Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
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저자들은 로렌조 세와난과 호르헤 누네즈가 이 프로토콜에 사용된 조직 배양 카세트 디자인을 개발하고, 비브라토메를 사용하기 위한 카민스키 실험실, 폐 슬라이싱에 도움을 준 마우리치오 치오키올리와 제시카 누스, 초기 파일럿 실험에 도움을 준 앨리 라로코, 프로토콜을 주의 깊게 읽은 홍키안에게 감사를 표하고 싶다. 이 연구는 NIH 보조금 F30HL143880 (K.L.L.), 의료 과학자 교육 프로그램 교육 보조금 T32GM136651 (K.L.L.), U01HL145567 (L.E.N.)에 의해 지원되었습니다. Humacyte Inc. (L.E.N.)의 무제한 연구 선물에 의해.

L.E.N.은 재생 의학 회사인 Humacyte, Inc.의 설립자이자 주주입니다. Humacyte는 혈관 수술을 위해 동종 평활근 세포로부터 조작 된 혈관을 생산합니다. L.E.N.의 배우자는 Humacyte에 대한 지분을 가지고 있으며, L.E.N.은 Humacyte의 이사회에서 활동하고 있습니다. L.E.N.은 Humacyte에 허가되고 L.E.N. L.E.N.에 대한 로열티를 생산하는 특허에 대한 발명가로서 예일의 실험실에서 연구를 지원하기 위해 무제한 연구 선물을 받았습니다. Humacyte는이 보고서의 발견에 대한 행동, 설명 또는 해석에 영향을 미치지 않았습니다.

이 논문은 다계보 폐포와 같은 구조를 포함하는 시험관 내에서 조작 된 폐 조직을 생성하기위한 플랫폼으로 탈세포화 된 정밀 절단 폐 슬라이스의 사용을 설명합니다. 전체 폐 공학22,31을 위해 고충실도 무세포 ECM 폐 스캐폴드를 재채우기 위해 이전에 개발한 전략과 소규모 엔지니어링 심장 조직(30)을 배양하기 위한 강력한 시스템을 결합함으로써, 이 프로토콜은 반복 가능하고 중간 처리량 방식으로 생리학적으로 관련된 폐 ECM을 조직 배양 기질로 사용할 수 있게 합니다.
여기에 제시된 방법은 쉽게 얻을 수 있는 래트 폐로부터의 ELT 스캐폴드 제제를 상세히 설명하며, 아가로스 인플레이션을 위한 온전한 기도에 직접 접근하여 엔블록 으로 추출될 수 있으며, 마우스 폐보다 크기가 더 크다. 그러나, 아가로오스로 팽창될 수 있고 적어도 9mm 길이의 슬라이스를 수득할 수 있는 임의의 폐 조직이 이 시스템 내에서 사용될 수 있다. 조직 공급원에 관계없이, 아가로스를 사용한 폐 조직의 균일한 팽창은 하류 조직 슬라이싱, 클리핑 및 조직 처리의 성공을 보장하기 위한 가장 중요한 단계입니다. 과소 팽창 된 폐 조직은 깨끗하게 슬라이스되지 않는 경향이 있으며, 지나치게 팽창 된 조직은 클리핑 중에 찢어질 수 있습니다. 아가로스 겔화 후, 적절하게 팽창된 조직 영역은 단단하지만 포셉으로 부드럽게 눌렀을 때 약간의 부여를 제공한다. 손상되지 않은 쥐 폐의 경우, 우리는 추출 된 폐를 공기로 여러 번 미리 팽창시킨 다음 추출 후 가능한 한 빨리 아가로스 인플레이션을 일으켜 최상의 슬라이싱 결과와 결과 조직 스캐폴드의 최상의 품질을 초래한다는 것을 발견했습니다. 적절한 양의 아가로스는 경험적으로 최적화되어야합니다. 래트 폐의 경우 폐를 총 폐 용량으로 팽창시키는 데 필요한 부피는 약 30 mL/kg 동물 질량이다(예를 들어, 350 g 래트의 폐에 대해 10.5 mL 아가로스). 기도 접근이 덜 간단한 더 큰 절제된 폐 조직(예: 인간 기증자로부터의 조직)의 경우, 기관지(32)를 통해 조직을 팽창시키기 위해 몇 가지 추가적인 트러블슈팅이 필요할 수 있다. 후속 폐 슬라이싱 동안, 플런저 상의 조직의 선택 및 배향은 1) 슬라이스가 조직 배양 카세트로 클리핑될 수 있는 조직 스트립을 생성하기에 충분히 크도록 보장하고, 2) 큰 기도 또는 혈관을 제외한 실질(alveolar) 조직 영역을 최대화하는 또 다른 중요한 단계이다.
PCLS를 조직 배양 카세트로 클리핑하는 것은 처음에는 어려운 단계가 될 수 있지만 카세트는 탈세포화 및 시딩 중에 조직 취급을 크게 단순화합니다. 발생할 수 있는 두 가지 잠재적인 문제는 조직 찢어짐(클리핑 과정 중 또는 탈세포화 동안) 또는 불량한 다운스트림 시딩을 초래하는 클립에서의 조직 위치(예를 들어, 시딩 없음, 또는 단지 끝에서 시딩)이다. 찢어짐은 아가로오스 과팽창, 탭 삽입 중 조직의 과도한 스트레칭, 또는 탭을 삽입할 때 적절한 조직 그립을 제공하기 위해 너무 적은 오버행을 남기는 결과일 수 있습니다. 한 클립 끝에서 찢어지는 조각은 성공적으로 시딩될 수 있지만, 조직이 평평하지 않기 때문에 배양 중에 현미경으로 시각화하기가 어렵습니다. 불량한 조직 시딩( 그림 6C에서와 같은)은 슬라이스가 두 클립 사이에 평평하게 놓여 있지 않은 결과일 가능성이 높으며, 따라서 거꾸로 뒤집을 때 시딩 배쓰의 베이스와 잘 접촉하지 못하게 된다. 또 다른 가능한 원인은 파종 목욕의 바닥에있는 카세트의 부적절한 좌석입니다. 클리핑 측면에서 두 번째 클립을 평평하게 놓을 때 조직에 약간 더 많은 장력을 가하여 평평하게 눕히도록 하십시오. 일부 조각에는 약간의 오목함이 있습니다. 이 경우 볼록한 면을 위로 향하게 하여 슬라이스를 클립합니다. 연습을 통해 우리는 일반적으로 슬라이스의 2 % 미만으로 시드가 실패하는 것을 경험합니다.
이 프로토콜의 한 가지 한계는 ELT 준비를 위한 초기 재료를 생성하기 위해 레이저 커터 및 3D 프린터와 같은 일부 특수 장비에 대한 요구 사항입니다. 그러나 조직 배양 카세트와 시딩 욕조가 만들어지면 추가 특수 재료가 필요하지 않습니다. ELT 스캐폴드 제제의 폐 슬라이싱 및 탈세포화 단계는 적당히 시간이 소요되고; 그러나, 이들 단계들은 사전에 수행될 수 있거나, 또는 동시에 다수의 실험을 준비하기에 충분한 숫자로 수행될 수 있다. 많은 PCLS (실질 영역에 최적화하는 경우 >100)는 단일 폐에서 절단하고 나중에 사용하기 위해 스냅 냉동 할 수 있습니다. 단일 동결-해동 사이클이 ECM46에 경미한 초구조적 손상을 야기할 수 있지만, 심지어 다수의 동결-해동 사이클조차도 ECM 23,47에서 상당한 손실을 야기하지 않는 것으로 입증되었다. PCLS는 또한 실험 전에 클리핑되고 탈세포화될 수 있으며, 한 달 이내에 사용될 수 있다. (주목할 만하게, 기술된 탈세포화 프로토콜은 대략 6시간 내에 달성될 수 있으며, 이는 하루 이상의27,28을 필요로 하는 앞서 기술된 방법들에 비해 상당한 이점을 나타낸다.) 일단 스캐폴드가 준비되면, 세포 시딩 과정은 간단하고 빠르며, ELTs의 배양은 특별한 기술을 필요로 하지 않는다.
기술된 ELT 방법의 주의사항은 영역-특이적 시딩의 결여, 즉, AEC2s를 폐포 공간으로의 특이적으로 전달하거나, 혈관 공간으로의 내피 세포로의 특이적인 전달이다. 그럼에도 불구하고, 세포는 단순히 조직 스캐폴드의 상부에 시딩되지만, 재세포화의 패턴은 무작위적이지 않으며, 상피 고리를 포함한 폐포 유사 조직의 일부 유사성이 있다. 우리는 세포 - 세포 상호 작용뿐만 아니라 ECM 조성 및 기하학20,21의 국부적 차이가 관찰 된 재세포 화 패턴에 기여할 가능성이 있다고 의심합니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해, 섬유아세포가 탈세포화된 폐 절편에 비특이적으로 시딩된 이전에 발표된 연구에서, 조직 재집단 및 관련 세포 표현형의 패턴이 현미경적 조직 영역 및 ECM 스캐폴드 공급원(예를 들어, 건강한 대 병든 것)에 의해 유의하게 변화한다는 것을 입증하였다27. 섬유아세포는 또한 간질로 침입하는 것으로 관찰되었다 - 그들이 토착 폐 조직에 거주하는 위치 1,27. 진정한 영역 특이적 방식으로 폐 조각에서 세포를 배양하는 것을 상상할 수있는 주요 대안 방법은 기도31,48 및 혈관 구획 49,50을 통해 손상되지 않은 탈세포화 된 폐를 시딩 한 다음 재세포 화 된 조직을 슬라이싱하는 것을 수반합니다. 그러나, 이러한 대안 1)은 상당히 더 많은 비용-, 시간-, 및 자원-집약적이다; 2) 처리량이 낮다. 3) 동물의 수를 늘려야합니다. 4) 전체 폐 배양의 도전 및 시드 된 폐의 후속 슬라이싱으로 인한 오염 위험 증가와 관련이 있습니다. 네이티브 세포 조직의 모든 측면을 되풀이하지는 않지만, ELT 플랫폼은 생리학적으로 관련된 ECM 기질 상에서 폐 세포 배양을 가능하게 하며, 이는 더 많은 실험실에서 접근할 수 있는 방식으로 가능하다.
ELT 시스템의 유연성은 이러한 플랫폼의 주요 이점이며, 관심있는 임의의 수의 조직 스캐폴드, 세포 또는 배양 배지와 함께 소규모 폐 조직 배양을 허용해야 한다. 병든 조직 또는 손상 모델로부터 유래된 스캐폴드의 사용은 질병-변경된 ECM 27,29,51의 설정에서 세포-세포 또는 세포-매트릭스 상호작용의 연구를 허용할 수 있다. 그러나, 탈세포화 프로토콜은 종(52) 사이의 매트릭스 차이를 설명하기 위해 적응될 필요가 있을 수 있다는 점에 유의한다. 기술된 시딩 전략은 임의의 세포 유형에 사용될 수 있고, 배양 타임라인은 연구자의 요구에 적합하도록 적응된다. 시작점으로, 스캐폴드 당 1 x 106 세포는 배양 후 7 일 이내에 높은 세포 조직을 산출해야하는 반면, 1 x 105 총 세포는 불량한 세포성을 초래합니다. 타임라인의 임의의 적응에서, 조직 배양 카세트는 마지막 조직 시딩 후 24시간 후에 시딩 배쓰로부터 제거되어야 한다. 여기에서는 폐 폐포의 세포 복잡성 중 일부를 모델링하는 것을 목표로 적어도 7 일 동안 폐포 유사 구조에서 잘 분화 된 신생아 AEC2s의 유지를 지원하는 삼중 배양 재세포화 전략을 설명합니다. 우리의 결과는 또한 ELT 내에서 섬유아세포와 내피 세포의 성공적인 생착을 입증하며, 배양 기질의 광범위한 적용 가능성과 공동 배양 연구에 대한 적합성을 강조합니다. ELTs에서 성체 세포를 시딩하는 것은 더 정동작 폐포 구조의 모델링을 용이하게 할 수 있는 반면, 유전자 변형을 갖는 것을 포함하는 인간 PSC 유래 AEC2s를 시딩하는 것은 인간 질병13,53의 번역 연구를 용이하게 할 수 있다. 일반적으로, ELT 플랫폼에 의해 활성화된 상향식 접근법은 AEC2 증식 또는 분화 상태와 같은 관심있는 판독에 대한 특정 세포 유형의 기여를 조사할 기회를 제공한다.
요약하면, 이 프로토콜은 무세포 ECM 폐 슬라이스 스캐폴드 내의 AEC2s, 섬유아세포 및 내피 세포의 공동 배양 연구를 위한 조작된 폐 조직을 생성하기 위한 견고한 시스템을 개략적으로 설명합니다. ELT는 일차 AEC2s에 대한 새로운 3D 배양 전략을 나타내며, 현재까지 잘 분화 된 표현형 6,11,12를 유지하기 위해 덜 생리학적인 겔형 매트릭스에 의존해 왔다. 현재의 플랫폼은 탈세포화 된 폐 절편24,25,26,27,28,29의 재 집단에 대한 이전 연구를 기반으로하지만 몇 가지 이점을 제공합니다 : 1) 탈세포화, 시딩 및 배양 중에 ELT 처리를 용이하게하는 조직 배양 카세트 시스템; 2) 각 슬라이스 스캐폴드 상에 공지된 수의 세포를 정확하게 시드하기 위한 맞춤형 시딩 배쓰; 3) 상피, 중간엽 및 내피 세포로 폐포 조직 재집단을 가능하게하는 삼중 배양 재 시딩 전략. 따라서, ELT는 천연 폐포 및 AEC2 줄기 세포 틈새 시장의 세포 및 기질 복잡성을 포착하는 재현 가능한 시험관내 모델을 만들기 위한 중요한 진전을 나타낸다.

폐포는 원위 폐의 기능 단위로, 폐포 상피 유형 1 세포 (AEC1s) 및 유형 2 세포 (AEC2s)에 의해 줄 지어있는 가스 교환 공극의 메쉬 워크를 포함한다. 상피의 기저에는 모세혈관의 조밀한 네트워크뿐만 아니라 중간엽을 지지하며, 이 섬세한 공기 주머니1에 강도와 유연성을 모두 제공하는 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드에 의해 엉덩이가 됩니다. 폐포는 또한 특발성 폐 섬유증2, 급성 호흡 곤란 증후군3 및 심각한 코로나 바이러스 질병 -19 (COVID-19)4를 포함한 수많은 폐 병리에서 부상 부위입니다. 지난 십 년 동안의 연구가 폐 상피 내에서 현저한 가소성을 밝혀냈지만, 일부 환경에서 원위 폐 복구를 가능하게 하는 메커니즘 - 그리고 다른 환경에서의 복구를 배제하는 메커니즘 - 은 여전히 강렬한 조사의 영역으로 남아 있습니다5. 폐포를 모델링하기 위해 개선 된 시험관 내 플랫폼의 개발은 폐포 생물학, 재생 및 치료제에 대한 연구를 촉진 할 것입니다.
AEC2s는 자가-갱신되고 AEC1s로 분화되며, 따라서 원위 폐6,7,8의 일차 줄기 세포로 간주된다. 그러나, 이들 세포는 표현형9의 손실 없이 일차 AEC2s를 배양하는 것과 관련된 어려움을 감안할 때 시험관내 연구에 특별한 도전을 제기한다. 종래의 2차원(2D) 배양에서, AEC2는 AEC1-유사 세포(10)의 일부 특징을 평탄화하고 채택한다. 대조적으로, 가장 일반적으로 오가노이드인 3D 배양 전략은 일차 AEC2s6,11,12에서 분화된 기능의 유지를 지원하고 다능성 줄기 세포(PSC) 유래 AEC2s13,14의 장기 배양을 허용한다. 오가노이드는 원위 폐 발달 15, 바이러스 감염11,15 및 AEC2 관련 유전 질환13,16,17을 모델링하는 데 사용되어 AEC2 생물학 및 재생에 대한 중요한 통찰력을 가능하게합니다. 그러나, 이들 배양 모델은 전형적으로 단지 하나 또는 두 개의 세포 계보를 포함하고, 천연 폐포의 아키텍처 또는 ECM 기질 중 어느 하나를 재검토하지 못하는 겔형 매트릭스에 세포를 내장한다.
ECM은 분자적, 지형적, 기계적 단서를 통한 세포 표현형 및 행동의 중요한 조절자입니다. 줄기 세포 운명을 조절하는 조직 특이적 틈새 시장의 핵심 구성 요소를 포함; 국 부적으로 분비된 성장 인자18,19,20,21의 이용가능성을 조절하는 저수지 역할을 한다. 따라서 천연 ECM 상에서 세포를 배양하는 것은 생체내 조직의 생물학을 모델링하기 위해 시험관내 시스템의 예측 능력을 증가시킬 수 있다. 탈세포화, 세제, 효소 또는 물리적 또는 기타 방법을 통해 조직에서 세포 물질을 제거하는 과정으로,22,23을 신중하게 수행 할 때 천연 기관의 ECM 스캐 폴딩을 상당 부분 보존 할 수 있습니다. 이러한 스캐폴드는 3D 생체모방 배양을 위해 세포로 재채워질 수 있다. 그러나, 탈세포화 스캐폴드는 조직 공학 응용에 널리 사용되지만, 일상적인 세포 배양을 위한 이들의 사용은 제한되었다. 몇몇 이전의 연구들은 폐 절편 또는 작은 폐 조직 세그먼트의 탈세포화 및 재세포화를 보고하였다. 개념 증명 연구 24,25,26 외에도, 재채워진 폐 조각은 섬유아세포-매트릭스 접착력 27,28을 연구하고 섬유아세포 표현형 27,29에 대한 병든 폐 매트릭스의 효과를 조사하기 위해 사용되었다. 정밀 절단 조직 조각을 생성하는 데 사용할 수있는 향상된 기술을 통해 탈세포 폐 조각은 폐포, 기도 및 혈관 하부 구조를 보존하면서 세포를 배양하는 편리하고 작은 규모의 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 여러 세포 유형을 통합하면 생리적으로 관련된 3D 환경 내에서 세포 - 세포 상호 작용에 대한 연구가 가능합니다. 그러나, 배양 과정 전반에 걸쳐 조직의 취급을 용이하게 하고, 알려진 수의 세포를 갖는 조직의 제어되고 재현가능한 시딩을 보장하기 위해서는 개선된 전략이 필요하다.
여기에서는 탈세포화 정밀 절단 폐 조각 (PCLS)을 일차 내피 세포, AEC2s 및 섬유 아세포로 재채움으로써 조작 폐 조직 (ELT)을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 앞서 기술한 조작된 심장 조직 시스템(30) 및 전체 폐 탈세포화-재세포화 전략(22,31)의 적응에서, 우리는 쥐 폐로부터 PCLS를 절단하고 절편을 재사용 가능한 조직 배양 카세트로 클리핑하여 하류 조작을 단순화하고 표준화하는 절차를 기술한다. 잘린 슬라이스는 탈세포화되어 무세포 ECM 스캐폴드를 형성하며, 이는 맞춤형 시딩 욕조에 다시 채워집니다. 폐 슬라이스 스캐폴드는 중요한 ECM 구성 요소 및 아키텍처를 보존하고 최소 7일 동안 다중 계통 폐포 유사 구조 내에서 AEC2의 성장을 지원합니다. ELT는 AEC2 및 폐포에 대한 기본 생물학적 연구를 촉진하면서 폐 조직 공학 전략의 개발을 지원해야하는 생리 학적 관련 3D 매트릭스 내에서 새로운 폐포 공동 배양 시스템을 나타냅니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

천연 폐포 ex 생체의 건축 및 세포 복잡성을 재조정하는 개선된 3차원(3D) 폐 모델에 대한 필요성이 존재한다. 최근에 개발된 오가노이드 모델은 시험관 내에서 폐 상피 전구물질의 확장 및 연구를 촉진시켰지만, 이들 플랫폼은 전형적으로 마우스 종양 유래 매트릭스 및/또는 혈청에 의존하고, 단지 하나 또는 두 개의 세포 혈통을 통합한다. 여기에서, 우리는 탈세포화 정밀 절단 폐 절편 (PCLS)의 다중 계보 재세포화에 기초하여 조작된 폐 조직 (ELTs)을 생성하기 위한 프로토콜을 설명한다. ELT는 폐포 상피, 중간엽 및 내피를 포함하는 폐포 유사 구조를 함유하며, 이는 천연 폐와 매우 유사한 세포외 매트릭스(ECM) 기질 내에 있습니다. 조직을 생성하기 위해 쥐 폐는 아가로스로 팽창되고, 450 μm 두께의 조각으로 슬라이스되고, 스트립으로 절단되고, 탈세포화된다. 이어서, 생성된 무세포 ECM 스캐폴드를 일차 내피 세포, 섬유아세포, 및 폐포 상피 유형 2 세포(AEC2s)로 재시딩한다. AEC2s는 무혈청, 화학적으로 정의된 성장 배지로 적어도 7일 동안 ELT 배양물에서 유지될 수 있다. 조직 준비 및 배양 과정 전반에 걸쳐, 슬라이스는 카세트 시스템으로 클리핑되어 여러 ELT의 처리 및 표준화된 세포 시딩을 병렬로 용이하게 합니다. 이 ELT는 AEC2 및 그 틈새 시장을 조절하는 생화학 적 신호뿐만 아니라 폐포 내의 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용에 대한 조사를 용이하게해야하는 유기형 배양 플랫폼을 나타냅니다.

ELTs를 생성하는 공정의 개요 - 폐 슬라이싱, 슬라이스 클리핑 및 탈세포화, 및 스캐폴드 재집단을 포함하는 - 이 도 3에 제시된다. 여기에 제시된 ELTs를 일차 래트 폐 미세혈관 내피 세포 (표 문헌 참조), 신생아 래트 AEC2s, 및 리포섬유아세포-농축 신생아 래트 폐 섬유아세포36을 사용하여 배양하였다. AEC2s는 앞서 기술된 바와 같이 자성 비드-기반 분류를 통해 신선하게 분리되었다(37); 대안적인 격리 프로토콜은 상세하고 다른 곳에서 논의되었다38,39,40. 분리된 래트 AEC2s의 순도는 래트 특이적 AEC2 표면 마커 RTII-7041에 대한 유세포 분석기를 통해 또는 RTII-70 또는 프로-계면활성제 단백질 C(pSPC)에 대한 세포원심분리된 세포 샘플의 염색을 통해 평가될 수 있다. 쥐 폐 섬유아세포를 공개된 프로토콜42의 적응에 따라 출생 후 7-9 래트 새끼로부터 단리하고 계대 1-2에서 사용하였다; 대안적인 격리 프로토콜들은 다른 곳에서 설명되었다(43,44). 분리된 섬유아세포의 순도는 중간엽 마커 비멘틴에 대한 배양 또는 세포원심분리된 세포의 염색을 통해 평가될 수 있고, 리포섬유아세포 농축은 Oil RedO45에 대한 염색을 통해 평가될 수 있다.
폐 조직이 아가로오스로 균일하게 팽창될 때, 조직 조각은 전략적으로 선택되고 총 및 실질 조직 면적을 최대화하기 위해 슬라이싱을 위해 배향될 때, 한 마리의 래트 폐는 >100개의 폐포 ELT를 위한 조직을 산출할 수 있다. PCLS 스트립은 찢어짐의 사례가 거의 없는 조직 카세트로 클리핑되기에 충분한 기계적 무결성을 나타내<(그림 3B).
폐 절편을 탈세포화하기 위한 프로토콜은 이전에 발표된 전체 폐 탈세포화 프로토콜에 밀접하게 기초하고 있으며, 이는 정량적 프로테오믹스에 의해 천연 폐22의 것과 크게 다르지 않은 수준에서 많은 ECM 성분을 보존하는 것으로 입증되었다. 탈세포화된 슬라이스 스캐폴드는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색(도 4A,B) 및 위상차 현미경(도 4C)으로 볼 때 폐포의 토착 구조를 보존한다. 우리는 일반적으로 큰 기도나 혈관(그림 4D) 또는 눈물을 포함하는 스캐폴드를 제외하지만, 연구자가 관심을 갖는 경우 전자를 포함할 수 있습니다. 탈세포화는 이중 가닥 DNA에 대한 분석으로 측정시 조직 DNA 함량의 96% 감소를 초래한다(표 참조; 0.50 μg/mg ± 0.073 μg/mg 대 0.018 μg/mg ± 0.0035 μg/mg vs 0.0035 μg/mg vs 0.0035 μg/mg 대 천연 및 탈세포화된 조직에서는 각각 평균 ± SEM)(도 5A), 헤마톡실린 염색으로 보이는 DNA는 없다(도 4B). 탈세포화된 스캐폴드의 조직학적 및 면역형광성 염색은 ECM 단백질 콜라겐, 엘라스틴, 콜라겐 IV 및 라미닌이 천연 폐 절편에서와 유사한 구조 및 양을 갖는 유지를 보여준다(도 5B-E). 네이티브 조직의 핵은 트리코메 (콜라겐 용) 및 EVG (엘라스틴 용) 얼룩으로 파란색 / 검은 색으로 염색됩니다. 면역형광 염색은 조직37을 염색하기 위한 표준 방법을 사용하여, 이전에 기술된 바와 같이 수행되었다. 사용된 항체 및 이들의 각각의 농도는 표 4에 열거되어 있다.
성공적인 스캐폴드 재집단은 7일 후에 고도의 세포 ELT로 이어지며, 광현미경으로 볼 수 있는 폐포와 같은 재집단 패턴이 보인다(그림 6A-C). 어떤 경우에는 매우 높은 세포성으로 오가노이드형 구조가 보일 수 있습니다 (그림 6A, B). 실패한 조직 시딩은 배양 동안 위상차 현미경으로 시각화할 수 있습니다(도 6C). AEC2s, 섬유아세포 및 내피 세포로 조직 스캐폴드를 배양한 후, ELT는 세 개의 세포 계통을 모두 포함하는 폐포 유사 구조로 조밀하게 재채워진다(도 6D, E). 7 또는 8일째에, AEC2s는 AEC1s로의 유의한 분화의 증거 없이 입방체 형태를 유지하고 계면활성제 단백질-B(SPB) 및 라멜라체 단백질 ABCA3을 발현한다(도 6E, F). AEC2s는 10 μM에서 2 h 펄스에 이어 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU) 혼입에 의해 입증된 바와 같이 ELT에서 고도로 증식한다 (도 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> 도 1: 폐 추출 및 제거를 위한 관류 시스템의 개략도. (A) 관류 시스템은 유동 하의 폐동맥의 초기 캐뉼레이션에 사용되는 중력 구동 사지를 포함한다; 및 펌프 구동 사지, 초기 캐뉼레이션 후 폐를 효율적으로 청소하는 데 사용됩니다. 펌프 라인에는 펌프로 인한 압력의 스파이크를 감쇠시키는 "펄스 댐퍼"가 포함되어 있습니다. 기관 및 폐 동맥 캐뉼라의 디자인은 왼쪽에 자세히 설명되어 있습니다. SNP = 니트로프로시드 나트륨. (B) 펄스 감쇠기 어셈블리의 세부 사항. BPT와 실리콘은 튜브의 유형을 나타냅니다. (C) 폐 추출 중에 놓인 기관 및 폐 동맥 캐뉼라의 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> 그림 2: 삼계보 재세포화를 위한 배양 타임라인. 삼상 시딩의 타이밍을 포함하여 삼계보 ELT 시딩 및 배양을 위한 제안된 타임라인. 각 단계에 대한 시딩 및 배양 배지에 대한 세포 번호가 표시된다. 배양 배지 세부사항은 표 3을 참조한다. AEC2 = 폐포 상피 유형 2 세포. EC = 내피 세포. FB = 섬유아세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> 도 3: 조작된 폐 조직 제제의 개략도. (A) 천연 폐 조직은 비브라톰을 사용하여 조각으로 절단된다. (B) 정밀 절단된 폐 조각은 표준화된 3mm 너비의 스트립으로 절단되고, 폴리테트라플루오에틸렌(PTFE) 조직-배양 카세트로 클리핑되고, 세제-탈세포화되어 무세포 세포외 매트릭스 스캐폴드를 수득한다. (C) 스캐폴드는 시딩 영역을 조직의 영역으로 제한하는 특수 파종 욕조에서 재시딩한 다음, 표준 웰 플레이트에서 배양한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> 도 4: 탈세포화된 폐 스캐폴드의 구조. 천연 (A) 및 탈세포화 (B) 폐 조각의 H & E 염색은 탈세포화 후 폐포 구조의 보존을 보여줍니다. (C,D) 위상차 현미경에 의해 5x 배율로 보이는 탈세포화된 ECM 스캐폴드의 예는 주로 폐포 조직(C) 또는 큰 분지화 기도 및 혈관(D, 검정 및 적색 화살촉)을 함유한다. 스케일 바, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> 도 5: 탈세포화된 폐 스캐폴드에서의 DNA 제거 및 매트릭스 보존. (A) 천연 및 탈세포화된 폐 절편에서의 DNA의 정량화 (SEM± 평균, n = 5). 웰치의 t 테스트, **P < 0.01. 디셀 = 탈세포화. (B,C) 콜라겐 (B) 및 엘라스틴 (C)에 대한 천연 및 탈세포화 폐 절편의 조직학적 염색. 화살촉, 탈세포화 된 조직의 폐포 입구 고리에 보존 된 엘라스틴. (D,E) 콜라겐 IV (D) 및 라미닌 (E)에 대한 천연 및 탈세포화 폐 절편의 면역형광 염색. 스케일 바, 50 μm. 모든 패널에서 점선 상자는 각 패널에서 오른쪽으로 확대되는 이미지 영역을 윤곽선으로 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> 그림 6: 조작된 폐 조직의 세포 재집단. (A-C) 배양 7일째에 재세포화된 ELTs의 예는, 배양 동안 위상차 현미경에 의해 시각화된 바와 같다. 재세포화 패턴은 조직의 폐포 구조를 반영합니다. 높은 세포성의 일부 영역에서, 오가노이드-유사 구조(화살촉)가 형성될 수 있다. (A) 및 (B)는 성공적인 세포 재집단을 나타내는 반면, (C)는 배양 7일 후의 불량한 수준의 재세포화를 나타낸다. (D-G) 배양 7일째 또는 8일째에 재세포화된 ELTs의 염색. (d) 폐포 셉타의 세포 재집단을 보여주는 H&E 염색. (e) 면역형광 염색 라벨 그래프팅된 프로콜라겐Iα1+ 섬유아세포, ABCA3+ AEC2s 및 CD31+ 내피 세포. (F) Tissues는 풍부한 SPB + AEC2를 포함하지만 이러한 조건 하에서 RTI-40 (포도 플라닌) + AEC1은 거의 포함하지 않습니다. (G) 많은 AEC2가 EdU 통합에 의해 측정되는 ELT에서 증식하고 있다. 스케일 바, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 탈세포화 용액. 탈세포화 용액에 대한 준비 세부 사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 탈세포화 프로토콜. 폐 조각을 탈세포화하기 위한 프로토콜의 세부사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 배양 배지. 내피 및 AEC2 성장 배지에 대한 준비 세부 사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 4: 면역염색에 사용되는 항체. 면역 염색에 사용되는 항체 및 그의 농도에 대한 세부 사항. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 레이저 절단 조직 배양 카세트 프레임을위한 디자인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: 레이저 절단 조직 배양 카세트 클립을위한 디자인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3 : 레이저 절단 조직 배양 카세트 탭을위한 디자인. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 4: 목욕 금형베이스를 시드하기위한 CAD 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 5 : 목욕 몰드 링을 시드하기위한 CAD 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

이 프로토콜은 탈세포화된 정밀 절단된 폐 조각을 폐포 상피 유형 2 세포, 섬유아세포 및 내피 세포로 재채움으로써 재현 가능한 소규모 조작된 폐 조직을 생성하는 방법을 설명합니다.

탈세포화된 폐 조각으로 제조된 조작된 폐 조직

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

이 프로토콜은 입체 조직 배양 기질로서 무손상 폐 세포외 매트릭스의 반복 가능한 사용 및 적당한 처리량을 가능하게 한다. 조작된 폐 조직 시스템의 가장 큰 장점은 플랫폼의 유연성입니다. ELTs는 관심있는 다양한 조직 스캐폴드, 세포, 또는 배양 배지를 사용하도록 적응될 수 있다.폐가 추출되면 페놀 레드가없는 아가로스와 HBSS로 10 밀리리터 주사기를 채 웁니다. 기관 캐뉼라를 통해 약 10 밀리리터의 공기로 폐를 팽창시킨 다음 폐 엽의 가장 원위 끝이 팽창 될 때까지 기관 캐뉼라를 통해 준비된 아가로스를 즉시 주입하십시오. 사방 스톱콕에서 기관 캐뉼라의 여성 루어 잠금 장치에 흰색 캡을 부착하여 기관을 캡핑하십시오.폐를 얼음 위의 150 밀리미터 페트리 접시에 넣어 아가로스가 응고되도록 하십시오. 원고의 프로토콜에 따라 폐 조각을 준비한 다음 100 밀리미터 페트리 접시에 PBS의 1/3 부피를 채 웁니다. 포셉을 사용하여 카세트와 탭을 접시에 옮깁니다.슬라이스가 냉동된 경우, 실온 PBS에 붓고 한 번에 하나의 디쉬를 해동시킨다. 그런 다음 해동 된 조각을 150 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 미세한 포셉 또는 지혈제를 사용하여 슬라이스를 부드럽게 펼치고 조직 주위에서 과도한 PBS를 조심스럽게 흡인합니다.그런 다음 면도날의 전체 길이를 접시에 단단히 대고 좌우로 약간 흔들어서 조각에서 세 밀리미터 너비, 적어도 아홉 밀리미터 길이의 스트립을 자릅니다. 티슈 스트립을 카세트에 클립하려면 카세트 위에 올려 놓고 조심스럽게 가운데에 두어 양쪽 끝의 클립의 구멍을 지나 확장하십시오. 미세한 집게로 한쪽 끝의 구멍에 탭을 부분적으로 놓고 조직을 부드럽게 곧게 펴고 두 번째 탭을 설정하십시오.마지막으로 포셉을 사용하여 각 탭을 완전히 눌러 조직을 고정하십시오. 모든면을 클리핑 한 후 카세트가 들어있는 100 밀리미터 접시를 층류 후드로 옮깁니다. 첫 번째 탈세포화 용액이 들어있는 여섯 웰 플레이트에 카세트를 옮기고 곡선 지혈제를 사용하여 노치면을 잡습니다.이어서, 여섯 웰 플레이트를 30 RPM의 오비탈 쉐이커 상에 10분 동안 놓는다. 각 웰에서 유체를 흡인 한 다음 웰 당 두 번째 탈세포 화 용액의 세 밀리리터로 교체하십시오. 플레이트를 30RPM의 오비탈 쉐이커 위에 놓고 5분 동안 인큐베이션한다.원고의 탈세포화 프로토콜에 설명 된대로 각 솔루션으로이 과정을 반복하십시오. PBS로 최종 헹구어 낸 후, 조직을 항생제 및 항균제와 함께 신선한 PBS를 함유하는 멸균된 여섯 웰 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 항생제 및 항균제로 멸균 한 후, 폐 조직 스캐폴드는 즉시 시드되거나 섭씨 4도에서 최대 30 일 동안 보관할 수 있습니다.배양을 위해 활용하기 전에, 추가적인 멸균 단계로서 신선한 PBS 및 항생제 및 항균제와 함께 섭씨 4도에서 저장된 스캐폴드를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 스캐폴드를 멸균 PBS, 웰 당 다섯 밀리리터, 세 번, 각각 다섯 분 동안 헹구십시오. 스캐폴드를 5X 배율로 위상차 현미경으로 검사하여 시딩할 조직을 선택합니다.내피 배지에서 내피 세포 현탁액을 밀리리터 당 5 백만 개의 세포로 준비하여 슬라이스 당 500, 000 개의 내피 세포를 시드하기에 충분한 세포로 준비하십시오. 오토클레이브 시드 욕조를 100mm 페트리 접시에 넣고 조심스럽게 헹굼 스캐폴드를 거꾸로 씨를 뿌리는 욕조로 옮깁니다. 제조된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이 치며 혼합한다.그런 다음 웰 바닥에있는 각 조직의 맨 위에 100 마이크로 리터의 세포를 조심스럽게 피펫하여 피펫 팁으로 조직이 손상되지 않도록주의하십시오. 시딩된 조직을 세포 배양 인큐베이터로 옮긴다. 내피 세포 시딩 24시간 후, 수동 피펫을 사용하여 900 마이크로리터의 미리 가온된 배양 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다.세포 시딩 24시간 후, 배지를 제거하고 웰 당 한 밀리리터의 신선한 내피 배지를 교체한다. 72시간 후 내피 세포를 시딩하고, AEC2s, 또는 폐포 상피 유형 II 세포를 계수하고, 혈구분석기를 사용하여 섬유아세포를 계수하고, 밀리리터당 5백만 개의 세포에서 AEC2 성장 배지에서 1:1 세포 현탁액을 제조하였다. 각 시딩 욕조로부터 배지를 잘 피펫하고 준비된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이친다.100 마이크로 리터의 세포를 우물 바닥에있는 각 조직의 바로 위에 피펫하십시오. 시딩된 조직을 세포 배양 인큐베이터로 옮긴다. 2시간 후, 900 마이크로리터의 미리 가온된 AEC2 성장 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다.AEC2s 및 섬유아세포로 24시간 배양한 후, 카세트 당 웰 당 1밀리리터의 미리 가온된 AEC2 성장 배지로 12-웰 플레이트를 제조하였다. 시딩 배쓰의 각 웰로부터 배지 800 마이크로리터를 피펫한 다음, 시딩 배쓰로부터 카세트를 제거하고 웰 당 하나의 카세트인 준비된 12-웰 플레이트까지 우측으로 옮긴다. 원하는 배양 기간 동안 격일로 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양 배지를 조심스럽게 변화시킨다.배양 기간 동안 5X 배율에서 위상차 현미경을 통해 조직 재집단의 정도를 모니터링한다. 조직 스캐폴드의 H 및 E 염색은 가시적인 세포 핵이 없는 탈세포화 후에 보존된 폐포 구조를 나타냈다. 폐포 조직은 탈세포화된 세포외 매트릭스 스캐폴드를 위상차 현미경으로 5X 배율로 보았을 때 관찰되었다.큰 가지기도와 혈관도 일부 조각에서 볼 수있었습니다. 배양 일곱째 날에, 위상차 현미경 검사는 조작된 폐 조직에서의 재세포화 패턴이 성공적인 재집단의 경우에 조직 폐포 구조를 모방한다는 것을 보여주었다. 불쌍한 재세포화도 눈에 띄었다.일곱 번째 또는 여덟 일째에 H 및 E 염색은 폐포 중격의 재집단을 나타내었다. 면역형광 프로콜라겐 타입 I 알파 1 양성 섬유아세포, ABCA3 양성 AEC2s, CD31 양성 내피 세포, SPB 양성 AEC2s가 풍부함을 밝혀냄을 드러냈다. 더욱이, 티미딘 분석은 많은 증식하는 AEC2s를 보여주었다.이 기술은 폐 조직 공학을위한 전략 개발을 촉진했으며 폐포 내에서 유형 II 세포 증식 및 분화를 지원하는 대기열에 대한 조사를 가능하게했습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

연구

생체공학

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

교란 성 포유류 심장의 경부 흡광도 분광학을 사용하여 세포 대사를 모니터링하기위한 심장 내 측 발사 라이트 카테터

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

섬유아세포, 선별 애플리케이션을 위한 인간 공학형 결합 조직

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

지역별 탈세포화된 폐 조직의 해부 및 분리

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...