Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Forfatterne vil takke Lorenzo Sewanan og Jorge Nunez for deres arbeid med å utvikle vevskulturkassettdesignet som brukes i denne protokollen, Kaminski-laboratoriet for bruk av deres vibratom, Maurizio Chioccioli og Jessica Nouws for hjelp med lungeslicing, Allie LaRocco for hjelp med innledende piloteksperimenter og Hong Qian for nøye lesing av protokollen. Dette arbeidet ble støttet av NIH grants F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.), og U01HL145567 (L.E.N.); og av en ubegrenset forskningsgave fra Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. er grunnlegger og aksjonær i Humacyte, Inc, som er et regenerativt legemiddelselskap. Humacyte produserer konstruerte blodårer fra allogene glatte muskelceller for vaskulær kirurgi. L.E.N.s ektefelle har egenkapital i Humacyte, og L.E.N. sitter i Humacytes styre. L.E.N. er en oppfinner på patenter som er lisensiert til Humacyte og som produserer royalties for L.E.N. L.E.N. har mottatt en ubegrenset forskningsgave for å støtte forskning i hennes laboratorium på Yale. Humacyte påvirket ikke oppførselen, beskrivelsen eller tolkningen av funnene i denne rapporten.

Dette papiret beskriver bruken av decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver som en plattform for å generere konstruert lungevev in vitro, som inneholder multi-lineage alveolar-lignende strukturer. Ved å kombinere strategier som vi tidligere utviklet for å repopulate high-fidelity acellular ECM lunge stillaser for hele lungeteknikk22,31, med vårt robuste system for culturing småskala konstruert hjertevev30, denne protokollen muliggjør bruk av fysiologisk relevant lunge ECM som vev kultur substrat, på en repeterbar og moderat gjennomstrømning måte.
Metodene som presenteres her beskriver ELT stillaspreparat fra rotte lunger, som er lett oppnåelige, kan ekstraheres en blokk med direkte tilgang til intakte luftveier for agarose inflasjon, og er av større størrelse enn musen lunge. Imidlertid kan ethvert lungevev som kan blåses opp med agarose og utbytteskiver minst 9 mm i lengde, brukes i dette systemet. Uavhengig av vevskilde er jevn inflasjon av lungevevet med agarose det mest kritiske trinnet for å sikre suksess med nedstrøms vevsskjæring, klipping og vevshåndtering. Underinflatert lungevev har en tendens til ikke å skjære rent, mens overinflatert vev kan rive under klipping. Etter agarose gelering er passende oppblåste vevsregioner faste, men gir litt gi når de trykkes forsiktig med tang. For intakte rotte lunger fant vi at forblåsing av ekstraherte lunger med luft flere ganger, etterfulgt av agarose inflasjon så snart som mulig etter utvinning, resulterer i de beste kutting utfall og beste kvalitet på resulterende vev stillaser. Riktig volum av agarose må optimaliseres empirisk; for en rotte lunge volumet som kreves for å blåse opp lungen til total lungekapasitet er ca 30 ml / kg dyremasse (f.eks. 10,5 ml agarose for lunger fra en 350 g rotte). For større resected lungevev med mindre grei luftveistilgang (for eksempel de fra menneskelige donorer), kan det være nødvendig med ytterligere feilsøking for å blåse opp vevet via en bronchus32. Under etterfølgende lungeslicing er utvelgelsen og orienteringen av vevet på stempelet et annet viktig skritt for å 1) sikre at skivene er store nok til å generere vevsstrimler som kan klippes inn i vevskulturkassetter og 2) maksimere parenchymalt (alveolar) vevsområde, unntatt store luftveier eller kar.
Klipping av PCLS i vevskulturkassetter kan være et utfordrende skritt i utgangspunktet, men kassettene forenkler vevshåndteringen sterkt under decellularisering og såing. To potensielle problemer som kan oppstå er vevsrivning (enten under klippingsprosessen eller under decellularisering), eller vevsposisjonering i klippene som resulterer i dårlig nedstrøms såing (f.eks. ingen såing eller såing bare i enden). Riving kan være et resultat av agarose overinflasjon, overstretching av vevet under tab innsetting, eller la for lite overheng for å gi tilstrekkelig vev grep når du setter inn tappene. Vær oppmerksom på at skiver som rives i den ene klipsenden kan bli vellykket frøet, men de er vanskelige å visualisere under mikroskopet under kulturen, da vevet ikke er flatt. Dårlig vevssåing (slik som i figur 6C) er sannsynligvis et resultat av at skiven ikke ligger flatt mellom de to klipsene, og dermed får dårlig kontakt med bunnen av såddet godt når det vendes opp-ned. En annen mulig årsak er feil sitteplasser på kassetten i bunnen av såddbadet godt. Når det gjelder klipping, bruk litt mer spenning i vevet når du plasserer det andre klippet for å hjelpe det å ligge flatt. Noen skiver har en liten konkavitet; I disse tilfellene klipper du stykket med den konvekse siden opp. Med praksis opplever vi vanligvis mislykket såing med færre enn 2% av skiver.
En begrensning i denne protokollen er kravet til noe spesialisert utstyr - en laserkutter og en 3D-skriver - for å generere de første materialene for ELT-forberedelse. Men når vevskulturkassettene og såddene er opprettet, er det ikke nødvendig med flere spesielle materialer. Lungeslicing og decellulariseringstrinn av ELT stillaspreparat er moderat tidkrevende; Disse trinnene kan imidlertid utføres på forhånd, eller i tall som er tilstrekkelige til å forberede seg på flere eksperimenter samtidig. Mange PCLS (>100 hvis optimalisering for parenchymale regioner) kan kuttes fra en enkelt lunge og snap-frozen for senere bruk. Mens en enkelt fryse-tine syklus kan forårsake mindre ultrastrukturelle skader på ECM46, selv flere fryse-tine sykluser har vist seg ikke å forårsake et betydelig tap i ECM 23,47. PCLS kan også klippes og decellulariseres i forkant av et eksperiment, som skal brukes innen en måned. (Spesielt kan den beskrevne decellulariseringsprotokollen utføres på omtrent 6 timer, noe som representerer en betydelig fordel i forhold til tidligere beskrevne metoder som krever en dag eller mer27,28.) Når stillasene er forberedt, er cellesåingsprosessen enkel og rask, og kulturen til ELTs krever ikke spesialiserte teknikker.
En advarsel om den beskrevne ELT-metoden er mangelen på regionspesifikk såing, det vil si levering av AEC2s spesielt til alveolarrommet, eller endotelceller spesielt til det vaskulære rommet. Likevel, selv om celler bare er frøet på toppen av vevsstillasene, er mønsteret for recellularisering ikke-tilfeldig, med noe semblance av alveolarlignende organisasjon, inkludert epitelringer. Vi mistenker at cellecelleinteraksjoner, samt lokale forskjeller i ECM-sammensetning og geometri 20,21, sannsynligvis bidrar til de observerte recellulariseringsmønstrene. Til støtte for denne hypotesen viste en tidligere publisert studie, der fibroblaster ble sådd ikke-spesifikt på decellulariserte lungeskiver, at mønsteret av vevsrepopulering og tilhørende cellulære fenotyper varierte betydelig etter mikroskopisk vevsregion og ECM stillaskilde (f.eks. sunn versus syk)27. Fibroblaster ble også observert å invadere inn i interstitiumet - stedet der de bor i innfødt lungevev 1,27. Den primære alternative metoden som vi kan forestille oss å dyrke celler på lungeskiver på en virkelig regionspesifikk måte, vil innebære såing intakte decellulariserte lunger via luftveiene31,48 og vaskulære rom49,50, og deretter kutte det recellulariserte vevet. Dette alternativet 1) er imidlertid betydelig mer kostnads-, tids- og ressurskrevende; 2) er lavere gjennomstrømning; 3) krever økt antall dyr; og 4) er forbundet med økt risiko for kontaminering på grunn av utfordringene i hele lungekulturen og påfølgende kutting av frø lungen. Selv om ELT-plattformen ikke rekapitulerer alle aspekter av innfødt cellulær organisasjon, muliggjør den lungecellekultur på et fysiologisk relevant ECM-substrat, på en måte som er tilgjengelig for mange flere laboratorier.
Fleksibiliteten til ELT-systemet er en stor fordel med denne plattformen, og bør tillate småskala lungevevskultur med et hvilket som helst antall vevstillaser, celler eller kulturmedier av interesse. Bruk av stillaser avledet fra sykt vev eller fra skademodeller kan tillate studiet av cellecelle- eller cellematriseinteraksjoner i innstillingen av sykdoms endret ECM 27,29,51. Vær imidlertid oppmerksom på at decellulariseringsprotokollen kanskje må tilpasses for å ta hensyn til matriseforskjeller mellom art52. Den beskrevne såingsstrategien kan brukes til alle celletyper, og kulturtidslinjen tilpasset forskerens behov. Som utgangspunkt bør 1 x 106 celler per stillas gi et svært cellulært vev innen 7 dager etter kultur, mens 1 x 105 totale celler resulterer i dårlig cellulæritet. I enhver tilpasning av tidslinjen skal vevskulturkassettene fjernes fra såddbadet 24 timer etter siste vevssåing. Her, med mål om å modellere noe av den cellulære kompleksiteten til lungealveolus, beskriver vi en tri-kultur recellulariseringsstrategi som støtter vedlikehold av godt differensierte neonatale AEC2s i alveolarlignende strukturer i minst 7 dager. Våre resultater viser også vellykket engraftment av både fibroblaster og endotelceller i ELTs, med vekt på den brede anvendbarheten av kultursubstratet og dets egnethet for samkulturstudier. Såing av voksne celler i ELTs kan lette modelleringen av mer quiescent alveolar strukturer, mens såing menneskelige PSC-avledede AEC2s, inkludert de med genetiske modifikasjoner, kan lette translasjonelle studier av menneskelig sykdom13,53. Generelt presenterer den nedenfra-og-opp-tilnærmingen som er aktivert av ELT-plattformen muligheten til å undersøke bidragene fra bestemte celletyper til avlesninger av interesse - for eksempel AEC2-spredning eller differensieringstilstand.
Oppsummert skisserer denne protokollen et robust system for å generere konstruert lungevev for samkulturstudier av AEC2s, fibroblaster og endotelceller i acellulære ECM lungeskive stillaser. ELTs representerer en ny 3D-kulturstrategi for primære AEC2s, som til dags dato vanligvis har stolt på mindre fysiologiske gel-type matriser for å opprettholde en godt differensiert fenotype 6,11,12. Den nåværende plattformen bygger på tidligere arbeid i repopulering av decellulariserte lungeskiver 24,25,26,27,28,29, men tilbyr flere fordeler: 1) et vevskulturkassettsystem for å lette ELT-håndtering under decellularisering, såing og kultur; 2) et tilpasset såddbad for å nøyaktig frø et kjent antall celler på hvert stykke stillas; og 3) en trekulturell reseeding strategi som muliggjør alveolar vev repopulation med epitelial, mesenchymal, og endotelceller. Dermed representerer ELTs et viktig skritt fremover mot å skape reproduserbare in vitro-modeller som fanger den cellulære og substratkompleksiteten til den innfødte alveolus og AEC2 stamcellenisjen.

Alveoli er de funksjonelle enhetene i den distale lungen, som består av et netting av gassutskiftende luftrom foret av alveolar epitelial type 1 celler (AEC1s) og type 2 celler (AEC2s). Underliggende epitel er et tett nettverk av kapillærer samt støtte mesenchyme, alt buttressed av en ekstracellulær matrise (ECM) stillas som gir både styrke og fleksibilitet til disse delikate luftsekkene1. Alveolene er også skadestedet i en rekke lungepatologier, inkludert idiopatisk lungefibrose2, akutt respiratorisk nødsyndrom3 og alvorlig koronavirussykdom-19 (COVID-19)4. Selv om arbeidet det siste tiåret har avdekket en bemerkelsesverdig plastisitet i lungeepitelet, forblir mekanismene som muliggjør distal lungereparasjon i noen sammenhenger - og som utelukker reparasjon i andre - et område med intens undersøkelse5. Utviklingen av forbedrede in vitro-plattformer for å modellere alveolus ville lette studier av alveolarbiologi, regenerering og terapeutiske behandlinger.
AEC2s fornyer seg selv og differensierer seg i AEC1s, og regnes dermed som den primære stamcellen til den distale lungen 6,7,8. Imidlertid utgjør disse cellene en spesiell utfordring for in vitro-studie gitt vanskelighetene forbundet med å dyrke primære AEC2s uten tap av fenotype9. I konvensjonell 2-dimensjonal (2D) kultur flater AEC2s ut og vedtar noen funksjoner i AEC1-lignende celler10. Derimot støtter 3D-kulturstrategier, oftest organoider, vedlikehold av differensierte funksjoner i primære AEC2s 6,11,12 og tillater langsiktig kultur av pluripotent stamcelle (PSC) -avledet AEC2s13,14. Organoider har blitt brukt til å modellere distal lungeutvikling15, virusinfeksjon11,15 og AEC2-relatert genetisk sykdom 13,16,17, noe som muliggjør viktig innsikt i AEC2 biologi og regenerering. Imidlertid består disse kulturmodellene vanligvis bare av en eller to cellulære avgrensninger, og legger inn cellene i gel-type matriser som ikke klarer å rekapitulere enten arkitekturen eller ECM-substratet til den innfødte lungealveolus.
ECM er en kritisk regulator av cellefenotype og oppførsel via molekylære, topologiske og mekaniske signaler; består av en nøkkelkomponent i vevsspesifikke nisjer som regulerer stamcelle skjebne; og fungerer som et reservoar som modulerer tilgjengeligheten av lokalt utskilte vekstfaktorer 18,19,20,21. Culturing celler på innfødt ECM kan dermed øke prediktiv kapasitet in vitro systemer for å modellere biologien til in vivo vev. Decellularisering, en prosess som fjerner cellulært materiale fra vev via vaskemidler, enzymer eller fysiske eller andre metoder, kan i stor grad bevare ECM-stillaset til et innfødt organ, når det utføres nøye22,23. Slike stillaser kan fylles på nytt med celler for 3D biomimetisk kultur. Men mens decellulariserte stillaser er mye brukt til vevsteknikkapplikasjoner, har deres bruk for rutinemessig cellekultur vært begrenset. Flere tidligere studier har rapportert decellularisering og recellularisering av lungeskiver eller små lungevevssegmenter. I tillegg til konseptgodkjenningsstudier 24,25,26, repopulated lunge skiver har blitt brukt til å studere fibroblast-matrise adhesjon27,28 og for å undersøke effekten av syke lunge matriser på fibroblast fenotype27,29. Med forbedrede teknologier tilgjengelig for å generere presisjonskuttede vevsskiver, kan decellulariserte lungeskiver tilby en praktisk og liten plattform for kulturceller, samtidig som alveolar, luftveier og vaskulære understrukturer bevares. Inkorporering av flere celletyper vil muliggjøre studier av cellecelleinteraksjoner i et fysiologisk relevant 3D-miljø. Forbedrede strategier er imidlertid nødvendig for å lette håndteringen av vev gjennom hele kulturprosessen, og for å sikre kontrollert og reproduserbar såing av vev med kjent antall celler.
Her presenterer vi en protokoll for å generere konstruerte lungevev (ELTs) ved å repopulere decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver (PCLS) med primære endotelceller, AEC2s og fibroblaster. I en tilpasning av vårt tidligere beskrevne konstruerte hjertevevssystem30 og hele lungedecellulariserings-recellulariseringsstrategier 22,31, beskriver vi prosedyrer for å kutte PCLS fra rotte lunger og å klippe skivene i gjenbrukbare vevskulturkassetter som forenkler og standardiserer nedstrøms manipulasjoner. Beskårne skiver decellulariseres for å danne acellulære ECM stillaser, som fylles opp igjen i tilpassede såddbad. Lungeskive stillaser bevarer kritiske ECM-komponenter og arkitektur, og støtter veksten av AEC2s innen multi-lineage alveolar-lignende strukturer i minst 7 dager. ELTs representerer et nytt alveolar co-kultursystem innenfor en fysiologisk relevant 3D-matrise, som skal støtte utviklingen av lungevevsteknikkstrategier, samtidig som de legger til rette for grunnleggende biologiske studier av AEC2s og alveolus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Det er behov for forbedrede 3-dimensjonale (3D) lungemodeller som rekapitulerer den arkitektoniske og cellulære kompleksiteten til den opprinnelige lungealveolus ex vivo. Nylig utviklede organoidmodeller har lagt til rette for utvidelse og studier av lungeepiteliske forfedre in vitro, men disse plattformene er vanligvis avhengige av mussvulst-avledet matrise og / eller serum, og innlemmer bare en eller to cellulære avstamninger. Her beskriver vi en protokoll for generering av konstruert lungevev (ELTs) basert på multi-lineage recellularisering av decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver (PCLS). ELTs inneholder alveolar-lignende strukturer som består av alveolar epitel, mesenchyme og endotel, innenfor et ekstracellulært matrise (ECM) substrat som ligner på innfødt lunge. For å generere vevet, blir rotte lunger oppblåst med agarose, skiver i 450 μm tykke skiver, kuttet i strimler og decellularisert. De resulterende acellulære ECM stillasene blir deretter reseeded med primære endotelceller, fibroblaster og alveolar epitelial type 2 celler (AEC2s). AEC2s kan opprettholdes i ELT-kulturen i minst 7 dager med et serumfritt, kjemisk definert vekstmedium. Gjennom vevsforberedelse og kulturprosess blir skivene klippet inn i et kassettsystem som letter håndtering og standardisert cellesåing av flere ELT-er parallelt. Disse ELTene representerer en organotypisk kulturplattform som skal legge til rette for undersøkelser av cellecelle- og cellematriseinteraksjoner i alveolus samt biokjemiske signaler som regulerer AEC2s og deres nisje.

En oversikt over prosessen med å generere ELT-er - bestående av lungeslicing, skiveklipping og decellularisering, og stillasrepopulering - presenteres i figur 3. ELT-ene som presenteres her ble dyrket ved hjelp av primærrotte lungemikrovaskulære endotelceller (se Materialfortegnende bord), neonatalrotte AEC2s og lipofibroblastberiket neonatal rotte lungefibroblaster36. AEC2s ble fersk isolert via magnetisk perlebasert sortering som tidligere beskrevet37; alternative isolasjonsprotokoller er detaljert og diskutert andre steder 38,39,40. Renhet av isolert rotte AEC2s kan vurderes via strømningscytometri for rottespesifikk AEC2 overflatemarkør RTII-7041, eller ved farging av en cytocentrifuged celleprøve for RTII-70 eller pro-surfaktantprotein C (pSPC). Rotte lungefibroblaster ble isolert fra barseldag 7-9 rottepupper i henhold til en tilpasning av en publisert protokoll42 og brukt ved passasje 1-2; alternative isolasjonsprotokoller er beskrevet andre steder 43,44. Renhet av isolerte fibroblaster kan vurderes ved farging av dyrkede eller cytocentrifuged celler for mesenchymal markør vimentin, og lipofibroblast berikelse kan vurderes via farging for Olje Rød O45.
Når lungevevet er jevnt oppblåst med agarose, og vevstykker strategisk valgt og orientert for kutting for å maksimere totalt og parenchymalt vevsområde, kan en rotte lunge gi vev for >100 alveolar ELTs. Strimler av PCLS har tilstrekkelig mekanisk integritet til å bli klippet inn i vevskassetter med få (<5%) tilfeller av rive (figur 3B).
Protokollen for decellularisering av lungeskiver er nært basert på vår tidligere publiserte hele lungedecellulariseringsprotokoll, som ved kvantitativ proteomikk ble demonstrert for å bevare mange ECM-komponenter på nivåer som ikke er vesentlig forskjellig fra de i innfødt lunge22. Decellulariserte skivestillaser bevarer alveoliens opprinnelige arkitektur, sett av hematoksylin- og eosinfarge (H&E) (figur 4A, B) og ved fasekontrastmikroskopi (figur 4C). Vi utelukker vanligvis stillaser som inneholder store luftveier eller kar (figur 4D) eller tårer, selv om førstnevnte kan inkluderes hvis de er av interesse for forskeren. Decellularisering fører til en 96% reduksjon i vev DNA-innhold målt ved en analyse for dobbeltstrenget DNA (se Tabell over materialer; 0,50 μg/mg ± 0,073 μg/mg vs. 0,018 μg/mg ± 0,0035 μg/mg i innfødt vs decellularisert vev, henholdsvis gjennomsnittlig ± SEM) (figur 5A), uten DNA synlig ved hematoksylinfarging (figur 4B). Histologisk og immunfluorescerende farging av decellulariserte stillaser avslører vedlikehold av ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV og laminin med arkitektur og mengde som ligner på det i innfødte lungeskiver (figur 5B-E). Vær oppmerksom på at kjernen i innfødt vev flekker blått/svart med trichome (for kollagen) og EVG (for elastin) flekker. Immunfluorescerende farging ble utført som beskrevet tidligere, ved hjelp av standardmetoder for farging av vev37. Antistoffene som brukes og deres respektive konsentrasjoner er oppført i tabell 4.
Vellykket repopulering av stillas fører til svært cellulære ELT-er etter 7 dager, med et alveolarlignende repopuleringsmønster synlig ved lysmikroskopi (figur 6A-C). I noen tilfeller, med svært høy cellulæritet, kan organoid-type strukturer være synlige (figur 6A, B). Mislykket vevssåing kan visualiseres ved fasekontrastmikroskopi under kultur (figur 6C). Etter å ha dyrket vevstillaser med AEC2s, fibroblaster og endotelceller, blir ELT-er tett repopulert med alveolarlignende strukturer som består av alle tre celleforingene (figur 6D, E). På dag 7 eller 8 opprettholder AEC2s cuboidal morfologi og uttrykker overflateaktivt protein-B (SPB) og lamellar kroppsprotein ABCA3, uten tegn på betydelig differensiering til AEC1s (figur 6E, F). AEC2s er svært proliferative i ELTs, som demonstrert av 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) inkorporering etter en 2 h puls ved 10 μM (figur 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk perfusjonssystem for lungeutvinning og rydding. (A) Perfusjonssystemet består av en tyngdekraftsdrevet lem, som brukes til innledende kanalisering av lungearterien under strømning; pumpedrevet lem, som brukes til å fjerne lungene effektivt etter første kannasjon. Pumpeledningen inkluderer en "pulsdemper" som demper piggene i trykket forårsaket av pumpen. Utformingen av trakeale og lungearterielle kanyler er detaljert til venstre. SNP = natriumnittroprusside. (B) Detaljer om pulsdemperenhet. BPT og silikon refererer til typer rør. (C) Stillinger av trakeale og lungearterielle kanyler plassert under lungeutvinning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figur 2: Kulturtidslinje for omforming av tri-lineage. Foreslått tidslinje for tri-lineage ELT-såing og kultur, inkludert tidspunkt for tofaset såing. Celletall for såing og kulturmedium for hver fase angis. Se detaljer om kulturmedier i tabell 3. AEC2 = alveolar epitelial type 2 celle. EC = endotelcelle. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figur 3: Skjematisk av konstruert lungevevspreparat. (A) Innfødt lungevev kuttes i skiver ved hjelp av en vibratom. (B) Presisjonskuttede lungeskiver kuttes i standardiserte 3 mm brede strimler, klippes i polytetrafluoretylen (PTFE) vevskulturkassetter, og vaskemiddel-decellularisert for å gi acellulære ekstracellulære matrise stillaser. (C) Stillaser er reseeded i spesialiserte såing bad som begrenser såing området til området av vevet, og deretter dyrket i en standard brønnplate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figur 4: Struktur av decellulariserte lungestillaser. H&E farging av innfødte (A) og decellulariserte (B) lungeskiver som viser bevaring av alveolararkitektur etter decellularisering. (C,D) Eksempler på decellulariserte ECM stillaser sett ved 5x forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi, bestående av overveiende alveolarvev (C) eller inneholder store forgreningsveier og kar (D, svarte og røde pilspisser). Skalastenger, 50 μm (A, B); 500 μm (C, D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figur 5: DNA-fjerning og matriksbevaring i decellulariserte lungestillaser. (A) Kvantifisering av DNA i innfødte og decellulariserte lungeskiver (gjennomsnitt ± SEM, n = 5). Welch tester ikke , **P < 0,01. Decell = decellularisert. (B,C) Histologisk farging av innfødte og decellulariserte lungeskiver for kollagen (B) og elastin (C). Pilspisser, elastin bevart i alveolar inngangsringer av decellularisert vev. (D,E) Immunfluorescerende farging av innfødte og decellulariserte lungeskiver for kollagen IV (D) og laminin (E). Skalastenger, 50 μm. I alle paneler skisserer stiplede bokser bildeområdet som forstørres til høyre i hvert respektive panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figur 6: Cellulær repopulering av konstruert lungevev. (A-C) Eksempler på recellulariserte ELT-er på kulturdagen 7, som visualisert under kultur ved fasekontrastmikroskopi. Recellulariseringsmønsteret speiler vevets alveolarstruktur. I noen områder med høy cellulæritet kan organoidlignende strukturer dannes (pilspisser). (A) og (B) representerer vellykket cellerepopulering, mens (C) representerer et dårlig nivå av recellularisering etter 7 dager med kultur. (D-G) Farging av recellulariserte 1000-tallet på dag 7 eller 8 av kulturen. (D) H&E farging som viser cellulær repopulering av alveolar septa. (E) Immunofluorescent farging etiketter engrafted proCollagenIα1 + fibroblaster, ABCA3 + AEC2s, og CD31 + endotelceller. (F) Vev inneholder rikelig SPB + AEC2s, men få RTI-40 (podoplanin)+ AEC1s under disse forholdene. (G) Mange AEC2-er sprer seg i ELT-er, målt ved EdU-inkorporering. Skalastenger, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Decellulariseringsløsninger. Klargjøringsdetaljer for decellulariseringsløsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 2: Decellulariseringsprotokoll. Detaljer om protokoll for decellularisering av lungeskiver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 3: Kulturmedier. Forberedelsesdetaljer for endotel- og AEC2-vekstmedier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tabell 4: Antistoffer som brukes til immunstaining. Detaljer om antistoffer og deres konsentrasjoner som brukes til immunstaining. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Tilleggsfil 1: Design for laserskjæring av vevskulturkassettrammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 2: Design for laserskjæring av vevskulturkassettklemmer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 3: Design for laserskjæring vev kultur kassett faner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 4: CAD-fil for såing bad mold base. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 5: CAD-fil for såing bad mold ring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Denne protokollen beskriver en metode for å generere reproduserbare, småskala konstruerte lungevev, ved å repopulere decellulariserte presisjonskuttede lungeskiver med alveolar epitelial type 2 celler, fibroblaster og endotelceller.

Konstruert lungevev tilberedt av decellulariserte lungeskiver

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Denne protokollen muliggjør repeterbar bruk av intakt lunge ekstracellulær matrise som et tredimensjonalt vev kultur substrat og moderat gjennomstrømning. Den største fordelen med det konstruerte lungevevssystemet er plattformens fleksibilitet. ELT-er kan tilpasses for å bruke ulike vevstillaser, celler eller kulturmedier av interesse.Når lungene er ekstrahert, fyll en 10 milliliter sprøyte med agarose og HBSS uten fenolrød. Blås opp lungene med ca. 10 milliliter luft via luftrørets kanyle, og injiser deretter umiddelbart den tilberedte agarose via luftrørets kanyle til de mest distale spissene på lungelobene er oppblåst. Hette luftrøret ved å feste den hvite hetten fra en fireveis stoppekran til den kvinnelige luerlåsen på trakealkanylen.Legg lungen i en 150 millimeter Petri-tallerken på isen slik at agaroseen kan størkne. Forbered lungeskivene i henhold til protokollen i manuskriptet, og fyll deretter en 100 millimeter Petri-tallerken med 1/3 volum PBS. Overfør kassetter og tappene til parabolen ved hjelp av tang.Hvis skivene er frosne, tin en tallerken om gangen ved å helle på romtemperatur PBS. Overfør deretter en tint skive til en 150 millimeter Petri-tallerken. Brett forsiktig ut skiven ved hjelp av fine tang eller en hemostat og aspirer forsiktig overflødig PBS fra rundt vevet.Klipp deretter en tre millimeter bred, minst ni millimeter lang stripe fra skiven ved å trykke hele lengden på et barberblad fast mot parabolen og litt gynge den fra side til side. For å feste vevsstripen inn i kassetten, flytt den over kassetten, midtstill den forsiktig for å strekke den forbi hullene i klipsene i hver ende. Plasser en fane delvis inn i hullet i den ene enden med fine tang, rett forsiktig vevet og sett den andre fanen.Til slutt, bruk tang for å trykke hver fane helt inn for å sikre vevet. Etter klipping av alle sidene, overfør den 100 millimeter store parabolen som inneholder kassettene, til en laminær strømningshette. Overfør kassetter til seks brønnplater som inneholder den første decellulariseringsløsningen ved hjelp av en buet hemostat for å gripe hakkede sider.Plasser deretter seksbrønnsplaten på en orbital shaker ved 30 RPM i 10 minutter. Aspirer væsken fra hver brønn, og erstatt den deretter med tre milliliter av den andre decellulariseringsløsningen per brønn. Plasser platen på en orbital shaker ved 30 RPM og inkuber i fem minutter.Gjenta denne prosessen med hver løsning som beskrevet i decellulariseringsprotokollen i manuskriptet. Etter den endelige skyllingen med PBS, overfør vev til sterile seksbrønnplater som inneholder fersk PBS med antibiotika og antimykotika og inkuber ved 37 grader Celsius i 48 timer. Etter sterilisering med antibiotika og antimykotika kan lungevevstillaser frøs umiddelbart eller lagres ved fire grader Celsius i opptil 30 dager.Før du bruker for kultur, inkuberer stillaser lagret på fire grader Celsius med fersk PBS og antibiotika og antimykotika over natten ved 37 grader Celsius som et ekstra steriliseringstrinn. Skyll deretter stillaser med steril PBS, fem milliliter per brønn, tre ganger, i fem minutter hver. Undersøk stillaser under et fasekontrastmikroskop ved 5X forstørrelse for å velge vev for såing.Forbered endotelcelleopphenget i endotelmiddel ved 5 millioner celler per milliliter med tilstrekkelige celler til å frø 500 000 endotelceller per stykke. Plasser autoklavede såddbad i 100 millimeter Petri-retter og overfør skyll stillasene forsiktig opp ned i såddene. Virvle forsiktig den forberedte cellefjæringen for å blande.Deretter forsiktig pipette 100 mikroliter av celler direkte på toppen av hvert vev ved foten av brønnene, pass på at du ikke skader vevet med pipettespissen. Overfør frøvevet til cellekulturinkubatoren. 24 timer etter endotelcellesåing, tilsett 900 mikroliter forhåndsvarmet kulturmedium til hver brønn ved hjelp av en manuell pipette, og returner deretter platen til inkubatoren.Etter 24 timer med cellesåing, fjern mediet og erstatt den ene milliliteren frisk endotelmedium per brønn. 72 timer etter sådd endotelceller, telle AEC2s, eller alveolar epitelial type II celler, og fibroblaster ved hjelp av et hemocytometer og forberede en 1:1 celle suspensjon i AEC2 vekst medium på 5 millioner celler per milliliter. Pipette mediet fra hvert såddbad godt og virvle forsiktig den forberedte cellefjæringen.Pipette 100 mikroliter celler direkte på toppen av hvert vev ved foten av brønnen. Overfør frøvevet til cellekulturinkubatoren. Etter to timer, tilsett 900 mikroliter for forhåndsvarmet AEC2 vekstmedium til hver brønn, og returner deretter platen til inkubatoren.Etter 24 timers kultur med AEC2s og fibroblaster, lag en 12-brønns plate med en milliliter forvarmet AEC2 vekstmedium per brønn, per kassett. Pipette 800 mikroliter medium fra hver brønn i såddet, fjern deretter kassettene fra såddbadet og overfør dem på høyre side opp til den forberedte 12-brønnsplaten, en kassett per brønn. Endre kulturmediet forsiktig ved hjelp av en glass Pasteur pipette annenhver dag for ønsket kulturvarighet.Overvåk graden av vevsrepopulering via fasekontrastmikroskopi ved 5X forstørrelse gjennom hele kulturens varighet. H- og E-farging av vevstillaser viste bevart alveolararkitektur etter decellularisering uten synlige cellekjerner. Alveolarvev ble observert da decellulariserte ekstracellulære matrisestillaser ble sett ved 5X forstørrelse ved fasekontrastmikroskopi.Store forgreningsveier og fartøy var også synlige i enkelte skiver. På dag syv av kulturen viste fasekontrastmikroskopi at mønsteret for recellularisering i konstruert lungevev emulerte vevets alveolarstruktur i tilfeller av vellykket repopulering. Dårlig recellularisering var også synlig.H og E farging på dag syv eller åtte viste repopulation av alveolar septa. Immunfluorescens stående avslørte pro-kollagen type I alfa 1-positive fibroblaster, ABCA3-positive AEC2s, CD31-positive endotelceller, ans rikelig SPB-positive AEC2s. Videre viste tymidanalysen mange prolifererende AEC2s.Denne teknikken har lagt til rette for utvikling av strategier for lungevevsteknikk og har gjort det mulig å undersøke køer som støtter type II celleproliferasjon og differensiering i alveolus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Et eksperimentelt system for å studere Mechanotransduction i Fetal lungeceller

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Bygging av Definert menneske Engineered Hjerte Vev å studere mekanismer Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generering av MGP-avledet Mouse Airway Epitelceller Bruke Decellularized Lung Stillas

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Fremstilling av mesh-formet konstruert hjertevev avledet fra menneskelige iPS-celler for In Vivo myokardreparasjon

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast avledet menneskekonstruert bindevev for screeningapplikasjoner

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Preklinisk legemiddeltesting i skalerbart 3D-konstruert muskelvev

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Disseksjon og isolering av regionspesifikt decellularisert lungevev

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...