie

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intrakardialer Side-Firing Light Katheter zur Überwachung des Zellstoffwechsels mit transmuraaler Absorptionsspektroskopie von perfundierten Säugetierherzen

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissektion und Isolierung von regionenspezifisch dezellularisiertem Lungengewebe

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...