Name: engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Yazarlar, Lorenzo Sewanan ve Jorge Nunez'e bu protokolde kullanılan doku kültürü kaset tasarımını geliştiren çalışmaları için, vibratomlarının kullanımı için Kaminski laboratuvarına, akciğer dilimleme konusunda yardım için Maurizio Chioccioli ve Jessica Nouws'a, ilk pilot deneylerde yardım için Allie LaRocco'ya ve protokolün dikkatli bir şekilde okunması için Hong Qian'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma NIH hibeleri F30HL143880 (K.L.L.), Tıbbi Bilim İnsanı Eğitim Programı Eğitim Hibe T32GM136651 (KLL) ve U01HL145567 (L.E.N.) tarafından desteklenmiştir; ve Humacyte Inc.'den (L.E.N.) sınırsız bir araştırma hediyesi ile.

L.E.N., rejeneratif bir tıp şirketi olan Humacyte, Inc.'in kurucusu ve hissedarıdır. Humacyte, vasküler cerrahi için allojenik düz kas hücrelerinden tasarlanmış kan damarları üretir. L.E.N.'nin eşinin Humacyte'de özsermayesi vardır ve L.E.N. Humacyte'nin Yönetim Kurulu'nda görev yapmaktadır. L.E.N., Humacyte'ye lisanslı ve L.E.N. L.E.N. için telif hakkı üreten patentlerin mucididir ve Yale'deki laboratuvarında araştırmaları desteklemek için sınırsız bir araştırma hediyesi almıştır. Humacyte, bu rapordaki bulguların davranışını, tanımını veya yorumlanmasını etkilemedi.

Bu yazıda, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerinin, çok soylu alveolar benzeri yapılar içeren in vitro mühendislik akciğer dokuları oluşturmak için bir platform olarak kullanımı açıklanmaktadır. Tüm akciğer mühendisliği22,31 için yüksek doğrulukta asellüler ECM akciğer iskelelerini yeniden doldurmak için daha önce geliştirdiğimiz stratejileri, küçük ölçekli mühendislik kalpdokularını kültürlemek için sağlam sistemimizle birleştirerek, bu protokol fizyolojik olarak ilgili akciğer ECM'sinin bir doku kültürü substratı olarak, tekrarlanabilir ve orta verimli bir şekilde kullanılmasını sağlar.
Burada sunulan yöntemler, sıçan akciğerlerinden kolayca ulaşılabilen, agaroz inüflemesi için sağlam hava yollarına doğrudan erişimi olan en blok halinde ekstrakte edilebilen ve fare akciğerinden daha büyük boyutta olan ELT iskele preparatını detaylandırmaktadır. Ancak agaroz ile şişirilebilen ve en az 9 mm uzunluğunda dilimler verebilen herhangi bir akciğer dokusu bu sistem içerisinde kullanılabilir. Doku kaynağından bağımsız olarak, agarozlu akciğer dokusunun homojen şişirilmesi, aşağı akış doku dilimleme, kırpma ve doku işlemenin başarısını sağlamak için en kritik adımdır. Az şişirilmiş akciğer dokusu temiz bir şekilde dilimlenmeme eğilimindedir, aşırı şişirilmiş doku kırpma sırasında yırtılabilir. Agaroz jelasyonunu takiben, uygun şekilde şişirilmiş doku bölgeleri sağlamdır, ancak forseps ile hafifçe bastırıldığında biraz verir. Sağlam sıçan akciğerleri için, ekstrakte edilen akciğerlerin birkaç kez hava ile önceden şişirilmesinin, ardından ekstraksiyondan sonra mümkün olan en kısa sürede agaroz enflasyonunun takip edilmesinin, en iyi dilimleme sonuçları ve ortaya çıkan doku iskelelerinin en iyi kalitesi ile sonuçlandığını bulduk. Uygun agaroz hacminin ampirik olarak optimize edilmesi gerekir; Bir sıçan akciğeri için akciğeri toplam akciğer kapasitesine şişirmek için gereken hacim yaklaşık 30 mL / kg hayvan kütlesidir (örneğin, 350 g'lık bir sıçandan akciğerler için 10.5 mL agaroz). Daha az basit hava yolu erişimine sahip daha büyük rezeke akciğer dokuları için (insan donörlerinden gelenler gibi), dokuyu bronş32 yoluyla şişirmek için bazı ek sorun giderme gerekli olabilir. Sonraki akciğer dilimleme sırasında, piston üzerindeki dokunun seçimi ve oryantasyonu, 1) dilimlerin doku kültürü kasetlerine kırpılabilecek doku şeritleri oluşturacak kadar büyük olmasını sağlamak ve 2) büyük hava yolları veya damarlar hariç parankimal (alveolar) doku alanını en üst düzeye çıkarmak için bir başka önemli adımdır.
PCLS'yi doku kültürü kasetlerine kırpmak başlangıçta zor bir adım olabilir, ancak kasetler desellülarizasyon ve tohumlama sırasında doku kullanımını büyük ölçüde basitleştirir. Ortaya çıkabilecek iki potansiyel sorun, doku yırtılması (kırpma işlemi sırasında veya hücresellikten arındırma sırasında) veya klipslerde zayıf aşağı akış tohumlamasına neden olan doku konumlandırmasıdır (örneğin, tohumlama yok veya sadece uçlarda tohumlama). Yırtılma, agaroz aşırı şişirilmesinin, sekme yerleştirme sırasında dokunun aşırı gerilmesinin veya tırnakları yerleştirirken yeterli doku tutuşu sağlamak için çok az çıkıntı bırakmanın bir sonucu olabilir. Bir klips ucunda yırtılan dilimlerin başarılı bir şekilde tohumlanabileceğini, ancak doku düz olmadığı için kültür sırasında mikroskop altında görselleştirilmesinin zor olduğunu unutmayın. Zayıf doku tohumlaması ( Şekil 6C'deki gibi) muhtemelen dilimin iki klips arasında düz durmamasının ve böylece baş aşağı çevrildiğinde tohumlama banyosunun tabanıyla zayıf temas etmesinin sonucudur. Diğer bir olası neden, kasetin tohumlama banyosunun dibinde yanlış oturmasıdır. Kırpma açısından, düz durmasına yardımcı olmak için ikinci klipsi yerleştirirken dokuya biraz daha fazla gerginlik uygulayın. Bazı dilimler hafif bir konkaviteye sahiptir; Bu durumlarda dilimi dışbükey tarafı yukarı bakacak şekilde kırpın. Uygulamada, tipik olarak% 2'den daha az dilimle başarısız tohumlama yaşarız.
Bu protokolün bir sınırlaması, ELT hazırlığı için ilk malzemeleri üretmek için bazı özel ekipmanların - bir lazer kesici ve bir 3D yazıcı - gerekliliğidir. Bununla birlikte, doku kültürü kasetleri ve tohumlama banyoları oluşturulduktan sonra, ek özel materyallere gerek yoktur. ELT iskele preparasyonunun akciğer dilimleme ve desellülarizasyon adımları orta derecede zaman alıcıdır; ancak, bu adımlar önceden veya aynı anda birden fazla deneye hazırlanmak için yeterli sayıda gerçekleştirilebilir. Birçok PCLS (parankimal bölgeler için optimize edilirse >100) tek bir akciğerden kesilebilir ve daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Tek bir donma-çözülme döngüsü ECM46'da küçük ultrayapısal hasara neden olabilirken, birden fazla donma-çözülme döngüsünün bile ECM 23,47'de önemli bir kayba neden olmadığı gösterilmiştir. PCLS ayrıca bir ay içinde kullanılmak üzere bir deneyden önce kırpılabilir ve hücreselden arındırılabilir. (Özellikle, açıklanan hücreselleştirme protokolü yaklaşık 6 saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir gün veya daha fazla gerektiren daha önce açıklanan yöntemlere göre önemli bir avantaj sağlar27,28.) İskeleler hazırlandıktan sonra, hücre tohumlama işlemi basit ve hızlıdır ve ELT kültürü özel teknikler gerektirmez.
Tanımlanan ELT yönteminin bir uyarısı, bölgeye özgü tohumlamanın olmaması, yani AEC2'lerin özellikle alveoler boşluğa veya endotel hücrelerinin özellikle vasküler boşluğa verilmesidir. Bununla birlikte, hücreler basitçe doku iskelelerinin üzerine tohumlanmasına rağmen, resellülarizasyon paterni, epitel halkaları da dahil olmak üzere alveolar benzeri organizasyonun bir benzerliği ile rastgele değildir. Hücre-hücre etkileşimlerinin yanı sıra ECM bileşimi ve geometri20,21'deki yerel farklılıkların, gözlemlenen resellülarizasyon paternlerine katkıda bulunduğundan şüpheleniyoruz. Bu hipotezi desteklemek için, fibroblastların spesifik olmayan bir şekilde desellülarize akciğer dilimlerine tohumlandığı daha önce yayınlanmış bir çalışma, doku repopulasyonu ve ilişkili hücresel fenotiplerin paterninin mikroskobik doku bölgesi ve ECM iskele kaynağı (örneğin, sağlıklı ve hastalıklı) ile önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir27. Fibroblastların ayrıca interstisiyuma invaze olduğu gözlendi - doğal akciğer dokusunda bulundukları yer 1,27. Akciğer dilimleri üzerindeki hücreleri gerçekten bölgeye özgü bir şekilde kültürlemek için hayal edebileceğimiz birincil alternatif yöntem, bozulmamış desellülarize akciğerlerin hava yolu31,48 ve vasküler bölmeler 49,50 yoluyla tohumlanmasını ve daha sonra resellülarize dokunun dilimlenmesini gerektirecektir. Bununla birlikte, bu alternatif 1) önemli ölçüde daha fazla maliyet, zaman ve kaynak yoğundur; 2) daha düşük verimdir; 3) artan sayıda hayvan gerektirir; ve 4) tüm akciğer kültürünün zorlukları ve daha sonra tohumlanmış akciğerin dilimlenmesi nedeniyle artan kontaminasyon riski ile ilişkilidir. Doğal hücresel organizasyonun tüm yönlerini özetlemese de, ELT platformu, fizyolojik olarak ilgili bir ECM substratı üzerinde, daha birçok laboratuvarın erişebileceği bir şekilde akciğer hücre kültürünü mümkün kılar.
ELT sisteminin esnekliği bu platformun önemli bir avantajıdır ve herhangi bir sayıda doku iskelesi, hücre veya kültür ortamı ile küçük ölçekli akciğer dokusu kültürüne izin vermelidir. Hastalıklı dokudan veya yaralanma modellerinden türetilen iskelelerin kullanılması, hastalıkla değiştirilmiş ECM 27,29,51 ortamında hücre-hücre veya hücre-matris etkileşimlerinin incelenmesine izin verebilir. Bununla birlikte, desellülarizasyon protokolünün,52. türler arasındaki matris farklılıklarını hesaba katmak için uyarlanması gerekebileceğini unutmayın. Açıklanan tohumlama stratejisi, herhangi bir hücre tipi için kullanılabilir ve kültür zaman çizelgesi, araştırmacının ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanmıştır. Başlangıç noktası olarak, iskele başına 1 x 106 hücre, kültürden sonraki 7 gün içinde yüksek hücresel bir doku vermelidir, oysa 1 x 105 toplam hücre zayıf hücreselliğe neden olur. Zaman çizelgesinin herhangi bir adaptasyonunda, doku kültürü kasetleri, son doku tohumlamasından 24 saat sonra tohumlama banyosundan çıkarılmalıdır. Burada, akciğer alveolünün hücresel karmaşıklığının bir kısmını modellemek amacıyla, alveolar benzeri yapılarda iyi diferansiye yenidoğan AEC2'lerin en az 7 gün boyunca korunmasını destekleyen üç kültürlü bir resellülarizasyon stratejisi tanımlamaktayız. Sonuçlarımız ayrıca, ELT'ler içindeki hem fibroblastların hem de endotel hücrelerinin başarılı bir şekilde engraftasyonunu göstererek, kültür substratının geniş uygulanabilirliğini ve ko-kültür çalışmaları için uygunluğunu vurgulamaktadır. ELT'lerde yetişkin hücrelerin tohumlanması, daha sessiz alveolar yapıların modellenmesini kolaylaştırabilirken, genetik modifikasyonları olanlar da dahil olmak üzere insan PSC kaynaklı AEC2'lerin tohumlanması, insan hastalığının translasyonel çalışmalarını kolaylaştırabilir13,53. Genel olarak, ELT platformu tarafından sağlanan aşağıdan yukarıya yaklaşım, belirli hücre tiplerinin AEC2 proliferasyonu veya farklılaşma durumu gibi ilgi çekici okumalara katkılarını araştırma fırsatı sunar.
Özetle, bu protokol, asellüler ECM akciğer dilim iskeleleri içindeki AEC2'lerin, fibroblastların ve endotel hücrelerinin ko-kültür çalışmaları için tasarlanmış akciğer dokuları üretmek için sağlam bir sistemi özetlemektedir. ELT'ler, birincil AEC2'ler için yeni bir 3D kültür stratejisini temsil eder; bunlar, bugüne kadar iyi farklılaşmış bir fenotip 6,11,12'yi korumak için tipik olarak daha az fizyolojik jel tipi matrislere güvenmiştir. Mevcut platform, desellülarize akciğer dilimlerinin 24,25,26,27,28,29 yeniden popülasyonunda yapılan önceki çalışmalara dayanmaktadır, ancak çeşitli avantajlar sunmaktadır: 1) desellülarizasyon, tohumlama ve kültür sırasında ELT kullanımını kolaylaştırmak için bir doku kültürü kaset sistemi; 2) Her dilim iskelesinde bilinen sayıda hücreyi tam olarak tohumlamak için özelleştirilmiş bir tohumlama banyosu; ve 3) epitelyal, mezenkimal ve endotel hücreleri ile alveoler doku repopulasyonunu sağlayan bir üçlü kültür yeniden tohumlama stratejisi. Bu nedenle, ELT'ler, doğal alveolus ve AEC2 kök hücre nişinin hücresel ve substrat karmaşıklığını yakalayan tekrarlanabilir in vitro modeller oluşturmaya yönelik önemli bir adımı temsil etmektedir.

Alveoller, distal akciğerin fonksiyonel birimleridir ve alveoler epitel tip 1 hücreleri (AEC1'ler) ve tip 2 hücreleri (AEC2'ler) ile kaplı gaz alışverişi yapan hava sahalarının bir örgüsünü içerir. Epitelin altında yoğun bir kılcal damar ağı ve mezenkimi destekler, hepsi bu hassas hava keseciklerine hem güç hem de esneklik sağlayan hücre dışı bir matris (ECM) iskelesi ile desteklenir1. Alveoller ayrıca idiyopatik pulmoner fibroz2, akut solunum sıkıntısı sendromu3 ve şiddetli koronavirüs hastalığı-19 (COVID-19)4 dahil olmak üzere birçok akciğer patolojisinde yaralanma yeridir. Son on yıldaki çalışmalar akciğer epitelinde dikkate değer bir plastisite ortaya çıkarmış olsa da, bazı ortamlarda distal akciğer onarımını sağlayan - ve diğerlerinde onarımı engelleyen - mekanizmalar yoğun bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir5. Alveolusu modellemek için geliştirilmiş in vitro platformların geliştirilmesi, alveolar biyoloji, rejenerasyon ve terapötiklerin çalışmalarını kolaylaştıracaktır.
AEC2'ler kendiliğinden yenilenir ve AEC1'lere farklılaşır ve böylece distal akciğerin birincil kök hücresi olarak kabul edilir 6,7,8. Bununla birlikte, bu hücreler, fenotip9 kaybı olmadan primer AEC2'lerin kültürlenmesiyle ilgili zorluklar göz önüne alındığında, in vitro çalışmaya özel bir zorluk teşkil etmektedir. Geleneksel 2 boyutlu (2D) kültürde, AEC2'ler düzleşir ve AEC1 benzeri hücrelerin bazı özelliklerini benimser10. Buna karşılık, 3D kültür stratejileri, en yaygın organoidler, birincil AEC2s6,11,12'deki farklılaşmış özelliklerin korunmasını destekler ve pluripotent kök hücre (PSC) kaynaklı AEC2s 13,14'ün uzun vadelikültürüne izin verir. Organoidler, distal akciğer gelişimi 15, viral enfeksiyon11,15 ve AEC2 ile ilişkili genetik hastalık13,16,17'yi modellemek için kullanılmış ve AEC2 biyolojisi ve rejenerasyonu hakkında önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu kültür modelleri tipik olarak sadece bir veya iki hücresel soydan oluşur ve hücreleri, doğal akciğer alveolusunun mimarisini veya ECM substratını özetleyemeyen jel tipi matrislere gömer.
ECM, moleküler, topolojik ve mekanik ipuçları yoluyla hücre fenotipinin ve davranışının kritik bir düzenleyicisidir; kök hücre kaderini düzenleyen dokuya özgü nişlerin önemli bir bileşenini içerir; ve yerel olarak salgılanan büyüme faktörlerinin kullanılabilirliğini modüle eden bir rezervuar görevi görür 18,19,20,21. Doğal ECM üzerindeki hücrelerin kültürlenmesi, in vivo dokuların biyolojisini modellemek için in vitro sistemlerin prediktif kapasitesini artırabilir. Hücresel materyali deterjanlar, enzimler veya fiziksel veya diğer yöntemlerle dokulardan uzaklaştıran bir işlem olan desellülarizasyon, dikkatli bir şekilde gerçekleştirildiğinde doğal bir organın ECM iskelesini büyük ölçüde koruyabilir22,23. Bu tür iskeleler 3D biyomimetik kültür için hücrelerle yeniden doldurulabilir. Bununla birlikte, desellülarize iskeleler doku mühendisliği uygulamaları için yaygın olarak kullanılırken, rutin hücre kültürü için kullanımları sınırlı kalmıştır. Daha önce yapılan birkaç çalışmada, akciğer dilimlerinin veya küçük akciğer dokusu segmentlerinin desellülarizasyonu ve resellülarizasyonu bildirilmiştir. Kavram kanıtı çalışmaları 24,25,26'ya ek olarak, fibroblast-matriks adezyonu 27,28'i incelemek ve hastalıklı akciğer matrislerinin fibroblast fenotip 27,29 üzerindeki etkisini araştırmak için yeniden doldurulmuş akciğer dilimleri kullanılmıştır. Hassas kesilmiş doku dilimleri oluşturmak için mevcut gelişmiş teknolojilerle, desellülarize akciğer dilimleri, alveolar, hava yolu ve vasküler alt yapıları korurken, hücreleri kültürlemek için uygun ve küçük ölçekli bir platform sunabilir. Birden fazla hücre tipinin dahil edilmesi, fizyolojik olarak ilgili bir 3D ortamda hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesini sağlayacaktır. Bununla birlikte, kültür süreci boyunca dokuların işlenmesini kolaylaştırmak ve bilinen sayıda hücreye sahip dokuların kontrollü ve tekrarlanabilir tohumlanmasını sağlamak için geliştirilmiş stratejilere ihtiyaç vardır.
Burada, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerini (PCLS) primer endotel hücreleri, AEC2'ler ve fibroblastlarla yeniden doldurarak mühendislik akciğer dokuları (ELT'ler) oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Daha önce tarif edilen mühendislik ürünü kalp dokusu sistemi30 ve tüm akciğer desellülarizasyon-resellülarizasyon stratejilerimiz 22,31'in bir uyarlamasında, PCLS'yi sıçan akciğerlerinden kesmek ve dilimleri aşağı akış manipülasyonlarını basitleştiren ve standartlaştıran yeniden kullanılabilir doku kültürü kasetlerine kırpmak için prosedürleri açıklıyoruz. Kırpılmış dilimler, özelleştirilmiş tohumlama banyolarında yeniden doldurulan asellüler ECM iskeleleri oluşturmak için hücresellikten arındırılır. Akciğer dilim iskeleleri, kritik ECM bileşenlerini ve mimarisini korur ve AEC2'lerin çok soylu alveolar benzeri yapılar içinde büyümesini en az 7 gün boyunca destekler. ELT'ler, fizyolojik olarak ilgili bir 3D matris içinde, akciğer dokusu mühendisliği stratejilerinin gelişimini desteklemesi gereken ve AEC2'lerin ve alveollerin temel biyolojik çalışmalarını kolaylaştıran yeni bir alveolar ko-kültür sistemini temsil eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer: Form 2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Bromo cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, UltraPure LMP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed reducer fitting, 3/8 inch x 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase nuclease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-104P</td>
			<td>For AEC2 growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), standard grade</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>For benzonase buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Check valve, polypropylene, 1/8 inch hose barb</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>SK-98553-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>2520691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Resin, 1 L</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td>RS-F2-GPCL-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue, such as Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td>
			<td>Any hardware, craft, or drug store</td>
			<td>KG483 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (low glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11885-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5 M, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB00502-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EdU kit (Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10340</td>
			<td>Used according to manufacturer&#39;s directions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow fitting, 3/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11765-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS), characterized</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-100P</td>
			<td>Reconstituted in diH2O for a stock solution at 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>MiniArco</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS), Phenol Red Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection, USP, 1000 U/mL</td>
			<td>Sagent</td>
			<td>NDC: 25021-400-30</td>
			<td>For intraperitoneal and intracardiac injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td>For pulmonary artery perfusion; prepare stock solution at 100 U/mL in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline tee fitting, 3/8 inch x 1/8 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5121K851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loop, disposable</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine injection, 100 mg/mL</td>
			<td>Covetrus (Butler Animal Health)</td>
			<td>010177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KGF, recombinant human</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutter, VLS 3.50 30 watt</td>
			<td>Universal Laser Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, female, 3/32 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/8 inch</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-lock, male, 1/4 inch</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB-131 Complete without serum</td>
			<td>VEC Technologies</td>
			<td>MCDB-131 WOFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2), 1 M</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB09006-00100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>American Bioananalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), without Ca2+ and Mg2+, 10X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>Reconstitute to 1X with diH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), with Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21300-058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS - SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL penicillin/10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 150 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic film (parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmed BPT tubing, LS 17</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06508-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 14</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 16</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96420-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum-cured silicone tubing, LS 36</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>96410-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone/iodine prep pads, 10%</td>
			<td>Dynarex Corporation</td>
			<td>1108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.060 inch (1/16 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.060X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette tabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE sheet, 0.093 inch (3/32 inch) thick</td>
			<td>ePlastics</td>
			<td>PTFENAT0.093X12X12</td>
			<td>For tissue culture cassette frames and clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump drive: Masterflex L/S Variable-Speed Digital Drive</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>ZM-07528-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head: Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-77202-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat, Sprague Dawley</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain Code: 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td>Any hardware or craft store</td>
			<td>Personna 94-120-71 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary blades, 28 mm</td>
			<td>Omnigrid</td>
			<td>2046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary cutter, 28 mm</td>
			<td>Olfa</td>
			<td>Model 9551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrorusside (SNP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopcock, 4-way</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>594WSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 4-0 monofilament polypropylene</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>VP-557-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 50 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 35 mm</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish, 100 mm</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate, 6-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plate 12-well</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris, 1 M solution, pH 8.0</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB14043-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02025-00500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td>
			<td>Precisionary Instruments LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine, 100 mg/mL</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC: 11695-4022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-connector, 1/16 inch barbed</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30614-43</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineered lung tissues prepared from decellularized lung slices

Doğal akciğer alveolus ex vivo'nun mimari ve hücresel karmaşıklığını özetleyen geliştirilmiş 3 boyutlu (3D) akciğer modellerine ihtiyaç vardır. Son zamanlarda geliştirilen organoid modeller, akciğer epitel progenitörlerinin in vitro olarak genişlemesini ve incelenmesini kolaylaştırmıştır, ancak bu platformlar tipik olarak fare tümöründen türetilmiş matris ve / veya seruma dayanır ve sadece bir veya iki hücresel soyu içerir. Burada, desellülarize hassas kesimli akciğer dilimlerinin (PCLS) çok soylu resellülarizasyonuna dayanan mühendislik ürünü akciğer dokuları (ELT'ler) üretmek için bir protokol açıklanmaktadır. ELT'ler, doğal akciğerinkine çok benzeyen hücre dışı matriks (ECM) substratı içinde alveoler epitel, mezenkim ve endotelden oluşan alveolar benzeri yapılar içerir. Dokuları oluşturmak için, sıçan akciğerleri agaroz ile şişirilir, 450 μm kalınlığında dilimler halinde dilimlenir, şeritler halinde kesilir ve hücresellikten arındırılır. Elde edilen asellüler ECM iskeleleri daha sonra primer endotel hücreleri, fibroblastlar ve alveoler epitel tip 2 hücreleri (AEC2'ler) ile yeniden tohumlanır. AEC2'ler ELT kültüründe serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış bir büyüme ortamı ile en az 7 gün muhafaza edilebilir. Doku hazırlama ve kültür süreci boyunca, dilimler paralel olarak birden fazla ELT'nin işlenmesini ve standartlaştırılmış hücre tohumlamasını kolaylaştıran bir kaset sistemine kırpılır. Bu ELT'ler, alveol içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin yanı sıra AEC2'leri ve nişlerini düzenleyen biyokimyasal sinyallerin araştırılmasını kolaylaştırması gereken organotipik bir kültür platformunu temsil eder.

Akciğer dilimleme, dilimleme kırpma ve desellülarizasyon ve iskele yeniden popülasyonunu içeren ELT'leri üretme sürecine genel bir bakış Şekil 3'te sunulmuştur. Burada sunulan ELT'ler primer sıçan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu), yenidoğan sıçan AEC2'ler ve lipofibroblastla zenginleştirilmiş yenidoğan sıçan akciğer fibroblastları36 kullanılarak kültürlenmiştir. AEC2'ler, daha önce tarif edildiği gibi manyetik boncuk bazlı sıralama yoluyla yeni izole edildi37; alternatif izolasyon protokolleri başka yerlerde detaylandırılmış ve tartışılmıştır38,39,40. İzole sıçan AEC2'lerin saflığı, sıçana özgü AEC2 yüzey belirteci RTII-7041 için akış sitometrisi veya RTII-70 veya pro-yüzey aktif madde protein C (pSPC) için sitosantrifüjlü bir hücre örneğinin boyanması yoluyla değerlendirilebilir. Sıçan akciğer fibroblastları, yayınlanmış bir protokol42'nin uyarlanmasına göre doğum sonrası gün 7-9 sıçan yavrularından izole edildi ve pasaj 1-2'de kullanıldı; alternatif izolasyon protokolleri başka bir yerde tanımlanmıştır43,44. İzole fibroblastların saflığı, mezenkimal belirteç vimentin için kültürlenmiş veya sitosantrifüj hücrelerin boyanması yoluyla değerlendirilebilir ve lipofibroblast zenginleştirmesi, Yağ Kırmızı O45 için boyama yoluyla değerlendirilebilir.
Akciğer dokusu agaroz ile düzgün bir şekilde şişirildiğinde ve doku parçaları toplam ve parankimal doku alanını en üst düzeye çıkarmak için stratejik olarak seçildiğinde ve dilimleme için yönlendirildiğinde, bir sıçan akciğeri >100 alveoler ELT için doku verebilir. PCLS şeritleri, az sayıda (%<5) yırtılma örneği ile doku kasetlerine kırpılmak için yeterli mekanik bütünlük sergiler (Şekil 3B).
Akciğer dilimlerini desellülarize etme protokolü, daha önce yayınlanmış olan tüm akciğer desellülarizasyon protokolümüze yakından dayanmaktadır; kantitatif proteomikler tarafından birçok ECM bileşenini doğal akciğer 22'dekilerden önemli ölçüde farklı olmayan seviyelerde koruduğu gösterilmiştir. Desellülarize dilim iskeleleri, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama (Şekil 4A, B) ve faz kontrast mikroskobu (Şekil 4C) ile görüldüğü gibi, alveollerin doğal mimarisini korur. Genellikle büyük hava yolları veya damarlar (Şekil 4D) veya gözyaşları içeren iskeleleri hariç tutarız, ancak birincisi araştırmacının ilgisini çekiyorsa dahil edilebilir. Desellülarizasyon, çift sarmallı DNA için yapılan bir tahlille ölçülen doku DNA içeriğinde% 96'lık bir azalmaya yol açar (bkz. Malzeme Tablosu; 0.50 μg / mg ± 0.073 μg / mg vs 0.018 μg / mg ± 0.0035 μg / mg doğal ve desellülarize dokuda, sırasıyla, ortalama ± SEM) (Şekil 5A), hematoksilin boyama ile görülebilen DNA yoktur (Şekil 4B). Desellülarize iskelelerin histolojik ve immünofloresan boyanması, ECM proteinleri kollajen, elastin, kollajen IV ve lamininin doğal akciğer dilimlerindekine benzer mimari ve miktarla korunduğunu ortaya koymaktadır (Şekil 5B-E). Doğal dokuların çekirdeklerinin trikomon (kollajen için) ve EVG (elastin için) lekeleri ile mavi / siyah boyadığını unutmayın. İmmünofloresan boyama, dokuları boyamak için standart yöntemler kullanılarak daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirilmiştir37. Kullanılan antikorlar ve konsantrasyonları Tablo 4'te listelenmiştir.
Başarılı iskele repopulasyonu, 7 gün sonra yüksek hücresel ELT'lere yol açar ve ışık mikroskobu ile görülebilen alveolar benzeri bir repopulasyon paterni vardır (Şekil 6A-C). Bazı durumlarda, çok yüksek hücresellikte, organoid tipi yapılar görülebilir (Şekil 6A, B). Başarısız doku tohumlaması, kültür sırasında faz-kontrast mikroskopisi ile görselleştirilebilir (Şekil 6C). Doku iskelelerinin AEC2'ler, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile kültürlenmesinden sonra, ELT'ler üç hücre soyunun tümünü içeren alveolar benzeri yapılarla yoğun bir şekilde yeniden doldurulur (Şekil 6D, E). 7. veya 8. günlerde, AEC2'ler küboidal morfolojiyi korur ve AEC1'lere önemli bir farklılaşma kanıtı olmadan sürfaktan protein-B (SPB) ve lamel vücut proteini ABCA3'ü eksprese eder (Şekil 6E, F). AEC2'ler, 10 μM'de 2 saatlik bir darbeyi takiben 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) birleşmesi ile gösterildiği gibi, ELT'lerde oldukça proliferatiftir (Şekil 6G).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg"> Şekil 1: Akciğer ekstraksiyonu ve temizlenmesi için perfüzyon sisteminin şeması. (A) Perfüzyon sistemi, pulmoner arterin akış altındaki ilk kanülasyonu için kullanılan yerçekimi güdümlü bir uzuvdan oluşur; ve ilk kanülasyondan sonra akciğerleri verimli bir şekilde temizlemek için kullanılan pompa tahrikli bir uzuv. Pompa hattı, pompanın neden olduğu basınçtaki ani artışları sönümleyen bir "darbe sönümleyici" içerir. Trakeal ve pulmoner arteriyel kanüllerin tasarımı solda detaylandırılmıştır. SNP = sodyum nitroprussid. (B) Darbe sönümleyici tertibatının detayları. BPT ve silikon, boru tiplerini ifade eder. (C) Akciğer ekstraksiyonu sırasında yerleştirilen trakeal ve pulmoner arteriyel kanüllerin pozisyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg"> Şekil 2: Üç soylu hücreselleştirme için kültür zaman çizelgesi. İki fazlı tohumlamanın zamanlaması da dahil olmak üzere üç soylu ELT tohumlaması ve kültürü için önerilen zaman çizelgesi. Her faz için tohumlama ve kültür ortamı için hücre sayıları belirtilmiştir. Kültür medyası ayrıntılarına Tablo 3'te bakın. AEC2 = alveoler epitel tip 2 hücre. EC = endotel hücresi. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg"> Şekil 3: Mühendislik ürünü akciğer dokusu preparatının şeması . (A) Doğal akciğer dokusu bir vibratom kullanılarak dilimler halinde kesilir. (B) Hassas kesimli akciğer dilimleri, standartlaştırılmış 3 mm genişliğinde şeritler halinde kesilir, politetrafloretilen (PTFE) doku kültürü kasetlerine kırpılır ve asellüler hücre dışı matris iskeleleri üretmek için deterjandan arındırılır. (C) İskeleler, tohumlama alanını doku alanıyla sınırlayan özel tohumlama banyolarında yeniden tohumlanır ve daha sonra standart bir kuyu plakasında kültürlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg"> Resim 4: Desellülere akciğer iskelelerinin yapısı. Doğal (A) ve desellülarize (B) akciğer dilimlerinin H&E boyaması, desellülarizasyon sonrası alveoler mimarinin korunduğunu göstermektedir. (C,D) Faz kontrast mikroskobu ile 5x büyütmede görülen, ağırlıklı olarak alveoler dokudan (C) oluşan veya büyük dallanan hava yolları ve damarlar (D, siyah ve kırmızı ok uçları) içeren desellülarize ECM iskelelerinin örnekleri. Ölçek çubukları, 50 μm (A,B); 500 μm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg"> Şekil 5: Desellülerize akciğer iskelelerinde DNA çıkarılması ve matriks korunması. (A) Doğal ve desellülarize akciğer dilimlerinde DNA'nın nicelleştirilmesi (ortalama ± SEM, n = 5). Welch'in t testi, **P < 0.01. Decell = decellularized. (B,C) Kollajen (B) ve elastin (C) için doğal ve desellülere akciğer dilimlerinin histolojik boyanması. Ok uçları, desellülarize dokunun alveolar giriş halkalarında korunmuş elastin. (D,E) Kollajen IV (D) ve laminin (E) için doğal ve desellülarize akciğer dilimlerinin immünofloresan boyanması. Ölçek çubukları, 50 μm. Tüm panellerde, noktalı kutular ilgili her panelde sağa doğru büyütülen görüntü bölgesini ana hatlarıyla belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg"> Şekil 6: Mühendislik ürünü akciğer dokularının hücresel yeniden popülasyonu. (A-C) Kültürün 7. gününde resellülarize edilmiş ELT örnekleri, kültür sırasında faz kontrast mikroskobu ile görselleştirildiği gibi. Resellülarizasyon paterni, dokunun alveolar yapısını yansıtır. Yüksek hücreselliğin bazı bölgelerinde, organoid benzeri yapılar oluşabilir (ok uçları). (A) ve (B) başarılı hücre yeniden popülasyonunu temsil ederken, (C) 7 günlük kültürden sonra zayıf bir resellülarizasyon seviyesini temsil eder. (D-G) Resellülarize ELT'lerin kültürün 7. veya 8. gününde boyanması. (D) Alveoler septanın hücresel repopulasyonunu gösteren H&E boyaması. (E) İmmünofloresan boyama etiketleri aşılanmış proCollagenIα1+ fibroblastlar, ABCA3+ AEC2'ler ve CD31+ endotel hücreleri. (F) Dokular bol miktarda SPB + AEC2 içerir, ancak bu koşullar altında az sayıda RTI-40 (podoplanin) + AEC1 içerir. (G) Birçok AEC2, EdU kuruluşu ile ölçülen ELT'lerde çoğalmaktadır. Ölçek çubukları, 500 μm (A-C); 25 μm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Desellülarizasyon çözümleri. Desellülarizasyon çözeltileri için hazırlık detayları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 2: Decellularizasyon protokolü. Akciğer dilimlerini desellülarize etmek için protokol detayları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 3: Kültür medyası. Endotel ve AEC2 büyüme ortamı için hazırlık detayları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 4: İmmün boyama için kullanılan antikorlar. Antikorların detayları ve immün boyama için kullanılan konsantrasyonları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 1: Lazer kesim doku kültürü kaset çerçeveleri için tasarım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 2: Lazer kesim doku kültürü kaset klipsleri için tasarım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 3: Lazer kesim doku kültürü kaset tırnakları için tasarım. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 4: Banyo kalıp tabanının tohumlanması için CAD dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 5: Banyo kalıp halkasının tohumlanması için CAD dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices at JoVE.com

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Bu protokol, desellülarize hassas kesilmiş akciğer dilimlerini alveoler epitel tip 2 hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri ile yeniden doldurarak tekrarlanabilir, küçük ölçekli mühendislik ürünü akciğer dokuları oluşturmak için bir yöntemi açıklar.

Desellülerize Akciğer Dilimlerinden Hazırlanan Mühendislik Akciğer Dokuları

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Bu protokol, bozulmamış akciğer hücre dışı matriksinin üç boyutlu bir doku kültürü substratı ve orta derecede verim olarak tekrarlanabilir kullanımını sağlar. Tasarlanmış akciğer doku sisteminin temel avantajı, platformun esnekliğidir. ELT'ler, çeşitli doku iskelelerini, hücreleri veya ilgilenilen kültür ortamlarını kullanacak şekilde uyarlanabilir.Akciğerler çıkarıldıktan sonra, 10 mililitrelik bir şırıngayı agaroz ve HBSS ile fenol kırmızısı olmadan doldurun. Akciğerleri trakea kanülü yoluyla yaklaşık 10 mililitre hava ile şişirin, ardından hazırlanan agarozu hemen trakea kanülü yoluyla akciğer loblarının en distal uçları şişirilene kadar enjekte edin. Beyaz kapağı dört yönlü bir stopcock'tan trakea kanülünün dişi luer kilidine takarak trakeayı kapatın.Akciğeri, agarozun katılaşmasını sağlamak için buz üzerine 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Akciğer dilimlerini makaledeki protokole göre hazırlayın ve ardından 100 milimetrelik bir Petri kabını 1/3 hacim PBS ile doldurun. Forseps kullanarak kasetleri ve tırnakları tabağa aktarın.Dilimler donmuşsa, oda sıcaklığındaki PBS'ye dökerek her seferinde bir tabak çözülür. Ardından, çözülmüş bir dilimi 150 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. İnce forseps veya hemostat kullanarak dilimi yavaşça açın ve fazla PBS'yi dokunun etrafından dikkatlice aspire edin.Ardından, bir tıraş bıçağının tam uzunluğunu tabağa sıkıca bastırarak ve hafifçe yan yana sallayarak dilimden üç milimetre genişliğinde, en az dokuz milimetre uzunluğunda bir şerit kesin. Doku şeridini kasete klipslemek için, kasetin üzerinde yüzdürün ve her iki ucundaki klipslerdeki delikleri aşacak şekilde dikkatlice ortalayın. İnce forsepslerle bir ucundaki deliğe kısmen bir sekme yerleştirin, dokuyu yavaşça düzeltin ve ikinci tırnağı ayarlayın.Son olarak, dokuyu sabitlemek için her tırnağa tamamen basmak için forseps kullanın. Tüm tarafları kırptıktan sonra, kasetleri içeren 100 milimetrelik çanağı laminer bir akış başlığına aktarın. Kasetleri, çentikli tarafları kavramak için kavisli bir hemostat kullanarak ilk hücreselleştirme çözeltisini içeren altı delikli plakalara aktarın.Ardından, altı kuyucuklu plakayı 10 dakika boyunca 30 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin. Sıvıyı her bir kuyucuktan aspire edin, ardından kuyucuk başına ikinci desellülarizasyon çözeltisinin üç mililitresi ile değiştirin. Plakayı 30 RPM'de yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin ve beş dakika boyunca inkübe edin.Bu işlemi, makaledeki hücresellikten arındırma protokolünde belirtildiği gibi her bir çözümle tekrarlayın. PBS ile son durulamadan sonra, dokuları antibiyotik ve antimikotiklerle taze PBS içeren steril altı kuyucuklu plakalara aktarın ve 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Antibiyotikler ve antimikotiklerle sterilizasyondan sonra, akciğer dokusu iskeleleri hemen tohumlanabilir veya 30 güne kadar dört santigrat derecede saklanabilir.Kültür için kullanmadan önce, ek bir sterilizasyon adımı olarak dört santigrat derecede depolanan iskeleleri, taze PBS ve antibiyotikler ve antimikotiklerle gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, iskeleleri steril PBS ile, kuyu başına beş mililitre, üç kez, her biri beş dakika boyunca durulayın. İskeleleri, tohumlama için dokuları seçmek için 5X büyütmede bir faz kontrast mikroskobu altında inceleyin.Endotel hücre süspansiyonunu endotel ortamında mililitre başına 5 milyon hücrede, dilim başına 500.000 endotel hücresi tohumlamak için yeterli hücreyle hazırlayın. Otoklavlanmış tohumlama banyolarını 100 milimetrelik Petri tabaklarına yerleştirin ve durulama iskelelerini baş aşağı dikkatlice tohumlama banyolarına aktarın. Hazırlanan hücre süspansiyonunu karıştırmak için yavaşça döndürün.Daha sonra, 100 mikrolitre hücreyi doğrudan kuyucukların tabanındaki her bir dokunun üzerine dikkatlice pipetleyin ve pipet ucu ile dokuya zarar vermemeye özen gösterin. Tohumlanmış dokuları hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Endotel hücresi tohumlamasından 24 saat sonra, manuel bir pipet kullanarak her bir kuyucuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin, ardından plakayı inkübatöre geri verin.24 saatlik hücre tohumlamasından sonra, ortamı çıkarın ve kuyucuk başına bir mililitre taze endotel ortamını değiştirin. Endotel hücrelerinin tohumlanmasından 72 saat sonra, AEC2'leri veya alveolar epitel tip II hücrelerini ve bir hemositometre kullanarak fibroblastları sayın ve AEC2 büyüme ortamında mililitre başına 5 milyon hücrede 1: 1 hücre süspansiyonu hazırlayın. Her tohumlama banyosundan gelen ortamı iyice pipetleyin ve hazırlanan hücre süspansiyonunu yavaşça döndürün.Pipet, kuyunun tabanındaki her bir dokunun hemen üstüne 100 mikrolitre hücre koyar. Tohumlanmış dokuları hücre kültürü inkübatörüne aktarın. İki saat sonra, her bir kuyucuğa 900 mikrolitre önceden ısıtılmış AEC2 büyüme ortamı ekleyin, ardından plakayı inkübatöre geri verin.AEC2'ler ve fibroblastlar ile 24 saatlik kültürden sonra, kaset başına kuyu başına bir mililitre önceden ısıtılmış AEC2 büyüme ortamı içeren 12 delikli bir plaka hazırlayın. Tohumlama banyosunun her bir kuyucuğundan 800 mikrolitre orta pipet alın, daha sonra kasetleri tohumlama banyosundan çıkarın ve sağ taraftan hazırlanan 12 delikli plakaya, kuyu başına bir kasete aktarın. İstenilen kültür süresi boyunca her gün bir cam Pasteur pipet kullanarak kültür ortamını dikkatlice değiştirin.Kültür süresi boyunca 5X büyütmede faz kontrast mikroskobu ile doku yeniden popülasyonunun derecesini izleyin. Doku iskelelerinin H ve E boyamaları, görünür hücre çekirdeği olmadan desellülarizasyondan sonra korunmuş alveoler mimari göstermiştir. Alveolar doku, desellülarize ekstrasellüler matriks iskeleleri faz kontrast mikroskobu ile 5X büyütmede görüntülendiğinde gözlendi.Bazı dilimlerde büyük dallanan hava yolları ve damarlar da görülebiliyordu. Kültürün yedinci gününde, faz kontrast mikroskopisi, mühendislik ürünü akciğer dokularındaki resellülarizasyon paterninin, başarılı repopulasyon vakalarında dokuların alveoler yapısını taklit ettiğini göstermiştir. Zayıf resellülarizasyon da görülebiliyordu.Yedi veya sekizinci günde H ve E boyaması, alveoler septanın yeniden popülasyonunu gösterdi. İmmünofloresan ayakta, pro-kollajen tip I alfa 1-pozitif fibroblastlar, ABCA3-pozitif AEC2'ler, CD31-pozitif endotel hücreleri, bol miktarda SPB-pozitif AEC2'ler ortaya çıktı. Dahası, timidin testi birçok çoğalan AEC2 gösterdi.Bu teknik, akciğer doku mühendisliği için stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırmış ve alveolus içinde tip II hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını destekleyen kuyrukların araştırılmasını sağlamıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Procedure for Lung Engineering

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Fetal Akciğer Hücrelerinde Mechanotransduction Okumak Deneysel Bir Sistem

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

In Vivo Miyokardiyal Onarım için İnsan iPS Hücrelerinden Elde Edilen Örgü Şekilli Mühendislik Kardiyak Dokuların Hazırlanması

The current protocol describes methods to generate scalable, mesh-shaped engineered cardiac tissues (ECTs) composed of cardiovascular cells derived from ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues

Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi

Accurately modeling healthy and disease conditions in vitro is vital for the development of new treatment strategies and therapeutics. For cardiac and ...

Regional Decellularized Lung Tissue Isolation to Study Cell-Cell and Cell-ECM Interactions

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue

Dissection and Isolation of Region-Specific Decellularized Lung Tissue (Video) | JoVE 

Bölgeye Özgü Desellülarize Akciğer Dokusunun Diseksiyonu ve İzolasyonu

Lung transplantation is often the only option for patients in the later stages of severe lung disease, but this is limited both due to the supply of ...