Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Författarna vill tacka Lorenzo Sewanan och Jorge Nunez för deras arbete med att utveckla vävnadsodlingskassettdesignen som används i detta protokoll, Kaminski-labbet för användning av deras vibratom, Maurizio Chioccioli och Jessica Nouws för hjälp med lungskärning, Allie LaRocco för hjälp med inledande pilotexperiment och Hong Qian för noggrann läsning av protokollet. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) och U01HL145567 (L.E.N.); och av en obegränsad forskningsgåva från Humacyte Inc.

L.E.N. är grundare och aktieägare i Humacyte, Inc, som är ett regenerativt medicinföretag. Humacyte producerar konstruerade blodkärl från allogena glattmuskelceller för kärlkirurgi. L.E.N.s make har eget kapital i Humacyte, och L.E.N. sitter i Humacytes styrelse. L.E.N. är en uppfinnare på patent som är licensierade till Humacyte och som producerar royalties för L.E.N. L.E.N. har fått en obegränsad forskningsgåva för att stödja forskning i sitt laboratorium på Yale. Humacyte påverkade inte uppförandet, beskrivningen eller tolkningen av resultaten i denna rapport.

Detta dokument beskriver användningen av decellulariserade precisionsskurna lungskivor som en plattform för att generera konstruerade lungvävnader in vitro, som innehåller alveolära liknande strukturer med flera linjer. Genom att kombinera strategier som vi tidigare utvecklat för att återbefolka högkvalitativa acellulära ECM-lungställningar för hela lungteknik22,31, med vårt robusta system för odling av småskaliga konstruerade hjärtvävnader30, möjliggör detta protokoll användning av fysiologiskt relevant lung-ECM som ett vävnadsodlingssubstrat, på ett repeterbart och måttligt genomströmningssätt.
De metoder som presenteras här beskriver ELT-ställningsberedning från råttlungor, som är lätta att uppnå, kan extraheras i block med direkt tillgång till intakta luftvägar för agarosinflation och är av större storlek än muslunga. All lungvävnad som kan blåsas upp med agaros och ge skivor som är minst 9 mm långa får dock användas inom detta system. Oavsett vävnadskälla är enhetlig inflation av lungvävnaden med agaros det mest kritiska steget för att säkerställa framgång för nedströms vävnadsskärning, klippning och vävnadshantering. Underuppblåst lungvävnad tenderar att inte skiva rent, medan överuppblåst vävnad kan riva under klippning. Efter agarosgelering är lämpligt uppblåsta vävnadsregioner fasta men ger lite ge när de försiktigt pressas med pincett. För intakta råttlungor fann vi att föruppblåsning av de extraherade lungorna med luft flera gånger, följt av agarosinflation så snart som möjligt efter extraktion, resulterar i de bästa skivresultaten och bästa kvalitet på resulterande vävnadsställningar. Lämplig volym agaros måste optimeras empiriskt; För en råttlunga är den volym som krävs för att blåsa upp lungan till total lungkapacitet cirka 30 ml/kg djurmassa (t.ex. 10,5 ml agaros för lungor från en 350 g råtta). För större resekterade lungvävnader med mindre enkel luftvägsåtkomst (t.ex. de från mänskliga givare) kan ytterligare felsökning vara nödvändig för att blåsa upp vävnaden via en bronk32. Under efterföljande lungskärning är valet och orienteringen av vävnaden på kolven ett annat viktigt steg för att 1) se till att skivorna är tillräckligt stora för att generera vävnadsremsor som kan klippas i vävnadsodlingskassetter och 2) maximera parenkymal (alveolär) vävnadsarea, exklusive stora luftvägar eller kärl.
Att klippa PCLS i vävnadsodlingskassetter kan vara ett utmanande steg initialt, men kassetterna förenklar vävnadshanteringen kraftigt under decellularisering och sådd. Två potentiella problem som kan uppstå är vävnadsrivning (antingen under klippningsprocessen eller under decellularisering) eller vävnadspositionering i klippen som resulterar i dålig sådd nedströms (t.ex. ingen sådd eller sådd bara i ändarna). Rivning kan vara resultatet av agarosöverinflation, översträckning av vävnaden under flikinsättning eller lämnar för lite överhäng för att ge tillräckligt vävnadsgrepp när flikarna sätts in. Observera att skivor som rivs i en klippände kan sås framgångsrikt, men de är svåra att visualisera under mikroskopet under odling eftersom vävnaden inte är platt. Dålig vävnadssådd (som den i figur 6C) är sannolikt resultatet av att skivan inte ligger platt mellan de två klämmorna och därmed får dålig kontakt med basen på såddbadet väl när den vänds upp och ner. En annan möjlig orsak är felaktig sittning av kassetten i botten av såddbadbrunnen. När det gäller klippning, applicera lite mer spänning i vävnaden när du placerar det andra klippet för att hjälpa det att ligga platt. Vissa skivor har en liten konkavitet; i dessa fall klipp segmentet med den konvexa sidan uppåt. Med övning upplever vi vanligtvis misslyckad sådd med färre än 2% av skivorna.
En begränsning med detta protokoll är kravet på viss specialutrustning - en laserskärare och en 3D-skrivare - för att generera de ursprungliga materialen för ELT-förberedelse. Men när vävnadsodlingskassetterna och såddbaden har skapats krävs inga ytterligare specialmaterial. Lungskärnings- och decellulariseringsstegen för ELT-ställningsberedning är måttligt tidskrävande; Dessa steg kan dock utföras i förväg eller i antal som är tillräckliga för att förbereda sig för flera experiment samtidigt. Många PCLS (>100 om optimering för parenkymala regioner) kan skäras från en enda lunga och snäppfrysas för senare användning. Medan en enda frys-tö-cykel kan orsaka mindre ultrastrukturella skador på ECM46, har även flera frys-tö-cykler visat sig inte orsaka en signifikant förlust i ECM 23,47. PCLS kan också klippas och decellulariseras före ett experiment, för att användas inom en månad. (I synnerhet kan det beskrivna decellulariseringsprotokollet åstadkommas på cirka 6 timmar, vilket representerar en betydande fördel jämfört med tidigare beskrivna metoder som kräver en dag eller mer 27,28.) När ställningarna är förberedda är cellsåddsprocessen enkel och snabb, och odlingen av ELT kräver inte specialiserade tekniker.
En varning för den beskrivna ELT-metoden är bristen på regionspecifik sådd, dvs leveransen av AEC2s specifikt till det alveolära utrymmet eller endotelceller specifikt till kärlutrymmet. Ändå, även om celler helt enkelt sås ovanpå vävnadsställningarna, är mönstret för recellularisering icke-slumpmässigt, med en viss sken av alveolärliknande organisation, inklusive epitelringar. Vi misstänker att cell-cellinteraktioner, liksom lokala skillnader i ECM-sammansättning och geometri20,21, sannolikt bidrar till de observerade recellulariseringsmönstren. Till stöd för denna hypotes visade en tidigare publicerad studie, där fibroblaster såddes icke-specifikt på decellulariserade lungskivor, att mönstret för vävnadsbefolkning och associerade cellulära fenotyper varierade signifikant beroende på mikroskopisk vävnadsregion och ECM-ställningskälla (t.ex. friska kontra sjuka)27. Fibroblaster observerades också invadera in i interstitium - den plats där de bor i inhemsk lungvävnad 1,27. Den primära alternativa metoden som vi kan tänka oss att odla celler på lungskivor på ett verkligt regionspecifikt sätt skulle innebära sådd av intakta decellulariserade lungor via luftvägarna31,48 och vaskulära fack49,50 och sedan skära den recellulariserade vävnaden. Detta alternativ 1) är dock betydligt mer kostnads-, tids- och resurskrävande; 2) är lägre genomströmning; 3) kräver ökat antal djur; och 4) är förknippad med en ökad risk för kontaminering på grund av utmaningarna med hela lungkulturen och efterföljande skivning av den sådda lungan. Även om man inte rekapitulerar alla aspekter av den inhemska cellulära organisationen, möjliggör ELT-plattformen lungcellsodling på ett fysiologiskt relevant ECM-substrat, på ett sätt som är tillgängligt för många fler laboratorier.
ELT-systemets flexibilitet är en stor fördel med denna plattform och bör möjliggöra småskalig lungvävnadsodling med valfritt antal vävnadsställningar, celler eller odlingsmedier av intresse. Användningen av byggnadsställningar som härrör från sjuk vävnad eller från skademodeller kan möjliggöra studier av cell-cell- eller cellmatrisinteraktioner vid inställning av sjukdomsförändrad ECM 27,29,51. Observera dock att decellulariseringsprotokollet kan behöva anpassas för att ta hänsyn till matrisskillnader mellan arter52. Den beskrivna såddstrategin kan användas för vilken celltyp som helst, och odlingstidslinjen anpassas för att passa forskarens behov. Som utgångspunkt bör 1 x 106 celler per byggnadsställning ge en mycket cellulär vävnad inom 7 dagar efter odling, medan 1 x 105 celler totalt resulterar i dålig cellularitet. Vid varje anpassning av tidslinjen bör vävnadsodlingskassetterna avlägsnas från såddbadet 24 timmar efter den sista vävnadssådden. Här, med målet att modellera en del av den cellulära komplexiteten hos lungalveolen, beskriver vi en trikulturell recellulariseringsstrategi som stöder upprätthållandet av väl differentierade neonatala AEC2s i alveolära strukturer i minst 7 dagar. Våra resultat visar också den framgångsrika engraftmenten av både fibroblaster och endotelceller inom ELT, med betoning på den breda tillämpligheten av odlingssubstratet och dess lämplighet för samodlingsstudier. Sådd av vuxna celler i ELT kan underlätta modelleringen av mer vilande alveolära strukturer, medan sådd av humana PSC-härledda AEC2s, inklusive de med genetiska modifieringar, skulle kunna underlätta translationella studier av mänsklig sjukdom13,53. I allmänhet ger den bottom-up-strategi som möjliggörs av ELT-plattformen möjlighet att undersöka bidragen från vissa celltyper till avläsningar av intresse - såsom AEC2-spridning eller differentieringstillstånd.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll ett robust system för att generera konstruerade lungvävnader för samodlingsstudier av AEC2s, fibroblaster och endotelceller i acellulära ECM-lungskivor. ELT representerar en ny 3D-kulturstrategi för primära AEC2s, som hittills vanligtvis har förlitat sig på mindre fysiologiska gel-typmatriser för att upprätthålla en väl differentierad fenotyp 6,11,12. Den nuvarande plattformen bygger på tidigare arbete med återpopulation av decellulariserade lungskivor 24,25,26,27,28,29, men erbjuder flera fördelar: 1) ett vävnadsodlingskassettsystem för att underlätta ELT-hantering under decellularisering, sådd och odling; 2) ett anpassat såddbad för att exakt så ett känt antal celler på varje skivställning; och 3) en trikulturell reseedingsstrategi som möjliggör alveolär vävnadsrepopulation med epitel-, mesenkymala och endotelceller. Således representerar ELT ett viktigt steg framåt mot att skapa reproducerbara in vitro-modeller som fångar cell- och substratkomplexiteten hos den inhemska alveolen och AEC2-stamcellsnischen.

Alveoler är de funktionella enheterna i den distala lungan, som består av ett nät av gasutbyte luftrum kantade av alveolära epiteliala typ 1-celler (AEC1s) och typ 2-celler (AEC2s). Bakom epitelet finns ett tätt nätverk av kapillärer samt stödjande mesenkym, allt stött av en extracellulär matris (ECM) byggnadsställning som ger både styrka och flexibilitet till dessa känsliga luftsäckar1. Alveolerna är också platsen för skada i många lungpatologier, inklusive idiopatisk lungfibros2, akut respiratoriskt nödsyndrom3 och svår koronavirussjukdom-19 (COVID-19)4. Även om arbetet under det senaste decenniet har avslöjat en anmärkningsvärd plasticitet inom lungepitelet, är mekanismerna som möjliggör distal lungreparation i vissa miljöer - och som utesluter reparation i andra - fortfarande ett område med intensiv undersökning5. Utvecklingen av förbättrade in vitro-plattformar för att modellera alveolen skulle underlätta studier av alveolär biologi, regenerering och terapi.
AEC2s självförnyas och differentieras till AEC1s, och anses därmed vara den primära stamcellen i den distala lungan 6,7,8. Dessa celler utgör dock en särskild utmaning för in vitro-studier med tanke på svårigheterna med att odla primära AEC2s utan förlust av fenotyp9. I konventionell 2-dimensionell (2D) kultur plattar AEC2s och antar vissa egenskaper hos AEC1-liknande celler10. Däremot stöder 3D-odlingsstrategier, oftast organoider, upprätthållandet av differentierade egenskaper i primära AEC2s 6,11,12 och tillåter långsiktig odling av pluripotenta stamceller (PSC) -härledda AEC2s13,14. Organoider har använts för att modellera distal lungutveckling15, virusinfektion11,15 och AEC2-relaterad genetisk sjukdom 13,16,17, vilket möjliggör viktiga insikter i AEC2-biologi och regenerering. Dessa odlingsmodeller består emellertid vanligtvis bara av en eller två cellulära släktlinjer och bäddar in cellerna i matriser av geltyp som inte lyckas rekapitulera varken arkitekturen eller ECM-substratet för den inhemska lungalveolen.
ECM är en kritisk regulator för cellfenotyp och beteende via molekylära, topologiska och mekaniska signaler; omfattar en nyckelkomponent i vävnadsspecifika nischer som reglerar stamcellens öde, och fungerar som en reservoar som modulerar tillgången på lokalt utsöndrade tillväxtfaktorer 18,19,20,21. Odling av celler på inhemsk ECM kan således öka in vitro-systemens prediktiva förmåga att modellera biologin hos in vivo-vävnader. Decellularisering, en process som tar bort cellulärt material från vävnader via tvättmedel, enzymer eller fysiska eller andra metoder, kan till stor del bevara ECM-byggnadsställningarna i ett inhemskt organ, när de noggrant utförs22,23. Sådana byggnadsställningar kan återbefolkas med celler för 3D-biomimetisk odling. Men medan decellulariserade byggnadsställningar används i stor utsträckning för vävnadstekniska applikationer, har deras användning för rutinmässig cellodling varit begränsad. Flera tidigare studier har rapporterat decellularisering och recellularisering av lungskivor eller små lungvävnadssegment. Förutom proof-of-concept-studier 24,25,26 har återbefolkade lungskivor använts för att studera fibroblast-matrisadhesion 27,28 och för att undersöka effekten av sjuka lungmatriser på fibroblastfenotyp27,29. Med förbättrad teknik tillgänglig för att generera precisionsskurna vävnadsskivor kan decellulariserade lungskivor erbjuda en bekväm och småskalig plattform för att odla celler, samtidigt som alveolära, luftvägs- och vaskulära understrukturer bevaras. Att införliva flera celltyper skulle möjliggöra studier av cell-cellinteraktioner inom en fysiologiskt relevant 3D-miljö. Förbättrade strategier behövs dock för att underlätta hanteringen av vävnader under hela odlingsprocessen och för att säkerställa kontrollerad och reproducerbar sådd av vävnader med känt antal celler.
Här presenterar vi ett protokoll för att generera konstruerade lungvävnader (ELT) genom att återbefolka decellulariserade precisionsskurna lungskivor (PCLS) med primära endotelceller, AEC2s och fibroblaster. I en anpassning av våra tidigare beskrivna konstruerade hjärtvävnadssystem30 och hela lungdecellulariserings-recellulariseringsstrategier 22,31 beskriver vi procedurer för att skära PCLS från råttlungor och för att klippa skivorna i återanvändbara vävnadsodlingskassetter som förenklar och standardiserar nedströmsmanipulationer. Klippta skivor decellulariseras för att bilda acellulära ECM-ställningar, som återbefolkas i anpassade såddbad. Lungskivor bevarar kritiska ECM-komponenter och arkitektur och stöder tillväxten av AEC2s inom alveolära strukturer med flera linjer i minst 7 dagar. ELT representerar ett nytt alveolära samodlingssystem inom en fysiologiskt relevant 3D-matris, som bör stödja utvecklingen av lungvävnadstekniska strategier, samtidigt som grundläggande biologiska studier av AEC2s och alveolus underlättas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Det finns ett behov av förbättrade 3-dimensionella (3D) lungmodeller som rekapitulerar den arkitektoniska och cellulära komplexiteten hos den inhemska lungalveolen ex vivo. Nyligen utvecklade organoidmodeller har underlättat expansion och studier av lungepitelförefäder in vitro, men dessa plattformar förlitar sig vanligtvis på mustumör-härledd matris och / eller serum och innehåller bara en eller två cellulära linjer. Här beskriver vi ett protokoll för att generera konstruerade lungvävnader (ELT) baserat på multi-lineage recellularization av decellulariserade precisionsskurna lungskivor (PCLS). ELT innehåller alveolära liknande strukturer innefattande alveolart epitel, mesenkym och endotel, inom ett extracellulärt matrissubstrat (ECM) som liknar det hos infödd lunga. För att generera vävnaderna blåses råttlungor upp med agaros, skivas i 450 μm tjocka skivor, skärs i remsor och decellulariseras. De resulterande acellulära ECM-ställningarna återförs sedan med primära endotelceller, fibroblaster och alveolära epiteltyp 2-celler (AEC2s). AEC2 kan bibehållas i ELT-odling i minst 7 dagar med ett serumfritt, kemiskt definierat tillväxtmedium. Under hela vävnadsberednings- och odlingsprocessen klipps skivorna i ett kassettsystem som underlättar hantering och standardiserad cellsådd av flera ELT parallellt. Dessa ELT representerar en organotypisk odlingsplattform som bör underlätta undersökningar av cell-cell- och cell-matrisinteraktioner inom alveolus samt biokemiska signaler som reglerar AEC2s och deras nisch.

En översikt över processen för att generera ELT - bestående av lungskärning, skivklippning och decellularisering och ompopulation av byggnadsställningar - presenteras i figur 3. ELT: erna som presenteras här odlades med hjälp av primära råtta lungmikrovaskulära endotelceller (se materialtabell), neonatal råtta AEC2s och lipofibroblastberikade neonatal råtta lungfibroblaster36. AEC2:or isolerades nyligen via magnetisk pärlbaserad sortering enligt tidigare beskrivet37; alternativa isoleringsprotokoll har beskrivits och diskuterats på andra ställen 38,39,40. Renheten hos isolerade AEC2-filer på råtta kan bedömas via flödescytometri för råttspecifik AEC2-ytmarkör RTII-7041, eller via färgning av ett cytocentrifugerat cellprov för RTII-70 eller pro-ytaktivt protein C (pSPC). Råtta lungfibroblaster isolerades från postnatal dag 7-9 råttungar enligt en anpassning av ett publicerat protokoll42 och användes vid passage 1-2; alternativa isoleringsprotokoll har beskrivits på annat håll43,44. Renheten hos isolerade fibroblaster kan bedömas via färgning av odlade eller cytocentrifugerade celler för mesenkymal markör vimentin, och lipofibroblastanrikning kan bedömas via färgning för Oil Red O45.
När lungvävnaden är jämnt uppblåst med agaros och vävnadsstycken strategiskt utvalda och orienterade för skivning för att maximera det totala och parenkymala vävnadsområdet, kan en råttlunga ge vävnad för >100 alveolära ELT. Remsor av PCLS uppvisar tillräcklig mekanisk integritet för att klippas i vävnadskassetter med få (<5%) fall av rivning (figur 3B).
Protokollet för decellularisering av lungskivor är nära baserat på vårt tidigare publicerade protokoll för decellularisering av hela lungan, som genom kvantitativ proteomik visade sig bevara många ECM-komponenter på nivåer som inte signifikant skiljer sig från dem i native lung22. Decellulariserade skivställningar bevarar alveolernas ursprungliga arkitektur, sett av hematoxylin och eosin (H&E) färgning (figur 4A,B) och av faskontrastmikroskopi (figur 4C). Vi utesluter vanligtvis byggnadsställningar som innehåller stora luftvägar eller fartyg (figur 4D) eller tårar, även om de förstnämnda kan inkluderas om de är av intresse för forskaren. Decellularisering leder till en 96% minskning av vävnads-DNA-halten mätt med en analys för dubbelsträngat DNA (se materialtabell; 0,50 μg / mg ± 0,073 μg / mg vs 0,018 μg / mg ± 0,0035 μg / mg i inhemsk respektive decellulariserad vävnad, medelvärde ± SEM) (Figur 5A), utan att DNA syns genom hematoxylinfärgning (figur 4B). Histologisk och immunofluorescerande färgning av decellulariserade byggnadsställningar avslöjar underhåll av ECM-proteiner kollagen, elastin, kollagen IV och laminin med arkitektur och kvantitet som liknar den i inhemska lungskivor (Figur 5B-E). Observera att kärnorna i inhemska vävnader fläckar blått / svart med trichome (för kollagen) och EVG (för elastin) fläckar. Immunofluorescerande färgning utfördes som beskrivits tidigare med användning av standardmetoder för färgning av vävnader37. De antikroppar som används och deras respektive koncentrationer anges i tabell 4.
Framgångsrik återpopulation av byggnadsställningar leder till mycket cellulära ELT efter 7 dagar, med ett alveolärt liknande återpopulationsmönster synligt med ljusmikroskopi (figur 6A-C). I vissa fall, med mycket hög cellularitet, kan strukturer av organoidtyp vara synliga (figur 6A,B). Misslyckad vävnadssådd kan visualiseras genom faskontrastmikroskopi under odling (Figur 6C). Efter odling av vävnadsställningar med AEC2s, fibroblaster och endotelceller återbefolkas ELT tätt med alveolära strukturer som omfattar alla tre cellinjerna (figur 6D, E). Vid dag 7 eller 8 upprätthåller AEC2s kuboidal morfologi och uttrycker ytaktivt protein-B (SPB) och lamellärt kroppsprotein ABCA3, utan tecken på signifikant differentiering till AEC1s (figur 6E, F). AEC2s är mycket proliferativa i ELT, vilket demonstreras av 5-etynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering efter en 2 h puls vid 10 μM (figur 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk över perfusionssystem för lungextraktion och röjning. och en pumpdriven lem, som används för att rensa lungorna effektivt efter initial kannulering. Pumpledningen innehåller en "pulsdämpare" som dämpar spikarna i tryck som orsakas av pumpen. Utformningen av trakeal- och lungartärkanylerna är detaljerad till vänster. SNP = natriumnitroprussid. B) Uppgifter om pulsspjällaggregat. BPT och silikon hänvisar till typer av slangar. (C) Positioner för trakeal- och lungartärkanyler placerade under lungextraktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Bild 2: Kulturtidslinje för tri-lineage recellularization. Föreslagen tidslinje för elt-sådd och odling med tre linjer, inklusive tidpunkt för tvåfassådd. Cellnummer för sådd och odlingsmedium för varje fas anges. Se kulturmedieuppgifter i tabell 3. AEC2 = alveolär epitelial typ 2-cell. EC = endotelcell. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Figur 3: Schematisk över konstruerad lungvävnadsberedning. (B) Precisionsskurna lungskivor skärs i standardiserade 3 mm breda remsor, klipps i polytetrafluoretylen (PTFE) vävnadsodlingskassetter och tvättmedelsavcellulariseras för att ge acellulära extracellulära matrisställningar. (C) Byggnadsställningar återförs i specialiserade såddbad som begränsar såddområdet till vävnadsområdet och odlas sedan i en standardbrunnplatta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Figur 4: Struktur av decellulariserade lungställningar. H&E-färgning av inhemska (A) och decellulariserade (B) lungskivor som visar bevarande av alveolär arkitektur efter decellularisering. (C,D) Exempel på decellulariserade ECM-byggnadsställningar sedda vid 5x förstoring genom faskontrastmikroskopi, bestående av övervägande alveolär vävnad (C) eller innehållande stora förgrenande luftvägar och kärl (D, svarta och röda pilspetsar). Skalstänger, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Figur 5: DNA-borttagning och matrisbevarande i decellulariserade lungställningar ±. Welchs t-test, **P < 0,01. Decell = decellulariserad. (B,C) Histologisk färgning av inhemska och decellulariserade lungskivor för kollagen (B) och elastin (C). Pilspetsar, elastin bevarade i alveolära ingångsringar av decellulariserad vävnad. (D,E) Immunofluorescerande färgning av inhemska och decellulariserade lungskivor för kollagen IV (D) och laminin (E). Skalstänger, 50 μm. I alla paneler markerar prickade rutor bildområdet som förstoras till höger i respektive panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Figur 6: Cellulär återbefolkning av konstruerade lungvävnader. (A-C) Exempel på recellulariserade ELT på dag 7 av kulturen, som visualiseras under odling genom faskontrastmikroskopi. Recellulariseringsmönstret speglar vävnadens alveolära struktur. I vissa områden med hög cellularitet kan organoidliknande strukturer bildas (pilspetsar). (A) och (B) representerar framgångsrik cellrepopulation, medan (C) representerar en dålig nivå av recellularisering efter 7 dagars odling. (D-G) Färgning av recellulariserade ELT på dag 7 eller 8 av kulturen. (D) H&E-färgning som visar cellulär återpopulation av den alveolära septa. (E) Immunofluorescerande färgningsetiketter ingraferade proCollagenIα1 + fibroblaster, ABCA3 + AEC2s och CD31 + endotelceller. (F) Vävnader innehåller rikligt med SPB + AEC2s men få RTI-40 (podoplanin) + AEC1s under dessa förhållanden. (G) Många AEC2s sprider sig i ELT, mätt genom EdU-införlivande. Skalstänger, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: Decellulariseringslösningar. Förberedelsedetaljer för decellulariseringslösningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 2: Decellulariseringsprotokoll. Detaljer om protokoll för decellularisering av lungskivor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 3: Kulturmedier. Förberedelsedetaljer för endotel- och AEC2-tillväxtmedier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 4: Antikroppar som används för immunfärgning. Uppgifter om antikroppar och deras koncentrationer som används för immunfärgning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Kompletterande fil 1: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettramar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 2: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettklämmor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 3: Design för laserskärning av vävnadsodlingskassettflikar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 4: CAD-fil för sådd av badformbas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 5: CAD-fil för sådd av badformring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Detta protokoll beskriver en metod för att generera reproducerbara, småskaliga konstruerade lungvävnader genom att återbefolka decellulariserade precisionsskurna lungskivor med alveolära epiteltyp 2-celler, fibroblaster och endotelceller.

Konstruerade lungvävnader framställda av decellulariserade lungskivor

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Detta protokoll möjliggör repeterbar användning av intakt lungextracellulär matris som ett tredimensionellt vävnadsodlingssubstrat och måttlig genomströmning. Den största fördelen med det konstruerade lungvävnadssystemet är plattformens flexibilitet. UTT kan anpassas för att använda olika vävnadsställningar, celler eller odlingsmedier av intresse.När lungorna har extraherats fyller du en 10-milliliter spruta med agaros och HBSS utan fenolrött. Blås upp lungorna med cirka 10 milliliter luft via luftstrupen och injicera sedan omedelbart den beredda agarosen via luftrörskanylen tills de mest distala spetsarna på lungloberna är uppblåsta. Täck luftstrupen genom att fästa den vita kepsen från en fyrvägs stoppkran till det kvinnliga luerlåset på trakealkanylen.Lägg lungan i en 150 millimeters petriskål på is så att agarosen stelnar. Förbered lungskivorna enligt protokollet i manuskriptet och fyll sedan en 100 millimeter petriskål med 1/3 volym PBS. Överför kassetter och flikar till skålen med pincett.Om skivorna är frysta, tina en skål i taget genom att hälla på rumstemperatur PBS. Överför sedan en tinad skiva till en 150 millimeter petriskål. Vik försiktigt ut skivan med fina pincett eller en hemostat och aspirera försiktigt överflödig PBS från runt vävnaden.Skär sedan en tre millimeter bred, minst nio millimeter lång remsa från skivan genom att trycka hela längden på ett rakblad ordentligt mot skålen och gunga den något från sida till sida. För att klämma fast vävnadsremsan i kassetten, flyt den ovanför kassetten och centrera den försiktigt för att sträcka sig förbi hålen i klämmorna i vardera änden. Placera en flik delvis i hålet i ena änden med fina pincett, räta försiktigt ut vävnaden och ställ in den andra fliken.Slutligen, använd pincett för att trycka in varje flik helt för att säkra vävnaden. Efter att ha klippt alla sidor, överför 100 millimeter skålen som innehåller kassetterna till en laminär flödeshuv. Överför kassetter till sexbrunnsplattor som innehåller den första decellulariseringslösningen med hjälp av en krökt hemostat för att ta tag i de skårade sidorna.Placera sedan sexbrunnsplattan på en orbitalskakare vid 30 varv / min i 10 minuter. Aspirera vätskan från varje brunn och ersätt den sedan med tre milliliter av den andra decellulariseringslösningen per brunn. Placera plattan på en orbitalskakare vid 30 varv / min och inkubera i fem minuter.Upprepa denna process med varje lösning som beskrivs i decellulariseringsprotokollet i manuskriptet. Efter den slutliga sköljningen med PBS, överför vävnader till sterila sexbrunnsplattor innehållande färsk PBS med antibiotika och antimykotika och inkubera vid 37 grader Celsius i 48 timmar. Efter sterilisering med antibiotika och antimykotika kan lungvävnadsställningar utsädes omedelbart eller lagras vid fyra grader Celsius i upp till 30 dagar.Innan du använder för odling, inkubera byggnadsställningar lagrade vid fyra grader Celsius med färsk PBS och antibiotika och antimykotika över natten vid 37 grader Celsius som ett ytterligare steriliseringssteg. Skölj sedan byggnadsställningar med steril PBS, fem milliliter per brunn, tre gånger, i fem minuter vardera. Undersök byggnadsställningar under ett faskontrastmikroskop vid 5X förstoring för att välja vävnader för sådd.Förbered endotelcellsuspensionen i endotelmedium vid 5 miljoner celler per milliliter med tillräckliga celler för att fröa 500 000 endotelceller per skiva. Placera autoklaverade såddbad i 100 millimeter petriskålar och överför försiktigt sköljställningarna upp och ner i såddbadet. Snurra försiktigt den beredda cellsuspensionen för att blanda.Pipettera sedan försiktigt 100 mikroliter celler direkt ovanpå varje vävnad vid basen av brunnarna, var noga med att inte skada vävnaden med pipettspetsen. Överför de sådda vävnaderna till cellodlingsinkubatorn. 24 timmar efter sådd av endotelceller, tillsätt 900 mikroliter förvärmt odlingsmedium till varje brunn med en manuell pipett och sätt sedan tillbaka plattan till inkubatorn.Efter 24 timmars cellsådd, ta bort mediet och byt ut en milliliter färskt endotelmedium per brunn. 72 timmar efter sådd av endotelcellerna, räkna AEC2s eller alveolära epitelial typ II-celler och fibroblaster med användning av en hemocytometer och förbered en 1: 1 cellsuspension i AEC2-tillväxtmedium vid 5 miljoner celler per milliliter. Pipettera mediet från varje såddbad väl och virvla försiktigt den beredda cellsuspensionen.Pipettera 100 mikroliter av celler direkt ovanpå varje vävnad vid basen av brunnen. Överför de sådda vävnaderna till cellodlingsinkubatorn. Efter två timmar tillsätt 900 mikroliter förvärmt AEC2-tillväxtmedium till varje brunn och återför sedan plattan till inkubatorn.Efter 24 timmars kultur med AEC2s och fibroblaster, förbered en 12-brunnsplatta med en milliliter förvärmt AEC2-tillväxtmedium per brunn, per kassett. Pipettera 800 mikroliter medium från varje brunn i såddbadet, ta sedan bort kassetterna från såddbadet och överför dem höger sida upp till den förberedda 12-brunnsplattan, en kassett per brunn. Byt kulturmedium försiktigt med en pasteurpipett av glas varannan dag under önskad odlingstid.Övervaka graden av vävnadsrepopulation via faskontrastmikroskopi vid 5X förstoring under hela odlingstiden. H- och E-färgning av vävnadsställningar visade bevarad alveolär arkitektur efter decellularisering utan synliga cellkärnor. Alveolär vävnad observerades när decellulariserade extracellulära matrisställningar betraktades vid 5X förstoring genom faskontrastmikroskopi.Stora förgreningsvägar och fartyg syntes också i vissa skivor. På dag sju av kulturen visade faskontrastmikroskopi att mönstret för recellularisering i konstruerade lungvävnader emulerade vävnadens alveolära struktur vid framgångsrik återbefolkning. Dålig recellularisering var också synlig.H- och E-färgning på dag sju eller åtta visade återbefolkning av den alveolära septa. Immunofluorescens stående avslöjade pro-kollagen typ I alfa 1-positiva fibroblaster, ABCA3-positiva AEC2s, CD31-positiva endotelceller, ans rikliga SPB-positiva AEC2s. Dessutom visade tymidinanalysen många spridande AEC2s.Denna teknik har underlättat utvecklingen av strategier för lungvävnadsteknik och har möjliggjort undersökningar av köer som stöder typ II-cellproliferation och differentiering inom alveolus.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Förfarande för Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Ett experimentellt system för att studera Mechanotransduction i fetal lunga Celler

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombinerad 3D vävnadstekniska<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generation av ESC-derived mus epitelceller i luftvägarna med hjälp decellulariserade Lung Ställningar

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-kardiell sido bränning ljus kateter för övervakning cellulär metabolism med transmural Absorbansspektroskopi av parfymera däggdjurs hjärtan

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

Beredning av Mesh-formade Engineered Hjärt vävnader som härrör från mänskliga iPS-celler för In Vivo hjärtinfarkt Reparation

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast härledd mänsklig konstruerad bindväv för screeningapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Preklinisk läkemedelstestning i skalbar 3D-konstruerad muskelvävnad

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Dissektion och isolering av regionspecifik decellulariserad lungvävnad

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...