Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

המחברים רוצים להודות ללורנצו סובאנן וחורחה נונז על עבודתם בפיתוח תכנון קלטת תרביות הרקמה המשמשות בפרוטוקול זה, למעבדת קמינסקי לשימוש בוויברטומה שלהם, למאוריציו צ'יוצ'יולי וג'סיקה נואוס על הסיוע בחיתוך ריאות, לאלי לרוקו על הסיוע בניסויי פיילוט ראשוניים, ולהונג צ'יאן על קריאה מדוקדקת של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH F30HL143880 (K.L.L.), מענק ההכשרה של תוכנית ההכשרה למדענים רפואיים T32GM136651 (K.L.L.), ו- U01HL145567 (L.E.N.); ועל ידי מתנת מחקר בלתי מוגבלת של Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. הוא מייסד ובעל מניות בחברת Humacyte, Inc, שהיא חברה לרפואה רגנרטיבית. Humacyte מייצרת כלי דם מהונדסים מתאי שריר חלקים אלוגניים לניתוחי כלי דם. לבן זוגה של L.E.N. יש הון עצמי בהומסייט, ול.א.נ. מכהנת בדירקטוריון של הומאצ'יטה. L.E.N. היא ממציאה על פטנטים בעלי רישיון להומסייט ומייצרים תמלוגים עבור L.E.N. L.E.N. קיבלה מתנת מחקר בלתי מוגבלת לתמיכה במחקר במעבדה שלה בייל. הומאצ'יטה לא השפיע על ההתנהלות, התיאור או הפרשנות של הממצאים בדו"ח זה.

מאמר זה מתאר את השימוש בפרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת כפלטפורמה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות במבחנה, המכילות מבנים דמויי אלוואולר רב-שושלתיים. על ידי שילוב אסטרטגיות שפיתחנו בעבר כדי לאכלס מחדש פיגומי ריאה ECM תאיים בנאמנות גבוהה עבור הנדסת ריאות שלמה22,31, עם המערכת החזקה שלנו לעיבוד מחדש של רקמות לב מהונדסות בקנה מידה קטן30, פרוטוקול זה מאפשר שימוש ב- ECM של ריאה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית כמצע תרבית רקמה, באופן הניתן לחזרה ותפוקה בינונית.
השיטות המוצגות כאן מפרטות את הכנת פיגומי ELT מריאות חולדה, הניתנות להשגה בקלות, ניתן לחלץ אותן בגוש עם גישה ישירה לדרכי אוויר שלמות לצורך אינפלציית אגרוז, והן בגודל גדול יותר מריאת עכבר. עם זאת, כל רקמת ריאה שניתן לנפח עם אגרוז ולהניב פרוסות באורך של לפחות 9 מ"מ עשויה לשמש במערכת זו. ללא קשר למקור הרקמה, אינפלציה אחידה של רקמת הריאה עם אגרוז היא הצעד הקריטי ביותר להבטחת ההצלחה של חיתוך, גזירה וטיפול ברקמות במורד הזרם. רקמת ריאה מנופחת בתת-זווית נוטה שלא להיפרס בצורה נקייה, בעוד שרקמה מנופחת יתר על המידה עלולה להיקרע במהלך החיתוך. לאחר ג'לציה של אגרוז, אזורי רקמות מנופחים כראוי הם מוצקים אך מספקים מעט לתת כאשר לוחצים בעדינות עם מלקחיים. עבור ריאות חולדה שלמות, מצאנו כי ניפוח מראש של הריאות המופקות עם אוויר מספר פעמים, ואחריו אינפלציית אגרוז בהקדם האפשרי לאחר המיצוי, מביא לתוצאות החיתוך הטובות ביותר ולאיכות הטובה ביותר של פיגומי הרקמות המתקבלים. הנפח המתאים של אגרוז צריך להיות מותאם אמפירית; עבור ריאה של חולדה, הנפח הנדרש כדי לנפח את הריאה לקיבולת הריאות הכוללת הוא כ-30 מ"ל/ק"ג מסת בעלי חיים (למשל, 10.5 מ"ל אגרוז לריאות מחולדה של 350 גרם). עבור רקמות ריאה גדולות יותר שנכרתו עם גישה פחות פשוטה לדרכי הנשימה (כגון אלה של תורמים אנושיים), ייתכן שיהיה צורך בפתרון בעיות נוסף כדי לנפח את הרקמה באמצעות ברונכוס32. במהלך חיתוך הריאה שלאחר מכן, הבחירה והכיוון של הרקמה על הבוכנה היא צעד חשוב נוסף 1) להבטיח כי הפרוסות גדולות מספיק כדי ליצור רצועות רקמה שניתן לחתוך לתוך קלטות תרבית רקמה 2) למקסם את שטח הרקמה parenchymal (alveolar), למעט דרכי הנשימה הגדולות או כלי הדם.
חיתוך ה- PCLS לקלטות תרבית רקמה יכול להיות צעד מאתגר בתחילה, אך הקלטות מפשטות מאוד את הטיפול ברקמות במהלך דה-תאיזציה וזריעה. שתי בעיות פוטנציאליות שעלולות להתעורר הן קריעת רקמות (במהלך תהליך החיתוך, או במהלך הדה-תאיזציה), או מיקום רקמות בקליפסים שגורם לזריעה לקויה במורד הזרם (למשל, ללא זריעה, או זריעה רק בקצוות). קריעה עשויה להיות תוצאה של אינפלציית יתר של אגרוז, מתיחת יתר של הרקמה במהלך החדרת לשונית, או השארת מעט מדי תקרה כדי לספק אחיזת רקמה מספקת בעת החדרת הכרטיסיות. שימו לב שפרוסות שנקרעות בקצה קליפ אחד עשויות להיזרק בהצלחה, אולם קשה לדמיין אותן מתחת למיקרוסקופ במהלך התרבית מכיוון שהרקמה אינה שטוחה. זריעת רקמות לקויה (כמו זו שבאיור 6C) היא ככל הנראה תוצאה של העובדה שהפרוסה לא שכבה שטוחה בין שני הקליפים, ובכך יוצרת מגע לקוי עם בסיס אמבט הזריעה היטב כשהיא הפוכה. סיבה אפשרית נוספת היא ישיבה לא נכונה של הקלטת בתחתית אמבט הזריעה היטב. מבחינת גזירה, יש למרוח מעט יותר מתח ברקמה בעת הנחת הקליפ השני כדי לעזור לו לשכב שטוח. לחלק מהפרוסות יש קעורה קלה; במקרים אלה חותכים את הפרוסה עם הצד הקמור למעלה. עם התרגול, אנו בדרך כלל חווים זריעה כושלת עם פחות מ-2% מהפרוסות.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא הדרישה עבור כמה ציוד מיוחד - חותך לייזר ומדפסת 3D - כדי ליצור את החומרים הראשוניים להכנת ELT. עם זאת, לאחר שנוצרות קלטות תרביות הרקמה ואמבטיות הזריעה, אין צורך בחומרים מיוחדים נוספים. שלבי החיתוך והדה-תאיזציה של הריאות בהכנת פיגומי ELT גוזלים זמן רב במידה בינונית; עם זאת, צעדים אלה עשויים להתבצע מראש, או במספרים המספיקים כדי להתכונן לניסויים מרובים בו זמנית. PCLS רבים (>100 אם מייעלים אותם לאזורים פרנכימליים) ניתנים לחתוך מריאה אחת ולהקפיא אותם לשימוש מאוחר יותר. בעוד שמחזור הפשרה יחיד של הקפאה עלול לגרום לנזק אולטרה-סטרוקטורלי קל ל-ECM46, אפילו מחזורי הפשרה מרובים של הקפאה הוכחו כלא גורמים לאובדן משמעותי ב-ECM 23,47. ניתן גם לחתוך PCLS ולטהר אותו לפני ניסוי, לשימוש תוך חודש. (יש לציין כי ניתן לבצע את פרוטוקול הדה-תאיזציה המתואר תוך כ-6 שעות, מה שמייצג יתרון משמעותי על פני שיטות שתוארו קודם לכן הדורשות יום או יותרשל 27,28.) לאחר הכנת הפיגומים, תהליך זריעת התאים הוא פשוט ומהיר, ותרבית ה- ELTs אינה דורשת טכניקות מיוחדות.
אזהרה של שיטת ELT המתוארת היא היעדר זריעה ספציפית לאזור, כלומר מסירה של AEC2s במיוחד לחלל הנאדי, או תאי אנדותל במיוחד למרחב כלי הדם. אף על פי כן, אף על פי שהתאים פשוט נזרעים על גבי פיגומי הרקמה, תבנית ההסתגלות מחדש אינה אקראית, עם מראית עין מסוימת של ארגון דמוי נאדיות, כולל טבעות אפיתל. אנו חושדים כי אינטראקציות בין תאים לתאים, כמו גם הבדלים מקומיים בהרכב ה-ECM ובגאומטריה 20,21,ככל הנראה תורמים לדפוסי הרית-התא שנצפו. כדי לתמוך בהשערה זו, מחקר שפורסם בעבר, שבו פיברובלסטים נזרעו באופן לא ספציפי על פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה, הראה כי הדפוס של ריפוד מחדש של רקמות ופנוטיפים תאיים נלווים השתנו באופן משמעותי לפי אזור רקמה מיקרוסקופית ומקור פיגום ECM (למשל, בריא לעומת חולה)27. פיברובלסטים נצפו גם פולשים לתוך האינטרסטיציום - המיקום שבו הם שוכנים ברקמת ריאה מקומית 1,27. השיטה החלופית העיקרית שאנו יכולים לדמיין כדי לתרבת תאים על פרוסות ריאה באופן ספציפי באמת לאזור, תהיה כרוכה בזריעת ריאות נטולות תאים שלמים דרך דרכי הנשימה31,48 ותאי כלי הדם49,50, ולאחר מכן חיתוך הרקמה התאית מחדש. עם זאת, חלופה זו 1) היא הרבה יותר עלות, זמן ומשאבים עתירי משאבים; 2) הוא תפוקה נמוכה יותר; 3) דורש מספר גדל והולך של בעלי חיים; ו-4) קשורה לסיכון מוגבר לזיהום עקב האתגרים של תרבית ריאות שלמה וחיתוך של הריאה הזורעת לאחר מכן. למרות שאינה מסכמת את כל ההיבטים של ארגון תאי מקומי, פלטפורמת ELT מאפשרת תרבית תאי ריאה על מצע ECM רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, באופן נגיש למעבדות רבות נוספות.
הגמישות של מערכת ELT היא יתרון גדול של פלטפורמה זו, ואמורה לאפשר תרבית רקמת ריאה בקנה מידה קטן עם כל מספר של פיגומי רקמות, תאים או מדיה תרבית מעניינת. השימוש בפיגומים שמקורם ברקמה חולה או ממודלים של פציעה עשוי לאפשר מחקר של אינטראקציות בין תאים לתאים או למטריצות תאים בסביבה של ECM 27,29,51 ששונה ממחלה. עם זאת, שים לב שייתכן שיהיה צורך להתאים את פרוטוקול הדה-תאיזציה כדי להסביר את הבדלי המטריצה בין מינים52. אסטרטגיית הזריעה המתוארת יכולה לשמש לכל סוג תא, וציר הזמן של התרבית מותאם כך שיתאים לצרכי החוקר. כנקודת מוצא, 1 x 106 תאים לכל פיגום אמורים להניב רקמה תאית גבוהה תוך 7 ימים מהתרבית, בעוד ש-1 x 105 תאים בסך הכל גורמים לתאים ירודים. בכל התאמה של ציר הזמן, יש להסיר את קלטות תרביות הרקמה מאמבט הזריעה 24 שעות לאחר זריעת הרקמה האחרונה. כאן, במטרה לדגום חלק מהמורכבות התאית של נאדיות הריאה, אנו מתארים אסטרטגיית רה-תאיזציה תלת-תרבית התומכת בתחזוקה של AEC2 יילודים מובחנים היטב במבנים דמויי נאדיות למשך 7 ימים לפחות. התוצאות שלנו גם מדגימות את ההשתלה המוצלחת של פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך ELTs, תוך שימת דגש על הישימות הרחבה של מצע התרבית והתאמתו למחקרי תרביות משותפות. זריעת תאים בוגרים ב-ELTs עשויה להקל על המידול של מבנים נאדיים שקטים יותר, בעוד שזריעה של תאי AEC2 שמקורם ב-PSC אנושי, כולל אלה עם שינויים גנטיים, עשויה להקל על מחקרים תרגומיים של מחלות אנושיות13,53. באופן כללי, הגישה מלמטה למעלה המאפשרת פלטפורמת ELT מציגה את ההזדמנות לחקור את התרומות של סוגי תאים מסוימים לקריאות מעניינות - כגון התפשטות AEC2 או מצב התמיינות.
לסיכום, פרוטוקול זה מתווה מערכת חזקה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות למחקרי תרבית משותפת של AEC2s, פיברובלסטים ותאי אנדותל בתוך פיגומי פרוסות ריאה ECM תאיים. ELTs מייצגים אסטרטגיית תרבות תלת-ממדית חדשנית עבור AEC2s ראשוניים, שעד כה הסתמכו בדרך כלל על מטריצות פחות פיזיולוגיות מסוג ג'ל כדי לשמור על פנוטיפ מובחן היטב 6,11,12. הפלטפורמה הנוכחית מתבססת על עבודות קודמות בתחום הריאה המחודשת של פרוסות 24,25,25,26,27,28,29, אך מציעה מספר יתרונות: 1) מערכת קלטות תרבית רקמה כדי להקל על טיפול ב-ELT במהלך דה-תאיזציה, זריעה ותרבית; 2) אמבט זריעה מותאם אישית כדי לזרוע במדויק מספר ידוע של תאים על כל פיגום פרוסה; ו-3) אסטרטגיית זריעה מחדש תלת-תרבית המאפשרת ריכון מחדש של רקמת הנאדיות עם תאי אפיתל, מזנכימל ואנדותל. לפיכך, ELTs מייצגים צעד חשוב קדימה לקראת יצירת מודלים ניתנים לשחזור במבחנה הלוכדים את המורכבות התאית והמצעית של הנאדיות המקומית ונישת תאי הגזע AEC2.

נאדיות הן היחידות התפקודיות של הריאה הדיסטלית, המורכבות מעבודת רשת של מרחבי אוויר מחליפי גזים המרופדים בתאי אפיתל מסוג 1 (AEC1s) ותאים מסוג 2 (AEC2s). בבסיס האפיתל עומדת רשת צפופה של נימים, כמו גם מזנכים תומכים, כולם מחוזקים על ידי פיגום מטריצה חוץ-תאית (ECM) המספק הן חוזק והן גמישות לשקי האוויר העדינים האלה1. הנאדיות הן גם אתר הפגיעה בפתולוגיות ריאה רבות, כולל פיברוזיס ריאתי אידיופטי2, תסמונת מצוקה נשימתית חריפה3 ומחלת קורונה קשה -19 (COVID-19)4. למרות שהעבודה בעשור האחרון חשפה פלסטיות יוצאת דופן באפיתל הריאה, המנגנונים המאפשרים תיקון ריאה דיסטלי במסגרות מסוימות - ומונעים תיקון באחרות - נותרו תחום של חקירה אינטנסיבית5. פיתוח פלטפורמות משופרות במבחנה כדי לדגום את הנאדיות יקל על מחקרים על ביולוגיה של נאדיות, התחדשות וטיפולים.
AEC2s מחדשים את עצמם ומבדילים אותם ל-AEC1s, ולכן נחשבים לתאי הגזע העיקריים של הריאה הדיסטלית 6,7,8. עם זאת, תאים אלה מהווים אתגר מיוחד למחקר במבחנה בהתחשב בקשיים הקשורים לגידול AEC2 ראשוניים ללא אובדן של פנוטיפ9. בתרבית דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, AEC2s משטחים ומאמצים תכונות מסוימות של תאים דמויי AEC110. לעומת זאת, אסטרטגיות תרביות תלת-ממדיות, לרוב אורגנואידים, תומכות בשמירה על תכונות מובחנות ב-AEC2sראשוניים 6,11,12 ומאפשרות תרבית ארוכת טווח של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) שמקורם ב-AEC2s13,14. אורגנואידים שימשו למדל התפתחות ריאות דיסטלית15, זיהום ויראלי11,15, ומחלות גנטיות הקשורות ל-AEC2 13,16,17, מה שמאפשר תובנות חשובות על ביולוגיה והתחדשות של AEC2. עם זאת, מודלים אלה של תרביות כוללים בדרך כלל שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד, ומטביעים את התאים במטריצות מסוג ג'ל שאינן מצליחות לשחזר את הארכיטקטורה או את מצע ה-ECM של נאדיות הריאה הטבעית.
ה-ECM הוא מווסת קריטי של פנוטיפ והתנהגות התא באמצעות רמזים מולקולריים, טופולוגיים ומכניים; מהווה מרכיב מרכזי בגומחות ספציפיות לרקמות המווסתות את גורל תאי הגזע; ומשמש כמאגר המווסת את הזמינות של גורמי גדילה המופרשים באופן מקומי 18,19,20,21. לפיכך, גידול תאים ב-ECM מקומי עשוי להגביר את יכולת הניבוי של מערכות in vitro כדי למדל את הביולוגיה של רקמות in vivo. דה-תאיזציה, תהליך המסיר חומר תאי מרקמות באמצעות דטרגנטים, אנזימים או שיטות פיזיות או אחרות, יכול לשמר במידה רבה את פיגומי ה-ECM של איבר מקומי, כאשר הם מבוצעים בקפידה22,23. ניתן לאכלס מחדש פיגומים כאלה בתאים לתרבית ביומימטית תלת-ממדית. עם זאת, בעוד שפיגומים שעברו דה-תאיזציה נמצאים בשימוש נרחב ליישומים של הנדסת רקמות, השימוש בהם לתרבית תאים שגרתית היה מוגבל. מספר מחקרים קודמים דיווחו על דה-תאיזציה ורה-סלולריזציה של פרוסות ריאה או מקטעי רקמת ריאה קטנים. בנוסף למחקרי הוכחת היתכנות 24,25,26, נעשה שימוש בפרוסות ריאה מאוכלסות מחדש כדי לחקור הידבקות של מטריצת פיברובלסט27,28 ולחקור את ההשפעה של מטריצות ריאה חולות על פנוטיפ פיברובלסט27,29. עם טכנולוגיות משופרות הזמינות ליצירת פרוסות רקמות חתוכות באופן מדויק, פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה יכולות להציע פלטפורמה נוחה וקטנה שבאמצעותה ניתן לתרבת תאים, תוך שמירה על תת-מבנים של נאדיות, דרכי הנשימה וכלי הדם. שילוב של סוגי תאים מרובים יאפשר לחקור אינטראקציות בין תאים לתאים בתוך סביבה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. עם זאת, יש צורך באסטרטגיות משופרות כדי להקל על הטיפול ברקמות לאורך כל תהליך התרבית, ולהבטיח זריעה מבוקרת וניתנת לשחזור של רקמות עם מספר ידוע של תאים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) על ידי ריפוד מחדש של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) עם תאי אנדותל ראשוניים, AEC2s ופיברובלסטים. בהסתגלות של מערכת רקמת הלב המהונדסת שלנושתוארה בעבר 30 ואסטרטגיות רה-תאיזציה של ריאות שלמות22,31, אנו מתארים פרוצדורות לחיתוך PCLS מריאות חולדות ולקיצוץ הפרוסות לקלטות תרביות רקמה רב-פעמיות המפשטות ומתוקנות מניפולציות במורד הזרם. פרוסות חתוכות עוברות דה-תאיזציה ליצירת פיגומי ECM תאיים, המאוכלסים מחדש באמבטיות זריעה מותאמות אישית. פיגומי פרוסות ריאה משמרים רכיבים וארכיטקטורה קריטיים של ECM, ותומכים בצמיחה של AEC2s בתוך מבנים דמויי נאדיות מרובי שושלת למשך 7 ימים לפחות. ELTs מייצגים מערכת חדשה של תרבית משותפת אלוואולרית בתוך מטריצה תלת-ממדית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית, שאמורה לתמוך בפיתוח אסטרטגיות של הנדסת רקמות ריאה, תוך הקלה על מחקרים ביולוגיים בסיסיים של AEC2s וה-alveolus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

יש צורך במודלים משופרים של ריאה תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמשחזרים את המורכבות האדריכלית והתאית של ה-alveolus ex vivo המקורי של הריאה. מודלים אורגנואידיים שפותחו לאחרונה אפשרו את ההרחבה והמחקר של אבות אפיתל הריאה במבחנה, אך פלטפורמות אלה מסתמכות בדרך כלל על מטריצה ו/או סרום שמקורם בגידולי עכברים, ומשלבות שושלות תאיות אחת או שתיים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת רקמות ריאה מהונדסות (ELTs) המבוסס על רסלאריזציה מרובת שושלת של פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שעברו דה-תאיזציה. ELTs מכילים מבנים דמויי נאדיות הכוללים אפיתל נאדי, מזנכים ואנדותל, בתוך מצע מטריצה חוץ-תאית (ECM) הדומה מאוד לזה של הריאה המקומית. כדי ליצור את הרקמות, ריאות החולדה מנופחות באגרוז, נחתכות לפרוסות בעובי 450 מיקרומטר, נחתכות לרצועות ועוברות דה-תאיזציה. פיגומי ה-ECM התאיים שנוצרים כתוצאה מכך נזרעים מחדש עם תאי אנדותל ראשוניים, פיברובלסטים ותאי אפיתל מסוג 2 (AEC2s). AEC2s יכולים להישמר בתרבית ELT למשך 7 ימים לפחות עם מדיום גדילה ללא סרום ומוגדר כימית. לאורך כל תהליך הכנת הרקמות והתרבית, הפרוסות נחתכות למערכת קלטות המאפשרת טיפול וזריעת תאים מתוקננת של מספר ELTs במקביל. ELTs אלה מייצגים פלטפורמת תרבית אורגנוטיפית שאמורה להקל על חקירות של אינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים בתוך הנאדיות, כמו גם אותות ביוכימיים המווסתים את AEC2s ואת הנישה שלהם.

סקירה כללית של התהליך ליצירת ELTs - הכוללת חיתוך ריאה, חיתוך פרוסות ודה-תאיזציה, ופילוג מחדש של פיגומים - מוצגת באיור 3. ה-ELTs שהוצגו כאן עברו תרבית באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים של ריאה של חולדה (ראו טבלת חומרים), AEC2 של חולדה ילודית, ופיברובלסטים של ריאה של חולדה מועשרת בליפופיברובלסט36. AEC2s בודדו זה עתה באמצעות מיון מבוסס חרוזים מגנטיים כפי שתואר קודם לכן37; פרוטוקולי בידוד חלופיים פורטו ונדונו במקום אחר 38,39,40. ניתן להעריך את טוהר ה-AEC2 של חולדה מבודדת באמצעות ציטומטריה של זרימה עבור סמן פני השטח AEC2 ספציפי לחולדה RTII-7041, או באמצעות צביעה של דגימת תאים ציטוצנטריפוגים עבור RTII-70 או חלבון פרו-פעילי שטח C (pSPC). פיברובלסטים של ריאות חולדה בודדו מגורים של חולדות לאחר הלידה 7-9 על פי התאמה של פרוטוקול42 שפורסם ושימשו במעבר 1-2; פרוטוקולי בידוד חלופיים תוארו במקומות אחרים43,44. ניתן להעריך את טוהר הפיברובלסטים המבודדים באמצעות צביעה של תאים בתרבית או ציטוסנטריפוגה עבור וימנטין סמן מזנכימלי, וניתן להעריך העשרת ליפופיברובלסט באמצעות צביעה עבור שמן אדום O45.
כאשר רקמת הריאה מנופחת באופן אחיד באגרוז, וחתיכות רקמה שנבחרו באופן אסטרטגי ומכוונות לחיתוך כדי למקסם את שטח הרקמה הכולל והפארנכימלי, ריאת חולדה אחת עשויה להניב רקמה עבור >100 ELTs נאדיים. רצועות של PCLS מפגינות שלמות מכנית מספקת כדי להיחתך לקלטות רקמות עם מעט (<5%) מקרים של קריעה (איור 3B).
הפרוטוקול לדה-תאיזציה של פרוסות ריאה מבוסס באופן הדוק על פרוטוקול הדה-תאיזציה של הריאה השלמה שלנו שפורסם בעבר, אשר על ידי פרוטאומיקה כמותית הודגם כמי שמשמר רכיבי ECM רבים ברמות שאינן שונות באופן משמעותי מאלו שבריאות מקומיות22. פיגומי פרוסות שעברו דה-תאיזציה משמרים את הארכיטקטורה הטבעית של הנאדיות, כפי שהיא נצפית על ידי צביעת המטוקסילין ואוזין (H&E) (איור 4A,B) ועל ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (איור 4C). בדרך כלל איננו כוללים פיגומים המכילים דרכי אוויר או כלי דם גדולים (איור 4D) או קרעים, אם כי ניתן לכלול את הראשונים אם הם מעניינים את החוקר. דה-תאיזציה מובילה לירידה של 96% בתכולת הדנ"א של הרקמה כפי שנמדדה על-ידי בדיקה של דנ"א דו-גדילי (ראו טבלת חומרים; 0.50 מיקרוגרם/מ"ג ± 0.073 מיקרוגרם/מ"ג לעומת 0.018 מיקרוגרם/מ"ג ± 0.0035 מיקרוגרם/מ"ג ברקמה מקומית לעומת נטולת תאים, בהתאמה, ממוצע ±-SEM) (איור 5A), ללא דנ"א הנראה לעין על-ידי צביעת המטוקסילין (איור 4B). צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנטית של פיגומים שעברו דה-תאיזציה חושפת תחזוקה של חלבוני ECM קולגן, אלסטין, קולגן IV ולמינין עם ארכיטקטורה וכמות דומה לזו שבפרוסות ריאה מקומיות (איור 5B-E). שימו לב שגרעיני הרקמות המקומיות מכתימים בכחול/שחור עם כתמי טריכום (לקולגן) ו-EVG (לאלסטין). צביעה אימונופלואורסצנטית בוצעה כפי שתואר קודם לכן, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות להכתמת רקמות37. הנוגדנים שבהם נעשה שימוש והריכוזים המתאימים להם מפורטים בטבלה 4.
ריקולציה מוצלחת של פיגומים מובילה ל-ELTs תאיים גבוהים לאחר 7 ימים, עם תבנית של אכלוס מחדש דמוית נאדיות הנראית על ידי מיקרוסקופיית אור (איור 6A-C). במקרים מסוימים, עם תאיות גבוהה מאוד, מבנים מסוג אורגנואידים עשויים להיות גלויים (איור 6A,B). ניתן לדמיין זריעת רקמות לא מוצלחת על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה במהלך תרבית (איור 6C). לאחר גידול פיגומי רקמות עם AEC2s, פיברובלסטים ותאי אנדותל, ELTs מאוכלסים מחדש בצפיפות במבנים דמויי נאדיות המרכיבים את כל שלוש שושלות התאים (איור 6D,E). ביום ה-7 או ה-8, AEC2s שומרים על מורפולוגיה קובידיאלית ומבטאים חלבון פעילי שטח-B (SPB) וחלבון גוף למלרי ABCA3, ללא עדות להבחנה משמעותית ל-AEC1s (איור 6E,F). AEC2s מתרבים מאוד ב-ELTs, כפי שהודגם על-ידי שילוב של 5-אתניל-2'-דאוקסיורידין (EdU) לאחר פולס של שעתיים ב-10 מיקרומטר (איור 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> איור 1: סכמטית של מערכת הזלוף לצורך מיצוי ריאה ופינוי. (A) מערכת הזלוף כוללת איבר מונע כבידה, המשמש לתצפית ראשונית של עורק הריאה תחת זרימה; וגפה מונעת משאבה, המשמשת לפינוי הריאות ביעילות לאחר תותח ראשוני. קו המשאבה כולל "משכך דופק" המרכך את הקוצים בלחץ הנגרם על ידי המשאבה. העיצוב של צינוריות קנה הנשימה והעורקים הריאתיים מפורט משמאל. SNP = נתרן ניטרופרוסיד. (B) פרטים על מכלול משכך הדופק. BPT וסיליקון מתייחסים לסוגי צינורות. (C) מיקומים של צינוריות עורקי קנה הנשימה והריאות הממוקמות במהלך מיצוי הריאות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> איור 2: ציר זמן של תרבית לרה-סלולריזציה של שלוש שושלתות. ציר זמן מוצע לזריעת ELT תלת-שושלתית ולתרבות, כולל תזמון של זריעה דו-שלבית. מספרי תאים עבור זריעה ואמצעי תרבית עבור כל שלב מסומנים. ראו פרטי מדיה תרבותית בטבלה 3. AEC2 = תא אפיתל מסוג 2. EC = תא אנדותל. FB = פיברובלסט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> איור 3: סכמטית של הכנת רקמת ריאה מהונדסת. (B) פרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק נחתכות לרצועות סטנדרטיות ברוחב 3 מ"מ, נחתכות לתוך קלטות תרביות-רקמה של פוליטטראפלואורתילן (PTFE), ודטרגנטים שעברו דה-תאיזציה כדי לייצר פיגומי מטריצה חוץ-תאית. (C) פיגומים נזרעים מחדש באמבטיות זריעה מיוחדות המגבילות את אזור הזריעה לאזור הרקמה, ולאחר מכן מתורבתים בצלחת באר סטנדרטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> איור 4: מבנה של פיגומי ריאות שעברו דה-תאיזציה. צביעת H&E של פרוסות ריאה מקומיות (A) ודה-תאיות (B) המראה שימור של ארכיטקטורת נאדיות לאחר דה-תאיזציה. (ג,ד) דוגמאות לפיגופי ECM שעברו דה-תאיזציה הנצפים בהגדלה של פי 5 על ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה, הכוללת בעיקר רקמה נאדית (C) או מכילה דרכי אוויר וכלי דם מסתעפים גדולים (ראשי חץ D, שחורים ואדומים). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר (A,B); 500 מיקרומטר (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> איור 5: הסרת דנ"א ושימור מטריצה בפיגומי ריאות שעברו דה-תאיזציה. (A) כימות דנ"א בפרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות (ממוצע ± SEM, n = 5). מבחן t של וולש, **P < 0.01. Decell = decellularized. (ב,ג) צביעה היסטולוגית של פרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות עבור קולגן (B) ואלסטין (C). ראשי חץ, אלסטין שהשתמר בטבעות כניסה אלוואולריות של רקמה נטולת תאים. (ד,ה) צביעה אימונופלואורסצנטית של פרוסות ריאה מקומיות ודה-תאיות עבור קולגן IV (D) ולמינין (E). מוטות קנה מידה, 50 מיקרומטר. בכל החלוניות, תיבות מנוקדים מתארות את אזור התמונה המוגדל מימין בכל פאנל בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> איור 6: אכלוס מחדש של התאים של רקמות ריאה מהונדסות. (א-ג) דוגמאות ל-ELTs שעברו רילוקולריזציה מחדש ביום ה-7 של התרבית, כפי שהומחשו במהלך התרבית על ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. תבנית הרית-התאים משקפת את המבנה הנאדי של הרקמה. באזורים מסוימים של תאיות גבוהה, מבנים דמויי אורגנואידים עשויים להיווצר (ראשי חץ). (A) ו-(B) מייצגים רימולציה מוצלחת של התאים, בעוד ש-(C) מייצג רמה ירודה של רה-תאיזציה לאחר 7 ימים של תרבית. (ד-ז) צביעה של ELTs שעברו רילוקולריזציה ביום 7 או 8 של התרבות. (D) צביעת H&E המציגה ריסוף תאי של הספטה הנאדית. (E) תוויות צביעה אימונופלואורסצנטיות חרוטות על פיברובלסטים proCollagenIα1+ , ABCA3+ AEC2s ותאי אנדותל CD31+ . (F) רקמות מכילות שפע של SPB+ AEC2s אך מעט RTI-40 (פודופלנין)+ AEC1s בתנאים אלה. (G) AEC2s רבים מתרבים ב-ELTs, כפי שנמדד על ידי שילוב EdU. מוטות קנה מידה, 500 מיקרומטר (A-C); 25 מיקרומטר (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
טבלה 1: פתרונות דה-סלולריזציה. פרטי הכנה לפתרונות דה-סלולריזציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: פרוטוקול דה-סלולריזציה. פרטי פרוטוקול לדה-תאיזציה של פרוסות ריאה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: מדיה תרבותית. פרטי הכנה למדיית צמיחה אנדותל ו-AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 4: נוגדנים המשמשים לשמירה חיסונית. פרטים על נוגדנים וריכוזיהם המשמשים לתכשיר חיסוני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: תכנון עבור מסגרות קלטות תרביות רקמה לחיתוך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: עיצוב עבור קליפסים של תרביות רקמה לחיתוך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: תכנון כרטיסיות קלטות תרבית רקמה לחיתוך לייזר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: קובץ CAD לזריעת בסיס עובש אמבטיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 5: קובץ CAD לזריעת טבעת עובש אמבטיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת רקמות ריאה מהונדסות בקנה מידה קטן הניתנות לשחזור, על-ידי אכלוס מחדש של פרוסות ריאה שעברו דה-תאיזציה מדויקת עם תאי אפיתל מסוג 2, פיברובלסטים ותאי אנדותל.

רקמות ריאה מהונדסות שהוכנו מפרוסות ריאה נטולות תאים

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

פרוטוקול זה מאפשר שימוש חוזר במטריצה חוץ-תאית של ריאות שלמות כמצע תרבית רקמה תלת-ממדי ותפוקה מתונה. היתרון העיקרי של מערכת רקמת הריאה המהונדסת הוא הגמישות של הפלטפורמה. ניתן להתאים את ה-ELTs לשימוש בפיגומי רקמות שונים, בתאים או במדיה של תרביות מעניינות.לאחר חילוץ הריאות, מלאו מזרק של 10 מיליליטר באגרוז ו-HBSS ללא פנול אדום. לנפח את הריאות עם כ -10 מיליליטרים של אוויר דרך צינורית קנה הנשימה, ואז מיד להזריק את האגרוז המוכן דרך צינור קנה הנשימה עד שקצות הדיסטליים ביותר של אונות הריאה מנופחים. קחו את קנה הנשימה על ידי חיבור הכובע הלבן מסטופר בעל ארבעה כיוונים אל מנעול הלואר הנקבי של צינורית קנה הנשימה.מניחים את הריאה בצלחת פטרי באורך 150 מילימטרים על קרח כדי לאפשר לאגרוזה להתמצק. מכינים את פרוסות הריאה על פי הפרוטוקול בכתב היד, ואז ממלאים צלחת פטרי של 100 מילימטרים ב-1/3 נפח של PBS. מעבירים קלטות וכרטיסיות לצלחת באמצעות מלקחיים.אם הפרוסות קפואות, הפשיר מנה אחת בכל פעם על ידי מזיגה על PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו פרוסה מופשרת לצלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ. פתחו בעדינות את הפרוסה באמצעות מלקחיים עדינים או המוסטאט ושאפו בזהירות לעודפי PBS מרחבי הרקמה.לאחר מכן, חותכים מהפרוסה רצועה ברוחב שלושה מילימטרים, באורך של לפחות תשעה מילימטרים, על ידי לחיצה על מלוא אורכו של סכין גילוח בחוזקה כנגד המנה ומנענעים אותה קלות מצד לצד. כדי לחתוך את רצועת הרקמה לתוך הקלטת, הציפו אותה מעל הקלטת, ומרכזים אותה בזהירות כדי לעבור את החורים בקליפים משני הקצוות. מניחים לשונית חלקית לתוך החור בקצה אחד עם מלקחיים עדינים, מיישרים בעדינות את הרקמה ומגדירים את הלשונית השנייה.לבסוף, השתמש במלקחיים כדי ללחוץ על כל לשונית במלואה כדי לאבטח את הרקמה. לאחר חיתוך כל הדפנות, העבירו את המנה באורך 100 מילימטר המכילה את הקלטות למכסה גלימה למינרי. העבר קלטות ללוחות בעלי שש בארות המכילות את תמיסת הדה-סלאריזציה הראשונה באמצעות המוסטאט מעוקל כדי לתפוס את הצדדים החרוצים.לאחר מכן, הניחו את לוחית ששת הבארים על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך 10 דקות. שאפו את הנוזל מכל באר, ואז החליפו אותו בשלושה מיליליטרים של תמיסת הדה-תאיזציה השנייה לכל באר. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד ודוגרים במשך חמש דקות.חזור על תהליך זה עם כל פתרון כמתואר בפרוטוקול הדה-סלולריזציה בכתב היד. לאחר השטיפה הסופית עם PBS, מעבירים את הרקמות לצלחות סטריליות בעלות שש בארות המכילות PBS טרי עם אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר עיקור עם אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-מיקוטיות, ניתן לזרוע פיגומי רקמות ריאה באופן מיידי או לאחסן אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד 30 יום.לפני השימוש לתרבית, פיגומי הדגירה מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס עם PBS טרי ואנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כשלב עיקור נוסף. לאחר מכן, לשטוף פיגומים עם PBS סטרילי, חמישה מיליליטרים לכל באר, שלוש פעמים, במשך חמש דקות כל אחד. בחנו פיגומים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 כדי לבחור רקמות לזריעה.הכינו את תרחיף תאי האנדותל במדיום האנדותל ב-5 מיליון תאים למיליליטר עם מספיק תאים כדי לזרוע 500, 000 תאי אנדותל לפרוסה. מניחים אמבטיות זריעה אוטוקלאביות בכלי פטרי בקוטר 100 מ"מ ומעבירים בזהירות את פיגומי השטיפה במהופך לאמבטיות הזריעה. סובבו בעדינות את תרחיף התא המוכן כדי לערבב.לאחר מכן, בזהירות pipette 100 microliters של תאים ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבארות, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה עם קצה פיפטה. מעבירים את הרקמות הנזרעות לחממת תרביות התאים. 24 שעות לאחר זריעת תאי האנדותל, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של מדיום תרבית שחומם מראש לכל באר באמצעות פיפטה ידנית, ואז החזירו את הצלחת לחממה.לאחר 24 שעות של זריעת תאים, יש להסיר את המדיום ולהחליף את מיליליטר אחד של מדיום אנדותל טרי לכל באר. 72 שעות לאחר זריעת תאי האנדותל, ספרו תאי AEC2s, או אפיתל נאדיים מסוג II, ופיברובלסטים באמצעות המוציטומטר והכנו תרחיף של 1:1 בתאי AEC2 במדיום גדילה AEC2 ב-5 מיליון תאים למיליליטר. פיפטה את המדיום מכל אמבט זריעה היטב וסובבה בעדינות את מתלה התא המוכן.פיפט 100 מיקרוליטרים של תאים ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבאר. מעבירים את הרקמות הנזרעות לחממת תרביות התאים. לאחר שעתיים, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה AEC2 שחומם מראש לכל באר, ואז החזירו את הצלחת לחממה.לאחר 24 שעות של תרבית עם AEC2s ופיברובלסטים, הכינו צלחת של 12 בארות עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה AEC2 שחומם מראש לכל באר, לכל קלטת. פיפט 800 מיקרוליטרים של מדיום מכל באר של אמבט הזריעה, ואז מוציאים את הקסטות מאמבטיית הזריעה ומעבירים אותן בצד ימין עד לצלחת המוכנה של 12 בארות, קלטת אחת לכל באר. שנה את מדיום התרבות בזהירות באמצעות פיפטת פסטר זכוכית כל יומיים למשך התרבות הרצויה.עקוב אחר מידת אכלוס מחדש של רקמות באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 לאורך כל משך התרבית. צביעת H ו-E של פיגומי רקמות הראתה ארכיטקטורה של נאדיות שהשתמרה לאחר דה-סלאריזציה ללא גרעיני תאים נראים לעין. רקמת אלוואולר נצפתה כאשר פיגומי מטריצה חוץ-תאיים שעברו דה-תאיזציה נצפו בהגדלה של פי 5 על ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה.נתיבי אוויר וכלי דם מסתעפים גדולים נראו גם בחלק מהפרוסות. ביום השביעי של התרבית, מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה הראתה כי דפוס הרלולריזציה ברקמות ריאה מהונדסות חיקה את מבנה הרקמות במקרים של ריפולציה מוצלחת. גם רה-סלולרזציה לקויה נראתה לעין.צביעת H ו-E ביום השביעי או השמונה הראתה אכלוס מחדש של הספטה הנאדית. עמידה אימונופלואורסצנטית גילתה פיברובלסטים חיוביים מסוג פרו-קולגן מסוג I אלפא 1, AEC2 חיוביים ל-ABCA3, תאי אנדותל חיוביים ל-CD31, AEC2s חיוביים ל-SPB בשפע. יתר על כן, בדיקת התימידין הראתה הרבה AEC2 מתרבים.טכניקה זו הקלה על פיתוח אסטרטגיות להנדסת רקמות ריאה ואפשרה לחקור תורים התומכים בהתפשטות תאים מסוג II ובהבחנה בתוך הנאדיות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

מערכת ניסיונית ללמוד Mechanotransduction ב לתאי ריאה עוברית

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

בדיקות פרה-קליניות של תרופות ברקמות שריר מהונדסות תלת-ממדיות ניתנות להרחבה

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

דיסקציה ובידוד של רקמת ריאה דה-צלולרית ספציפית לאזור

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...