Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Лоренцо Севанана и Хорхе Нуньеса за их работу по разработке конструкции кассеты тканевой культуры, используемой в этом протоколе, лабораторию Камински за использование их вибратома, Маурицио Кьоччоли и Джессику Ноус за помощь в нарезке легких, Элли ЛаРокко за помощь в первоначальных пилотных экспериментах и Хун Цяня за внимательное чтение протокола. Эта работа была поддержана грантами NIH F30HL143880 (K.L.L.), грантом программы подготовки ученых-медиков T32GM136651 (K.L.L.) и U01HL145567 (L.E.N.); и неограниченным исследовательским подарком от Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. является основателем и акционером Humacyte, Inc, которая является компанией регенеративной медицины. Хумацит производит инженерные кровеносные сосуды из аллогенных гладкомышечных клеток для сосудистой хирургии. Супруга L.E.N. имеет долю в Humacyte, а L.E.N. входит в Совет директоров Humacyte. Л.Е.Н. является изобретателем патентов, которые лицензированы для Humacyte и которые производят роялти для L.E.N. L.E.N. получила неограниченный исследовательский подарок для поддержки исследований в своей лаборатории в Йельском университете. Хумацит не повлиял на поведение, описание или интерпретацию выводов, содержащихся в настоящем докладе.

Альвеолы являются функциональными единицами дистального легкого, состоящими из сетки газообменных воздушных пространств, выстланных альвеолярными эпителиальными клетками типа 1 (AEC1s) и клетками типа 2 (AEC2s). В основе эпителия лежит плотная сеть капилляров, а также поддерживающая мезенхима, поддерживаемая каркасом внеклеточного матрикса (ECM), который обеспечивает как прочность, так и гибкость этим тонким воздушным мешочкам1. Альвеолы также являются местом повреждения при многочисленных патологиях легких, включая идиопатический легочный фиброз2, острый респираторный дистресс-синдром3 и тяжелую коронавирусную болезнь-19 (COVID-19)4. Хотя работа за последнее десятилетие выявила замечательную пластичность в эпителии легких, механизмы, которые позволяют дистальное восстановление легких в некоторых условиях - и которые исключают восстановление в других - остаются областью интенсивного исследования5. Разработка улучшенных платформ in vitro для моделирования альвеол облегчит исследования альвеолярной биологии, регенерации и терапии.
AEC2s самообновляются и дифференцируются в AEC1s, и, таким образом, считаются первичной стволовой клеткой дистального легкого 6,7,8. Тем не менее, эти клетки представляют собой особую проблему для исследования in vitro, учитывая трудности, связанные с культивированием первичных AEC2 без потери фенотипа9. В обычной 2-мерной (2D) культуре AEC2s сплющиваются и принимают некоторые особенности AEC1-подобных клеток10. Напротив, стратегии 3D-культур, чаще всего органоиды, поддерживают поддержание дифференцированных признаков в первичных AEC2s 6,11,12 и позволяют долгосрочную культивирование AEC2s13,14, полученной из плюрипотентных стволовых клеток (PSC). Органоиды были использованы для моделирования дистального развития легких15, вирусной инфекции 11,15 и связанных с AEC2 генетических заболеваний 13,16,17, что позволяет получить важную информацию о биологии и регенерации AEC2. Однако эти модели культур обычно содержат только одну или две клеточные линии и встраивают клетки в матрицы гелевого типа, которые не могут повторить ни архитектуру, ни СУБСТРАТ ECM нативной альвеолы легких.
ECM является критическим регулятором фенотипа и поведения клеток с помощью молекулярных, топологических и механических сигналов; содержит ключевой компонент тканеспецифических ниш, регулирующих судьбу стволовых клеток; и служит резервуаром, модулирующим наличие локально секретируемых факторов роста 18,19,20,21. Таким образом, культивирование клеток на нативном ECM может увеличить прогностическую способность систем in vitro моделировать биологию тканей in vivo. Децеллюляризация, процесс, который удаляет клеточный материал из тканей с помощью моющих средств, ферментов или физических или других методов, может в значительной степени сохранить каркас ECM нативного органа при тщательном выполнении22,23. Такие каркасы могут быть повторно заселены клетками для 3D биомиметической культуры. Однако, в то время как децеллюляризованные каркасы широко используются для тканевой инженерии, их использование для рутинной клеточной культуры было ограничено. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось о децеллюляризации и рецеллюляризации срезов легких или небольших сегментов легочной ткани. В дополнение к доказательствам концепцииисследований 24,25,26, повторно заселенные срезы легких были использованы для изучения адгезии фибробласт-матрикс 27,28 и для изучения влияния больных матриц легких на фенотип фибробластов 27,29. Благодаря улучшенным технологиям, доступным для создания прецизионных срезов тканей, децеллюляризированные срезы легких могут предложить удобную и мелкомасштабную платформу для культивирования клеток, сохраняя при этом альвеолярные, дыхательные и сосудистые субструктуры. Включение нескольких типов клеток позволит проводить исследования клеточных взаимодействий в физиологически значимой 3D-среде. Тем не менее, необходимы улучшенные стратегии для облегчения обработки тканей на протяжении всего процесса культивирования и для обеспечения контролируемого и воспроизводимого посева тканей известным количеством клеток.
Здесь мы представляем протокол для генерации инженерных легочных тканей (ELT) путем повторного заселения децеллюляризованных прецизионных срезов легких (PCLS) первичными эндотелиальными клетками, AEC2 и фибробластами. В адаптации нашей ранее описанной инженерной системысердечной ткани 30 и стратегий децеллюляризации-рецеллюляризации всего легкого22,31 мы описываем процедуры по вырезанию PCLS из легких крыс и обрезанию срезов в многоразовые кассеты культуры тканей, которые упрощают и стандартизируют последующие манипуляции. Обрезанные ломтики децеллюляризируются с образованием бесклеточных каркасов ECM, которые повторно заполняются в специальных посевных ваннах. Каркасы среза легких сохраняют критические компоненты и архитектуру ECM и поддерживают рост AEC2 в многолинейных альвеолярных структурах в течение не менее 7 дней. ELT представляют собой новую альвеолярную кокультурную систему в физиологически значимой 3D-матрице, которая должна поддерживать разработку стратегий инженерии легочной ткани, одновременно облегчая основные биологические исследования AEC2s и альвеол.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Существует потребность в улучшенных 3-мерных (3D) моделях легких, которые повторяют архитектурную и клеточную сложность нативной альвеолы легких ex vivo. Недавно разработанные органоидные модели облегчили расширение и изучение предшественников эпителия легких in vitro, но эти платформы обычно полагаются на матрицу и / или сыворотку, полученную из опухоли мыши, и включают только одну или две клеточные линии. Здесь мы описываем протокол генерации инженерных легочных тканей (ELT), основанный на многолинейной рецеллюляризации децеллюляризированных прецизионных срезов легких (PCLS). ELT содержат альвеоляроподобные структуры, включающие альвеолярный эпителий, мезенхиму и эндотелий, в субстрате внеклеточного матрикса (ECM), очень напоминающем субстрат нативного легкого. Для генерации тканей легкие крыс раздувают агарозой, нарезают на ломтики толщиной 450 мкм, разрезают на полоски и децеллюляризируют. Полученные бесклеточные каркасы ECM затем пересеивают первичными эндотелиальными клетками, фибробластами и альвеолярными эпителиальными клетками типа 2 (AEC2s). AEC2s можно поддерживать в культуре ELT в течение не менее 7 дней с несывороточной, химически определенной питательной средой. На протяжении всего процесса подготовки ткани и культивирования срезы обрезаются в кассетную систему, которая облегчает обработку и стандартизированное посев клеток нескольких ELT параллельно. Эти ELT представляют собой органотипическую культуральную платформу, которая должна облегчить исследования клеточно-клеточных и клеточно-матричных взаимодействий в альвеоле, а также биохимических сигналов, регулирующих AEC2 и их нишу.

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Этот протокол описывает метод получения воспроизводимых, мелкомасштабных инженерных легочных тканей путем повторного заселения децеллюляризованных прецизионных срезов легких альвеолярными эпителиальными клетками типа 2, фибробластами и эндотелиальными клетками.

Инженерные легочные ткани, полученные из децеллюляризированных срезов легких

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Этот протокол позволяет повторно использовать интактный внеклеточный матрикс легких в качестве трехмерного субстрата культуры тканей и умеренную пропускную способность. Основным преимуществом инженерной системы легочной ткани является гибкость платформы. ELT могут быть адаптированы для использования различных тканевых каркасов, клеток или культуральных сред, представляющих интерес.Как только легкие будут извлечены, заполните 10-миллилитровый шприц агарозой и HBSS без фенол-красного цвета. Надувайте легкие примерно 10 миллилитрами воздуха через канюлю трахеи, затем немедленно вводите приготовленную агарозу через канюлю трахеи до тех пор, пока не будут раздуты самые дистальные кончики долей легких. Закройте трахею, прикрепив белый колпачок от четырехстороннего запорного крана к женскому замку трахеи.Поместите легкое в 150-миллиметровую чашку Петри на льду, чтобы агароза затвердела. Подготовьте ломтики легких согласно протоколу в рукописи, а затем заполните 100-миллиметровую чашку Петри 1/3 объемом PBS. Переложите кассеты и вкладки на блюдо с помощью щипцов.Если ломтики заморожены, разморозьте по одному блюду за раз, вылив на PBS комнатной температуры. Затем переложите размороженный ломтик на 150-миллиметровую чашку Петри. Аккуратно разверните срез с помощью тонких щипцов или гемостата и осторожно аспирируйте избыток PBS вокруг ткани.Затем вырежьте из среза полоску шириной три миллиметра, не менее девяти миллиметров, плотно прижав по всей длине лезвие бритвы к блюду и слегка раскачивая его из стороны в сторону. Чтобы зажать полоску ткани в кассете, поместите ее над кассетой, осторожно центрируя ее, чтобы пройти мимо отверстий в зажимах на обоих концах. Поместите вкладку частично в отверстие на одном конце с мелкими щипцами, аккуратно выпрямите ткань и установите вторую вкладку.Наконец, используйте щипцы, чтобы полностью вдавить каждую вкладку, чтобы закрепить ткань. После обрезки всех сторон перенесите 100-миллиметровую тарелку, содержащую кассеты, на ламинарный вытяжку. Переложите кассеты на шестилуночные пластины, содержащие первый раствор для децеллюляризации, используя изогнутый гемостат для захвата зубчатых сторон.Затем поместите шестилуночную пластину на орбитальный шейкер при 30 оборотах в минуту в течение 10 минут. Аспирируйте жидкость из каждой лунки, затем замените ее тремя миллилитрами второго раствора децеллюляризации на лунку. Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 30 оборотов в минуту и высиживайте в течение пяти минут.Повторите этот процесс с каждым решением, как описано в протоколе децеллюляризации в рукописи. После окончательного промывания PBS переложите ткани на стерильные шестилуночные пластины, содержащие свежий PBS с антибиотиками и антимикотиками, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов. После стерилизации антибиотиками и антимикотиками каркасы легочной ткани можно сразу же засеять или хранить при четырех градусах Цельсия до 30 дней.Перед использованием для культивирования инкубируйте каркасы, хранящиеся при четырех градусах Цельсия со свежим PBS и антибиотиками и антимикотиками в течение ночи при 37 градусах Цельсия в качестве дополнительной стадии стерилизации. Затем промойте каркасы стерильным PBS, пять миллилитров на лунку, три раза, в течение пяти минут каждый. Исследуйте каркасы под фазово-контрастным микроскопом с 5-кратным увеличением, чтобы выбрать ткани для посева.Приготовьте суспензию эндотелиальных клеток в эндотелиальной среде со скоростью 5 миллионов клеток на миллилитр с достаточным количеством клеток для семени 500 000 эндотелиальных клеток на срез. Поместите автоклавные семенные ванны в 100-миллиметровую чашку Петри и аккуратно переложите ополаскиватели вверх ногами в посевные ванны. Аккуратно закрутите приготовленную клеточную суспензию, чтобы перемешать.Затем аккуратно пипетку 100 микролитров клеток непосредственно поверх каждой ткани у основания лунок, следя за тем, чтобы не повредить ткань кончиком пипетки. Перенесите засеянные ткани в инкубатор клеточной культуры. Через 24 часа после посева эндотелиальных клеток добавьте 900 микролитров предварительно подогретой питательной среды в каждую лунку с помощью ручной пипетки, затем верните пластину в инкубатор.После 24 часов посева клеток удалите среду и замените один миллилитр свежей эндотелиальной среды на лунку. Через 72 часа после посева эндотелиальных клеток подсчитайте AEC2s, или альвеолярные эпителиальные клетки типа II, и фибробласты с помощью гемоцитометра и приготовьте клеточную суспензию 1:1 в питательной среде AEC2 со скоростью 5 миллионов клеток на миллилитр. Пипетку из каждой посевной ванны хорошо и аккуратно закрутить подготовленную клеточную суспензию.Пипетка 100 микролитров клеток непосредственно поверх каждой ткани у основания лунки. Перенесите засеянные ткани в инкубатор клеточной культуры. Через два часа добавьте в каждую лунку 900 микролитров предварительно подогретой питательной среды AEC2, затем верните пластину в инкубатор.После 24 часов культивирования с AEC2s и фибробластами приготовьте 12-луночную пластину с одним миллилитром предварительно нагретой питательной среды AEC2 на каждую лунку на кассету. Пипетка 800 микролитров среды из каждого колодца посевной ванны, затем извлекает кассеты из посевной ванны и переносит их правой стороной вверх к подготовленной 12-луночной пластине, по одной кассете на лунку. Тщательно меняйте культуральную среду, используя стеклянную пипетку Пастера через день в течение желаемой продолжительности культуры.Мониторинг степени репопуляции тканей с помощью фазово-контрастной микроскопии при 5-кратном увеличении на протяжении всего периода культивирования. H и E окрашивание тканевых каркасов показало сохранение альвеолярной архитектуры после децеллюляризации без видимых клеточных ядер. Альвеолярная ткань наблюдалась, когда децеллюляризированные внеклеточные матричные каркасы рассматривались при 5-кратном увеличении с помощью фазово-контрастной микроскопии.Большие разветвленные дыхательные пути и суда также были видны на некоторых срезах. На седьмой день культуры фазово-контрастная микроскопия показала, что картина рецеллюляризации в инженерных тканях легких эмулирует альвеолярную структуру тканей в случаях успешной репопуляции. Также была видна плохая рецеллюляризация.Окрашивание H и E на седьмой или восьмой день показало повторное заселение альвеолярных перегородок. В стойке иммунофлуоресценции выявлены проколлагеновые альфа-1-положительные фибробласты I типа, ABCA3-положительные AEC2s, CD31-положительные эндотелиальные клетки, а также обильные SPB-положительные AEC2. Кроме того, анализ тимидина показал много распространяющихся AEC2.Этот метод облегчил разработку стратегий для инженерии легочной ткани и позволил исследовать очереди, поддерживающие пролиферацию и дифференцировку клеток типа II в альвеоле.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Порядок легких инженерных

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Экспериментальная система по изучению механотрансдукции в эмбриональные клетки легких

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Комбинированный 3D Tissue Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; В Silico</em&gt; Lung Опухоль модель для прогнозирования эффективности наркотиков в конкретных мутационные Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Генерация ESC происхождения мыши эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием легких Decellularized Строительные леса

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Внутрисердечная боковая стрельба Световой катетер для мониторинга клеточного метаболизма с помощью трансмуральной абсорбции спектроскопии Перфизуд млекопитающих сердец

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Подготовка сетчатой формы инженерных сердечных тканей, полученных из человеческих клеток iPS для ремонта миокарда In Vivo

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Фибробласт, полученный из искусственной соединительной ткани человека для скрининга

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Доклиническое тестирование лекарств в масштабируемых 3D-инженерных мышечных тканях

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Диссекция и выделение регионоспецифической децеллюляризированной ткани легких

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...