Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
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Los autores desean agradecer a Lorenzo Sewanan y Jorge Núñez por su trabajo desarrollando el diseño de casete de cultivo de tejidos utilizado en este protocolo, al laboratorio Kaminski por el uso de su vibratomo, Maurizio Chioccioli y Jessica Nouws por su ayuda con el corte pulmonar, a Allie LaRocco por la asistencia con los experimentos piloto iniciales y a Hong Qian por la lectura cuidadosa del protocolo. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH F30HL143880 (K.L.L.), la Beca de Capacitación del Programa de Capacitación de Científicos Médicos T32GM136651 (K.L.L.) y U01HL145567 (L.E.N.); y por un regalo de investigación sin restricciones de Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. es fundador y accionista de Humacyte, Inc, que es una compañía de medicina regenerativa. El humacite produce vasos sanguíneos modificados a partir de células alogénicas del músculo liso para la cirugía vascular. El cónyuge de L.E.N. tiene equidad en Humacyte, y L.E.N. es miembro de la Junta Directiva de Humacyte. L.E.N. es una inventora de patentes que tienen licencia para Humacyte y que producen regalías para L.E.N. L.E.N. ha recibido un regalo de investigación sin restricciones para apoyar la investigación en su laboratorio en Yale. Humacyte no influyó en la conducta, descripción o interpretación de los hallazgos de este informe.

Este artículo describe el uso de cortes pulmonares de corte de precisión descelularizados como plataforma para generar tejidos pulmonares diseñados in vitro, que contienen estructuras alveolares de múltiples linajes. Al combinar estrategias que desarrollamos previamente para repoblar andamios pulmonares ecm acelulares de alta fidelidad para ingeniería pulmonar completa22,31, con nuestro robusto sistema para cultivar tejidos cardíacos diseñados a pequeña escala30, este protocolo permite el uso de ECM pulmonar fisiológicamente relevante como sustrato de cultivo de tejidos, de una manera repetible y de rendimiento moderado.
Los métodos presentados aquí detallan la preparación del andamio ELT de los pulmones de rata, que son fácilmente alcanzables, se pueden extraer en bloque con acceso directo a las vías respiratorias intactas para la inflación de agarosa, y son de mayor tamaño que el pulmón de ratón. Sin embargo, cualquier tejido pulmonar que se pueda inflar con agarosa y cortes de rendimiento de al menos 9 mm de longitud se puede utilizar dentro de este sistema. Independientemente de la fuente de tejido, la inflación uniforme del tejido pulmonar con agarosa es el paso más crítico para garantizar el éxito del corte de tejido aguas abajo, el recorte y el manejo del tejido. El tejido pulmonar poco inflado tiende a no cortarse limpiamente, mientras que el tejido sobreinflado puede desgarrarse durante el recorte. Después de la gelificación de la agarosa, las regiones de tejido adecuadamente infladas son firmes, pero proporcionan un poco de donación cuando se presionan suavemente con fórceps. Para los pulmones de rata intactos, encontramos que la preinflación de los pulmones extraídos con aire varias veces, seguida de la inflación de agarosa tan pronto como sea posible después de la extracción, da como resultado los mejores resultados de corte y la mejor calidad de los andamios de tejido resultantes. El volumen apropiado de agarosa debe optimizarse empíricamente; para un pulmón de rata, el volumen requerido para inflar el pulmón a la capacidad pulmonar total es de aproximadamente 30 ml / kg de masa animal (por ejemplo, 10,5 ml de agarosa para los pulmones de una rata de 350 g). Para los tejidos pulmonares resecados más grandes con un acceso menos directo a las vías respiratorias (como los de donantes humanos), puede ser necesaria una solución de problemas adicional para inflar el tejido a través de un bronquio32. Durante el corte pulmonar posterior, la selección y orientación del tejido en el émbolo es otro paso importante para 1) garantizar que las rodajas sean lo suficientemente grandes como para generar tiras de tejido que se puedan cortar en casetes de cultivo de tejidos y 2) maximizar el área de tejido parenquimatoso (alveolar), excluyendo las vías respiratorias o vasos grandes.
Recortar el PCLS en casetes de cultivo de tejidos puede ser un paso desafiante inicialmente, pero los casetes simplifican en gran medida el manejo de tejidos durante la descelularización y la siembra. Dos problemas potenciales que pueden surgir son el desgarro del tejido (ya sea durante el proceso de recorte o durante la descelularización), o el posicionamiento del tejido en los clips que resulta en una siembra deficiente aguas abajo (por ejemplo, sin siembra o siembra justo en los extremos). El desgarro puede ser el resultado de un sobreinflado de agarosa, un estiramiento excesivo del tejido durante la inserción de la pestaña o dejar muy poco voladizo para proporcionar un agarre adecuado del tejido al insertar las pestañas. Tenga en cuenta que las rodajas que se desgarran en un extremo del clip pueden sembrarse con éxito, sin embargo, son difíciles de visualizar bajo el microscopio durante el cultivo, ya que el tejido no es plano. La siembra de tejido deficiente (como la de la Figura 6C) es probablemente el resultado de que la rebanada no se encuentre plana entre los dos clips y, por lo tanto, haga un contacto deficiente con la base del baño de siembra cuando se voltea boca abajo. Otra posible causa es el asiento inadecuado del cassette en el fondo del pozo del baño de siembra. En términos de recorte, aplique un poco más de tensión en el tejido al colocar el segundo clip para ayudarlo a que quede plano. Algunas rebanadas tienen una ligera concavidad; en estos casos, recorte la rebanada con el lado convexo hacia arriba. Con la práctica, generalmente experimentamos siembra fallida con menos del 2% de las rebanadas.
Una limitación de este protocolo es el requisito de que algunos equipos especializados, un cortador láser y una impresora 3D, generen los materiales iniciales para la preparación de ELT. Sin embargo, una vez que se crean los casetes de cultivo de tejidos y los baños de siembra, no se requieren materiales especiales adicionales. Los pasos de corte pulmonar y descelularización de la preparación del andamio ELT consumen un tiempo moderado; sin embargo, estos pasos pueden realizarse con anticipación o en números suficientes para prepararse para múltiples experimentos al mismo tiempo. Muchos PCLS (>100 si se optimizan para regiones parenquimatosas) se pueden cortar de un solo pulmón y congelar para su uso posterior. Si bien un solo ciclo de congelación-descongelación puede causar daños ultraestructurales menores a la ECM46, incluso se ha demostrado que múltiples ciclos de congelación-descongelación no causan una pérdida significativa en ecM 23,47. El PCLS también se puede recortar y descelularizar antes de un experimento, para ser utilizado dentro de un mes. (En particular, el protocolo de descelularización descrito se puede lograr en aproximadamente 6 horas, lo que representa una ventaja significativa sobre los métodos descritos anteriormente que requieren un día o más27,28). Una vez que se preparan los andamios, el proceso de siembra celular es simple y rápido, y el cultivo de ELT no requiere técnicas especializadas.
Una advertencia del método ELT descrito es la falta de siembra específica de la región, es decir, la entrega de AEC2 específicamente al espacio alveolar, o células endoteliales específicamente al espacio vascular. Sin embargo, aunque las células simplemente se siembran en la parte superior de los andamios de tejido, el patrón de recelularización no es aleatorio, con cierta apariencia de organización similar a la alveolar, incluidos los anillos epiteliales. Sospechamos que las interacciones célula-célula, así como las diferencias locales en la composición y geometría de ecM20,21, probablemente contribuyen a los patrones de recelularización observados. En apoyo de esta hipótesis, un estudio publicado anteriormente, en el que los fibroblastos se sembraron no específicamente en rodajas pulmonares descelularizadas, demostró que el patrón de repoblación tisular y los fenotipos celulares asociados variaron significativamente según la región microscópica del tejido y la fuente de andamio ECM (por ejemplo, sanos versus enfermos)27. También se observó que los fibroblastos invaden el intersticio, la ubicación en la que residen en el tejido pulmonar nativo 1,27. El método alternativo primario que podemos imaginar para cultivar células en rodajas pulmonares de una manera verdaderamente específica de la región implicaría sembrar pulmones descelularizados intactos a través de las vías respiratorias 31,48 y compartimentos vasculares49,50, y luego cortar el tejido recelularizado. Sin embargo, esta alternativa 1) es significativamente más costosa, intensiva en tiempo y recursos; 2) es un rendimiento más bajo; 3) requiere un mayor número de animales; y 4) se asocia con un mayor riesgo de contaminación debido a los desafíos del cultivo de pulmón entero y el posterior corte del pulmón sembrado. Si bien no recapitula todos los aspectos de la organización celular nativa, la plataforma ELT permite el cultivo de células pulmonares en un sustrato de ECM fisiológicamente relevante, de una manera que es accesible para muchos más laboratorios.
La flexibilidad del sistema ELT es una gran ventaja de esta plataforma, y debe permitir el cultivo de tejido pulmonar a pequeña escala con cualquier número de andamios de tejido, células o medios de cultivo de interés. El uso de andamios derivados de tejidos enfermos o de modelos de lesiones puede permitir el estudio de las interacciones célula-célula o célula-matriz en el contexto de la ECM alterada por la enfermedad 27,29,51. Sin embargo, tenga en cuenta que el protocolo de descelularización puede necesitar ser adaptado para tener en cuenta las diferencias de la matriz entre las especies52. La estrategia de siembra descrita se puede utilizar para cualquier tipo de célula, y la línea de tiempo de cultivo se adapta a las necesidades del investigador. Como punto de partida, 1 x 106 células por andamio debe producir un tejido altamente celular dentro de los 7 días posteriores al cultivo, mientras que 1 x 105 células totales dan como resultado una celularidad deficiente. En cualquier adaptación de la línea de tiempo, los casetes de cultivo de tejidos deben retirarse del baño de siembra 24 h después de la última siembra de tejidos. Aquí, con el objetivo de modelar parte de la complejidad celular del alvéolo pulmonar, describimos una estrategia de recelularización de tres cultivos que apoya el mantenimiento de AEC2 neonatales bien diferenciadas en estructuras similares a las alveolares durante al menos 7 días. Nuestros resultados también demuestran el injerto exitoso de fibroblastos y células endoteliales dentro de los ELT, enfatizando la amplia aplicabilidad del sustrato de cultivo y su idoneidad para estudios de cocultivo. La siembra de células adultas en ELT puede facilitar el modelado de estructuras alveolares más inactivas, mientras que la siembra de AEC2 derivadas de PSC humanos, incluidas aquellas con modificaciones genéticas, podría facilitar los estudios traslacionales de enfermedades humanas13,53. En general, el enfoque de abajo hacia arriba habilitado por la plataforma ELT presenta la oportunidad de investigar las contribuciones de tipos de células particulares a lecturas de interés, como la proliferación de AEC2 o el estado de diferenciación.
En resumen, este protocolo describe un sistema robusto para generar tejidos pulmonares diseñados para estudios de cocultivo de AEC2, fibroblastos y células endoteliales dentro de andamios de corte pulmonar ECM acelular. Los ELT representan una nueva estrategia de cultivo 3D para los AEC2 primarios, que hasta la fecha se han basado típicamente en matrices de tipo gel menos fisiológicas para mantener un fenotipobien diferenciado 6,11,12. La plataforma actual se basa en trabajos previos en la repoblación de rodajas pulmonares descelularizadas 24,25,26,27,28,29, pero ofrece varias ventajas: 1) un sistema de casete de cultivo de tejidos para facilitar el manejo de ELT durante la descelularización, siembra y cultivo; 2) un baño de siembra personalizado para sembrar con precisión un número conocido de células en cada andamio de rebanadas; y 3) una estrategia de resiembra de tricultivo que permite la repoblación de tejido alveolar con células epiteliales, mesenquimales y endoteliales. Por lo tanto, los ELT representan un importante paso adelante hacia la creación de modelos reproducibles in vitro que capturan la complejidad celular y de sustrato del alvéolo nativo y el nicho de células madre AEC2.

Los alvéolos son las unidades funcionales del pulmón distal, que comprenden una malla de espacios aéreos de intercambio de gases revestidos por células epiteliales alveolares tipo 1 (AEC1) y células tipo 2 (AEC2). Detrás del epitelio hay una densa red de capilares, así como un mesénquima de soporte, todo reforzado por un andamio de matriz extracelular (ECM) que proporciona fuerza y flexibilidad a estos delicados sacos de aire1. Los alvéolos también son el sitio de lesión en numerosas patologías pulmonares, incluida la fibrosis pulmonar idiopática2, el síndrome de dificultad respiratoria aguda3 y la enfermedad grave por coronavirus-19 (COVID-19)4. Aunque el trabajo realizado durante la última década ha descubierto una notable plasticidad dentro del epitelio pulmonar, los mecanismos que permiten la reparación pulmonar distal en algunos entornos, y que impiden la reparación en otros, siguen siendo un área de intensa investigación5. El desarrollo de plataformas in vitro mejoradas para modelar el alvéolo facilitaría los estudios de biología alveolar, regeneración y terapéutica.
Los AEC2 se autorrenuevan y se diferencian en AEC1, y por lo tanto se consideran la célula madre primaria del pulmón distal 6,7,8. Sin embargo, estas células plantean un desafío particular para el estudio in vitro dadas las dificultades asociadas con el cultivo de AEC2 primarios sin una pérdida del fenotipo9. En el cultivo convencional de 2 dimensiones (2D), los AEC2 se aplanan y adoptan algunas características de las células similares a AEC110. Por el contrario, las estrategias de cultivo 3D, más comúnmente organoides, apoyan el mantenimiento de características diferenciadas en AEC2 primarios 6,11,12 y permiten el cultivo a largo plazo de AEC2 derivados de células madre pluripotentes (PSC)13,14. Los organoides se han utilizado para modelar el desarrollo pulmonar distal15, la infección viral11,15 y la enfermedad genética relacionada con AEC2 13,16,17, lo que permite obtener información importante sobre la biología y la regeneración de AEC2. Sin embargo, estos modelos de cultivo generalmente comprenden solo uno o dos linajes celulares, e incrustan las células en matrices de tipo gel que no logran recapitular ni la arquitectura ni el sustrato de ECM del alvéolo pulmonar nativo.
El ECM es un regulador crítico del fenotipo y el comportamiento celular a través de señales moleculares, topológicas y mecánicas; comprende un componente clave de nichos específicos de tejidos que regulan el destino de las células madre; y sirve como reservorio que modula la disponibilidad de factores de crecimiento secretados localmente 18,19,20,21. Por lo tanto, el cultivo de células en ECM nativa puede aumentar la capacidad predictiva de los sistemas in vitro para modelar la biología de los tejidos in vivo. La descelularización, un proceso que elimina el material celular de los tejidos a través de detergentes, enzimas o métodos físicos o de otro tipo, puede preservar en gran parte el andamiaje de ECM de un órgano nativo, cuando se realiza cuidadosamente22,23. Tales andamios se pueden repoblar con células para el cultivo biomimético 3D. Sin embargo, mientras que los andamios descelularizados son ampliamente utilizados para aplicaciones de ingeniería de tejidos, su uso para el cultivo celular de rutina ha sido limitado. Varios estudios previos han reportado la descelularización y recelularización de cortes pulmonares o pequeños segmentos de tejido pulmonar. Además de los estudios de prueba de concepto 24,25,26, se han utilizado lonchas pulmonares repobladas para estudiar la adhesión fibroblasto-matriz 27,28 e investigar el efecto de las matrices pulmonares enfermas sobre el fenotipo27,29 de fibroblastos. Con tecnologías mejoradas disponibles para generar cortes de tejido cortados con precisión, los cortes de pulmón descelularizados podrían ofrecer una plataforma conveniente y a pequeña escala con la que cultivar células, al tiempo que preservan las subestructuras alveolares, respiratorias y vasculares. La incorporación de múltiples tipos de células permitiría estudios de interacciones célula-célula dentro de un entorno 3D fisiológicamente relevante. Sin embargo, se necesitan estrategias mejoradas para facilitar el manejo de los tejidos durante todo el proceso de cultivo y para garantizar la siembra controlada y reproducible de tejidos con un número conocido de células.
Aquí, presentamos un protocolo para generar tejidos pulmonares diseñados (ELT) mediante la repoblación de rodajas pulmonares descelularizadas cortadas con precisión (PCLS) con células endoteliales primarias, AEC2 y fibroblastos. En una adaptación de nuestro sistema de tejido cardíaco de ingeniería previamente descrito30 y las estrategias de descelularización-recelularización pulmonar completa22,31, describimos procedimientos para cortar el PCLS de los pulmones de rata y para cortar las rebanadas en casetes de cultivo de tejidos reutilizables que simplifican y estandarizan las manipulaciones posteriores. Las rodajas recortadas se descelularizan para formar andamios ecm acelulares, que se repoblan en baños de siembra personalizados. Los andamios de corte pulmonar preservan los componentes y la arquitectura críticos de ECM, y apoyan el crecimiento de AEC2 dentro de estructuras alveolares de múltiples linajes durante al menos 7 días. Los ELT representan un nuevo sistema de cocultivo alveolar dentro de una matriz 3D fisiológicamente relevante, que debería apoyar el desarrollo de estrategias de ingeniería de tejidos pulmonares, al tiempo que facilita los estudios biológicos básicos de AEC2 y el alvéolo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Existe la necesidad de mejorar los modelos pulmonares en 3 dimensiones (3D) que recapitulan la complejidad arquitectónica y celular del alvéolo pulmonar nativo ex vivo. Los modelos organoides desarrollados recientemente han facilitado la expansión y el estudio de progenitores epiteliales pulmonares in vitro, pero estas plataformas generalmente se basan en la matriz y / o suero derivado de tumores de ratón, e incorporan solo uno o dos linajes celulares. Aquí, describimos un protocolo para generar tejidos pulmonares diseñados (ELT) basado en la recelularización multilinaje de cortes pulmonares de corte de precisión descelularizados (PCLS). Los ELT contienen estructuras similares a las alveolares que comprenden epitelio alveolar, mesénquima y endotelio, dentro de un sustrato de matriz extracelular (ECM) muy parecido al del pulmón nativo. Para generar los tejidos, los pulmones de las ratas se inflan con agarosa, se cortan en rodajas de 450 μm de espesor, se cortan en tiras y se descelularizan. Los andamios de ECM acelulares resultantes se vuelven a sembrar con células endoteliales primarias, fibroblastos y células epiteliales alveolares tipo 2 (AEC2). Los AEC2 se pueden mantener en cultivo con ELT durante al menos 7 días con un medio de crecimiento libre de suero y definido químicamente. A lo largo del proceso de preparación y cultivo de tejidos, las rodajas se recortan en un sistema de casete que facilita el manejo y la siembra celular estandarizada de múltiples ELT en paralelo. Estos ELT representan una plataforma de cultivo organotípica que debería facilitar las investigaciones de las interacciones célula-célula y célula-matriz dentro del alvéolo, así como las señales bioquímicas que regulan los AEC2 y su nicho.

En la Figura 3 se presenta una visión general del proceso para generar ELT, que comprende el corte pulmonar, el recorte y la descelularización de cortes, y la repoblación de andamios. Los ELT aquí presentados se cultivaron utilizando células endoteliales microvasculares primarias de pulmón de rata (ver Tabla de Materiales), AEC2 de rata neonatal y fibroblastos pulmonares de rata neonatal enriquecidos con lipofibroblastos36. Los AEC2 fueron recién aislados mediante clasificación magnética basada en perlas como se describió anteriormente37; se han detallado y discutido protocolos alternativos de aislamiento en otros lugares 38,39,40. La pureza de los AEC2 aislados de rata se puede evaluar mediante citometría de flujo para el marcador de superficie AEC2 específico de la rata RTII-7041, o mediante la tinción de una muestra de células citocentrifugadas para RTII-70 o proteína prosurfactante C (pSPC). Los fibroblastos pulmonares de rata se aislaron de cachorros de rata postnatales de día 7-9 de acuerdo con una adaptación de un protocolo publicado42 y se utilizaron en el pasaje 1-2; en otra parte se han descrito protocolos alternativos de aislamiento43,44. La pureza de los fibroblastos aislados se puede evaluar mediante la tinción de células cultivadas o citocentrifugadas para el marcador mesenquimal vimentina, y el enriquecimiento de lipofibroblastos se puede evaluar mediante tinción para Oil Red O45.
Cuando el tejido pulmonar se infla uniformemente con agarosa y las piezas de tejido se seleccionan estratégicamente y se orientan para el corte a fin de maximizar el área de tejido total y parenquimatoso, un pulmón de rata puede producir tejido para > 100 ELT alveolares. Las tiras de PCLS exhiben suficiente integridad mecánica para ser enganchadas en casetes de tejido con pocos (<5%) casos de desgarro (Figura 3B).
El protocolo para descelularizar las rebanadas pulmonares se basa estrechamente en nuestro protocolo de descelularización pulmonar completa publicado anteriormente, que mediante proteómica cuantitativa se demostró que preserva muchos componentes de ECM a niveles no significativamente diferentes de los del pulmón nativo22. Los andamios de rodajas descelularizados preservan la arquitectura nativa de los alvéolos, vista por tinción de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 4A, B) y por microscopía de contraste de fase (Figura 4C). Por lo general, excluimos los andamios que contienen vías respiratorias o vasos grandes (Figura 4D) o lágrimas, aunque los primeros pueden incluirse si son de interés para el investigador. La descelularización conduce a una reducción del 96% en el contenido de ADN tisular medido por un ensayo para ADN de doble cadena (ver Tabla de Materiales; 0.50 μg / mg ± 0.073 μg / mg vs 0.018 μg / mg ± 0.0035 μg / mg en tejido nativo vs descelularizado, respectivamente, promedio ± SEM) (Figura 5A), sin ADN visible por tinción de hematoxilina (Figura 4B). La tinción histológica e inmunofluorescente de andamios descelularizados revela el mantenimiento de las proteínas ECM colágeno, elastina, colágeno IV y laminina con una arquitectura y cantidad similar a la de las rodajas pulmonares nativas (Figura 5B-E). Tenga en cuenta que los núcleos de los tejidos nativos se tiñen de azul / negro con tinciones de tricoma (para colágeno) y EVG (para elastina). La tinción inmunofluorescente se realizó como se describió anteriormente, utilizando métodos estándar para teñir tejidos37. Los anticuerpos utilizados y sus respectivas concentraciones se enumeran en la Tabla 4.
La repoblación exitosa de andamios conduce a ELT altamente celulares después de 7 días, con un patrón de repoblación similar alveolar visible por microscopía de luz (Figura 6A-C). En algunos casos, con una celularidad muy alta, las estructuras de tipo organoide pueden ser visibles (Figura 6A, B). La siembra de tejido fallida se puede visualizar mediante microscopía de contraste de fase durante el cultivo (Figura 6C). Después de cultivar andamios de tejido con AEC2, fibroblastos y células endoteliales, los ELT se repoblan densamente con estructuras similares a las alveolares que comprenden los tres linajes celulares (Figura 6D, E). En los días 7 u 8, los AEC2 mantienen la morfología cuboidal y expresan la proteína surfactante-B (SPB) y la proteína corporal lamelar ABCA3, sin evidencia de diferenciación significativa a AEC1s (Figura 6E,F). Los AEC2 son altamente proliferativos en los ELT, como lo demuestra la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) después de un pulso de 2 h a 10 μM (Figura 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del sistema de perfusión para la extracción y limpieza pulmonar. (A) El sistema de perfusión comprende una extremidad impulsada por gravedad, utilizada para la canulación inicial de la arteria pulmonar bajo flujo; y una extremidad accionada por bomba, utilizada para limpiar los pulmones de manera eficiente después de la canulación inicial. La línea de bombas incluye un "amortiguador de pulsos" que amortigua los picos de presión causados por la bomba. El diseño de las cánulas arteriales traqueales y pulmonares se detalla a la izquierda. SNP = nitroprusiato de sodio. (B) Detalles del conjunto del amortiguador de impulsos. BPT y silicona se refieren a tipos de tubos. (C) Posiciones de cánulas arteriales traqueales y pulmonares colocadas durante la extracción pulmonar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Figura 2: Cronología del cultivo para la recelularización de tres linajes. Cronograma propuesto para la siembra y el cultivo de ELT de tres linajes, incluido el momento de la siembra en dos fases. Se indican los números de células para la siembra y el medio de cultivo para cada fase. Consulte los detalles de los medios culturales en la Tabla 3. AEC2 = célula epitelial alveolar tipo 2. EC = célula endotelial. FB = fibroblasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figura 3: Esquema de la preparación del tejido pulmonar diseñado. (A) El tejido pulmonar nativo se corta en rodajas utilizando un vibratomo. (B) Las rodajas pulmonares cortadas con precisión se cortan en tiras estandarizadas de 3 mm de ancho, se recortan en casetes de cultivo de tejidos de politetrafluoretileno (PTFE) y se descelularizan con detergente para producir andamios de matriz extracelular acelular. (C) Los andamios se vuelven a sembrar en baños de siembra especializados que confinan el área de siembra al área del tejido, y luego se cultivan en una placa de pozo estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figura 4: Estructura de andamios pulmonares descelularizados. Tinción H&E de cortes pulmonares nativos (A) y descelularizados (B) que muestran la preservación de la arquitectura alveolar después de la descelularización. (C,D) Ejemplos de andamios ECM descelularizados vistos a un aumento de 5x por microscopía de contraste de fase, que comprenden predominantemente tejido alveolar (C) o que contienen grandes vías respiratorias y vasos ramificados (D, puntas de flecha negras y rojas). Barras de escala, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figura 5: Eliminación de ADN y preservación de matrices en andamios pulmonares descelularizados. (A) Cuantificación de ADN en rodajas pulmonares nativas y descelularizadas (media ± SEM, n = 5). Prueba t de Welch, **P < 0.01. Decelular = descelularizado. (B,C) Tinción histológica de rodajas pulmonares nativas y descelularizadas para colágeno (B) y elastina (C). Puntas de flecha, elastina conservada en anillos de entrada alveolares de tejido descelularizado. (D,E) Tinción inmunofluorescente de rodajas pulmonares nativas y descelularizadas para colágeno IV (D) y laminina (E). Barras de escala, 50 μm. En todos los paneles, los cuadros punteados delinean la región de la imagen que se amplía a la derecha en cada panel respectivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figura 6: Repoblación celular de tejidos pulmonares modificados. (A-C) Ejemplos de ELT recelularizados en el día 7 de cultivo, visualizados durante el cultivo por microscopía de contraste de fase. El patrón de recelularización refleja la estructura alveolar del tejido. En algunas áreas de alta celularidad, se pueden formar estructuras similares a organoides (puntas de flecha). (A) y (B) representan una repoblación celular exitosa, mientras que (C) representa un bajo nivel de recelularización después de 7 días de cultivo. (D-G) Tinción de ELTs recelularizados en el día 7 u 8 de cultivo. (D) Tinción de H&E que muestra repoblación celular de los septos alveolares. (E) Etiquetas de tinción inmunofluorescente injertadas proCollagenIα1+ fibroblastos, ABCA3+ AEC2 y células endoteliales CD31+ . (F) Los tejidos contienen abundantes SPB+ AEC2s pero pocos RTI-40 (podoplanin)+ AEC1s en estas condiciones. (G) Muchos AEC2 están proliferando en los ELT, según lo medido por la incorporación de EdU. Barras de escala, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Soluciones de descelularización. Detalles de preparación para soluciones de descelularización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Protocolo de descelularización. Detalles del protocolo para descelularizar las rodajas pulmonares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: Medios de comunicación culturales. Detalles de preparación para medios de crecimiento endoteliales y AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 4: Anticuerpos utilizados para la inmunotinción. Detalles de los anticuerpos y sus concentraciones utilizadas para la inmunotinción. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Expediente complementario 1: Diseño para marcos de casete de cultivo de tejidos de corte láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente Complementario 2: Diseño para clips de casete de cultivo de tejidos de corte láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente complementario 3: Diseño para pestañas de casete de cultivo de tejidos de corte láser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente complementario 4: Archivo CAD para la siembra de la base del molde del baño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente Complementario 5: Archivo CAD para la siembra del anillo de molde de baño. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Este protocolo describe un método para generar tejidos pulmonares reproducibles y diseñados a pequeña escala, mediante la repoblación de rodajas pulmonares descelularizadas cortadas con precisión con células epiteliales alveolares tipo 2, fibroblastos y células endoteliales.

Tejidos pulmonares diseñados preparados a partir de rodajas pulmonares descelularizadas

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Este protocolo permite el uso repetible de la matriz extracelular pulmonar intacta como sustrato de cultivo de tejido tridimensional y rendimiento moderado. La principal ventaja del sistema de tejido pulmonar diseñado es la flexibilidad de la plataforma. Los ELT se pueden adaptar para utilizar varios andamios tisulares, células o medios de cultivo de interés.Una vez extraídos los pulmones, llene una jeringa de 10 mililitros con agarosa y HBSS sin rojo fenol. Infle los pulmones con aproximadamente 10 mililitros de aire a través de la cánula de la tráquea, luego inyecte inmediatamente la agarosa preparada a través de la cánula de la tráquea hasta que se inflen las puntas más distales de los lóbulos pulmonares. Cubra la tráquea uniendo la tapa blanca de una llave de paso de cuatro vías a la cerradura luer hembra de la cánula traqueal.Coloque el pulmón en una placa de Petri de 150 milímetros sobre hielo para permitir que la agarosa se solidifique. Prepare las rodajas de pulmón de acuerdo con el protocolo en el manuscrito y luego llene una placa de Petri de 100 milímetros con 1/3 de volumen de PBS. Transfiera casetes y pestañas al plato usando fórceps.Si las rebanadas están congeladas, descongele un plato a la vez vertiendo PBS a temperatura ambiente. Luego, transfiera una rebanada descongelada a una placa de Petri de 150 milímetros. Despliegue suavemente la rebanada con fórceps finos o un hemostático y aspire cuidadosamente el exceso de PBS alrededor del tejido.Luego, corte una tira de tres milímetros de ancho y al menos nueve milímetros de largo de la rebanada presionando toda la longitud de una cuchilla de afeitar firmemente contra el plato y balanceándola ligeramente de lado a lado. Para sujetar la tira de tejido en el cassette, flote sobre el cassette, centrándolo cuidadosamente para extenderse más allá de los orificios en los clips en cada extremo. Coloque una pestaña parcialmente en el orificio en un extremo con fórceps finas, enderece suavemente el tejido y coloque la segunda pestaña.Finalmente, use fórceps para presionar cada pestaña completamente para asegurar el tejido. Después de recortar todos los lados, transfiera el plato de 100 milímetros que contiene los casetes a una campana de flujo laminar. Transfiera casetes a placas de seis pocillos que contengan la primera solución de descelularización utilizando un hemostático curvo para agarrar los lados con muescas.Luego, coloque la placa de seis pocillos en un agitador orbital a 30 RPM durante 10 minutos. Aspire el líquido de cada pozo, luego reemplácelo con tres mililitros de la segunda solución de descelularización por pozo. Coloque la placa en un agitador orbital a 30 RPM e incube durante cinco minutos.Repita este proceso con cada solución como se describe en el protocolo de descelularización en el manuscrito. Después del enjuague final con PBS, transfiera los tejidos a placas estériles de seis pocillos que contengan PBS fresco con antibióticos y antimicóticos e incube a 37 grados Celsius durante 48 horas. Después de la esterilización con antibióticos y antimicóticos, los andamios de tejido pulmonar se pueden sembrar inmediatamente o almacenarse a cuatro grados centígrados durante un máximo de 30 días.Antes de utilizarlos para el cultivo, incube andamios almacenados a cuatro grados Celsius con PBS fresco y antibióticos y antimicóticos durante la noche a 37 grados Celsius como un paso adicional de esterilización. Luego, enjuague los andamios con PBS estéril, cinco mililitros por pozo, tres veces, durante cinco minutos cada uno. Examine los andamios bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 5X para seleccionar los tejidos para la siembra.Prepare la suspensión de células endoteliales en medio endotelial a 5 millones de células por mililitro con células suficientes para sembrar 500, 000 células endoteliales por rebanada. Coloque los baños de siembra en autoclave en placas de Petri de 100 milímetros y transfiera cuidadosamente los andamios de enjuague boca abajo a los baños de siembra. Agite suavemente la suspensión celular preparada para mezclar.Luego, pipetee cuidadosamente 100 microlitros de células directamente sobre cada tejido en la base de los pozos, teniendo cuidado de no dañar el tejido con la punta de la pipeta. Transfiera los tejidos sembrados a la incubadora de cultivo celular. 24 horas después de la siembra de células endoteliales, agregue 900 microlitros de medio de cultivo precalentado a cada pozo usando una pipeta manual, luego devuelva la placa a la incubadora.Después de 24 horas de siembra celular, retire el medio y reemplace el mililitro de medio endotelial fresco por pozo. 72 horas después de sembrar las células endoteliales, cuente las AEC2 o células epiteliales alveolares tipo II y los fibroblastos utilizando un hemocitómetro y prepare una suspensión celular 1: 1 en medio de crecimiento AEC2 a 5 millones de células por mililitro. Pipetee bien el medio de cada baño de siembra y gire suavemente la suspensión celular preparada.Pipete 100 microlitros de células directamente sobre cada tejido en la base del pozo. Transfiera los tejidos sembrados a la incubadora de cultivo celular. Después de dos horas, agregue 900 microlitros de medio de crecimiento AEC2 precalentado a cada pozo, luego devuelva la placa a la incubadora.Después de 24 horas de cultivo con AEC2 y fibroblastos, prepare una placa de 12 pocillos con un mililitro de medio de crecimiento AEC2 precalentado por pozo, por casete. Pipete 800 microlitros de medio de cada pozo del baño de siembra, luego retire los casetes del baño de siembra y transfiéralos del lado derecho hasta la placa de 12 pocillos preparada, un cassette por pozo. Cambie el medio de cultivo con cuidado usando una pipeta Pasteur de vidrio cada dos días durante la duración deseada del cultivo.Controlar el grado de repoblación tisular mediante microscopía de contraste de fase con un aumento de 5X durante toda la duración del cultivo. La tinción H y E de andamios tisulares mostró una arquitectura alveolar preservada después de la descelularización sin núcleos celulares visibles. Se observó tejido alveolar cuando se observaron andamios de matriz extracelularizada a un aumento de 5X mediante microscopía de contraste de fase.Las vías respiratorias y los vasos ramificados grandes también eran visibles en algunas rebanadas. En el séptimo día de cultivo, la microscopía de contraste de fase mostró que el patrón de recelularización en los tejidos pulmonares modificados emulaba la estructura alveolar de los tejidos en casos de repoblación exitosa. También se observó una recelularización deficiente.La tinción H y E en el día siete u ocho mostró repoblación de los septos alveolares. La inmunofluorescencia de pie reveló fibroblastos pro-colágeno tipo I alfa 1 positivos, AEC2s ABCA3 positivos, células endoteliales CD31-positivas, y abundantes AEC2 SPB-positivos. Además, el ensayo de timidina mostró muchas AEC2 proliferantes.Esta técnica ha facilitado el desarrollo de estrategias para la ingeniería del tejido pulmonar y ha permitido investigar las colas que apoyan la proliferación y diferenciación de células de tipo II dentro del alvéolo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Investigación

Bioingeniería

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generación de células epiteliales de las vías respiratorias del ratón ESC-Obtenido usando Descelularizado pulmón andamios

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Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

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Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

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Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

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Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Pruebas preclínicas de fármacos en tejidos musculares escalables diseñados en 3D

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Disección y aislamiento de tejido pulmonar descelularizado específico de la región

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...