Name: ex vivo hepatic perfusion through the portal vein in mouse
Uploaded: 2022-03-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par un financement des National Institutes of Health (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Une partie de ce travail a été effectuée au McKnight Brain Institute du National High Magnetic Field Laboratory’s Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) Facility, qui est soutenu par l’accord de coopération no de la National Science Foundation. DMR-1644779 et l’État de Floride.

Les expériences impliquant des souris ont été traitées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride (numéro de protocole n ° 201909320). La souche de souris utilisée était C57BL/6J; toutes les souris étaient des mâles. Cette méthode est généralement applicable aux études utilisant d’autres souches de souris standard. Cette chirurgie est réalisée de manière optimale par deux personnes travaillant ensemble.
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	<li>Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+Dihydroxyacetone+Is+a+Sensitive+Probe+of+Hepatic+Gluconeogenic+State.">Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State.</a> Metabolites. 11 (7), 441 (2021).</li><li>Lumata, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperpolarized+(13)C+Magnetic+Resonance+and+Its+Use+in+Metabolic+Assessment+of+Cultured+Cells+and+Perfused+Organs.">Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs.</a> Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).</li><li>Moreno, K. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+butylated+hydroxylanisole+against+hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+in+primary+cultured+mouse+hepatocytes.">Protective effect of butylated hydroxylanisole against hydrogen peroxide-induced apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 16 (1), 17-23 (2015).</li><li>Bessems, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+liver:+standardization+of+a+time-honoured+model.">The isolated perfused rat liver: standardization of a time-honoured model.</a> Laboratory Animals. 40 (3), 236-246 (2006).</li><li>Beal, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Small+Animal+Model+of+Ex+Vivo+Normothermic+Liver+Perfusion.">A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57541 (2018).</li><li>Collins, J. B., Song, J., Mahabir, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+duration+of+intradermal+mixtures+of+bupivacaine+and+lidocaine+with+epinephrine.">Onset and duration of intradermal mixtures of bupivacaine and lidocaine with epinephrine.</a> The Canadian Journal of Plastic Surgery. 21 (1), 51-53 (2013).</li><li>. Medical Dictionary Available from: <a target="_blank" href="https://www.merriam-webster.com/medical">https://www.merriam-webster.com/medical</a> (2022)</li><li>Thorpe, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Dissection in Color: The Rat (and the Sheep's Brain). , (1968).</li><li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion.">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).</li><li>. Operations Manual Setup, Installation and Maintenance Available from: <a target="_blank" href="https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf">https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf</a> (2006)</li><li>. Heparin Available from: <a target="_blank" href="https://go.drugbank.com/drugs/DB01109">https://go.drugbank.com/drugs/DB01109</a> (2022)</li><li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues:+studies+in+a+C57BL/6J+mouse+model.">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PloS One. 10 (2), 0117232 (2015).</li></ol>

Cette intervention chirurgicale est difficile et nécessite une pratique approfondie pour obtenir des résultats reproductibles. L’isoflurane et le gaz porteur doivent être ajustés au besoin pour maintenir la viabilité de l’animal pendant la plus grande partie possible de l’intervention chirurgicale. L’environnement, l’heure de la journée, l’âge, le poids et plusieurs autres facteurs affecteront l’anesthésie. Le poids, l’alimentation, la souche de souris et l’âge pourraient affecter la chirurgie ...

Les perfusions ex vivo sont cruciales dans l’étude du métabolisme hépatique, et la perfusion par la veine porte est la norme pour ces études. Afin d’étudier le métabolisme hépatique isolément, le foie doit être réséqué du corps pour éviter les complications découlant du métabolisme dans d’autres organes (c.-à-d. le métabolisme du corps entier) et pour exercer un contrôle sur la disponibilité des hormones (insuline, glucagon, etc.). Cette approche peut être essentielle pour comprendre les effets de maladies telles que le diabète, la NAFLD et la NASH sur le métabolisme hépatique ainsi que les mécanismes d’action des médicaments. Cet article sert de guide pour la résection hépatique et la perfusion. Nous avons développé une procédure simplifiée pour effectuer ces études métaboliques du foie avec suffisamment de rigueur et de reproductibilité. Si la chirurgie n’est pas effectuée correctement, il existe une variabilité prononcée dans les données métaboliques obtenues. Nous décrivons une méthode organisée pour effectuer un cathétérisme de la veine porte et une résection hépatique dans le cadre d’études métaboliques in situ dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire (RMN), comme décrit dans la littérature 1,2,3,4,5.
Actuellement, il n’existe aucune littérature décrivant une perfusion hépatique ex vivo à l’aide d’une colonne de verre dans une RMN. Il n’y a pas non plus de publication vidéo ou textuelle fournissant un exemple clair de la façon d’effectuer la procédure avec le foie de souris, en particulier, démontrant comment cathétériser la veine porte, réséquer un foie, transférer et accrocher le foie à une colonne de verre. Comme la souris génétiquement modifiée est omniprésente pour étudier le métabolisme hépatique, il s’agit d’une procédure essentielle qui mérite une description complète. Les chirurgies de perfusion hépatique ne sont pas nouvelles, mais cet article est une méthode de référence accompagnée d’une vidéo démontrant l’excellence technique décrite dans cet article pour aider toutes les personnes intéressées par cette procédure. La méthode présentée ici serait mieux appliquée au métabolisme en temps réel pour détecter la fonction et le renouvellement des métabolites dans les modèles de maladie.
Cette méthode utilise une colonne de verre gainée d’eau de 100 cm, qui permet au foie de pendre au fond de la canule encapsulée par du perfusat à l’intérieur d’un tube RMN. L’eau chauffée dans la gaine de verre est utilisée pour contrôler la température du perfusate. Un oxygénateur à couche mince est pressurisé avec 95% / 5% O2 / CO2 pour le contrôle du pH. En utilisant trois pompes séparées, la hauteur de la colonne de perfusat est réglée, ce qui fournit une pression constante au foie. Les débits ne sont pas contrôlés au-delà de l’application d’une pression constante (Figure 1). Pour confirmer que le foie fonctionne correctement, des mesures d’oxygène sont prises avec les débits. Entre nos mains, cet ensemble de conditions préalables conduit à des expériences de RMN hautement reproductibles pour l’évaluation de la fonction métabolique du foie.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Luer-Lock Single Use Sterile Disposable Syringe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-specific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 cm Water Jacketed Glass Column</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-0 Silk Suture</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 Gauge Catherter 1 in. Without Safety</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SRFF2225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G 0.75 in. Hypodemeric Needles</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G 1.5 in. Hypodemeric Needles</td>
			<td>Exel International</td>
			<td>26426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x4 in. Surgical Platform</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom Made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Alcohol Wipe</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-specific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating Water Bath</td>
			<td>MS Lauda</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Model no longer manufactured</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-specific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate Operating Scissors; Straight; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4 3/4 &#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>13015-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injectable 1000 units/mL</td>
			<td>RX Generics</td>
			<td>71288-0402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>14043-0704-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine HCl 2%</td>
			<td>VEDCO Inc.</td>
			<td>50989-0417-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane-Thin-Layer Oxygenator</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors; Curved; Blunt; 27 mm Blade Length; 5 &#34;</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Meter System</td>
			<td>Hanstech Instruments Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline 0.9% Solution</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Saline is made in lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-specific Brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Variable Speed Analog Console Pump Systems</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Models are custom per application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Non-specific Brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo hepatic perfusion through the portal vein in mouse

Les maladies métaboliques telles que le diabète, le prédiabète, la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) et la stéatohépatite non alcoolique (NASH) sont de plus en plus courantes. Les perfusions hépatiques ex vivo permettent une analyse complète du métabolisme hépatique à l’aide de la résonance magnétique nucléaire (RMN), dans des conditions nutritionnelles qui peuvent être rigoureusement contrôlées. Comme les simulations in silico restent un moyen principalement théorique d’évaluer les actions hormonales et les effets de l’intervention pharmaceutique, le foie perfusé reste l’un des bancs d’essai les plus précieux pour comprendre le métabolisme hépatique. Comme ces études guident les connaissances de base sur la physiologie hépatique, les résultats doivent être précis et reproductibles. Le plus grand facteur de reproductibilité de la perfusion hépatique ex vivo est la qualité de la chirurgie. Par conséquent, nous avons introduit une méthode organisée et rationalisée pour effectuer des perfusions hépatiques de souris ex vivo dans le contexte d’expériences de RMN in situ . Nous décrivons également une application unique et discutons des problèmes courants rencontrés dans ces études. L’objectif global est de fournir un guide simple d’une technique que nous avons affinée au cours de plusieurs années et que nous considérons comme la norme d’or pour obtenir des résultats reproductibles dans les résections et perfusions hépatiques dans le cadre d’expériences de RMN in situ . La distance au centre du champ pour l’aimant ainsi que l’inaccessibilité du tissu à l’intervention pendant l’expérience RMN rendent nos méthodes nouvelles.

La fonction hépatique est principalement évaluée par la consommation d’oxygène et le débit. Un débit de 4-8 mL/min et une consommation d’oxygène de 1 μmol/min.g sont typiques. Ces mesures varieront en fonction des conditions expérimentales spécifiques et des différences biologiques.
La quantité exacte d’isoflurane utilisée dépendra du type de système d’anesthésie utilisé ainsi que de l’environnement et de l’âge / poids de la souris. Pendant la chirurgie, l’isofl...

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Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Le protocole décrit une méthode simple de résection d’un foie de souris intact pour des études métaboliques par perfusion veineuse porte.

Ex Vivo Perfusion hépatique à travers la veine porte chez la souris

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Cette vidéo démontre une procédure simplifiée développée pour effectuer des études métaboliques du foie avec suffisamment de rigueur et de reproductibilité, qui peut servir de guide pour effectuer une résection hépatique pour ses études de perfusion vivo. La technique est mieux appliquée au métabolisme en temps réel pour détecter la fonction, dans les métabolites du chiffre d’affaires dans les modèles de maladie. La perfusion permet un contrôle précis des nutriments et des hormones disponibles pour le foie.Bien que la technique ne soit pas orientée vers la thérapie, les perfusions hépatiques peuvent être essentielles pour comprendre l’étiologie et l’impact de maladies telles que le diabète, la NAFLD et la NASH sur le métabolisme hépatique. Au fur et à mesure que de nouveaux produits pharmaceutiques sont développés, les méthodes d’évaluation du métabolisme énergétique central hépatique deviennent essentielles. Cette méthode peut être utilisée avec des modèles de plusieurs maladies, y compris les cancers et à plusieurs stades différents de la progression de la maladie.Pour commencer, placez le nez de la souris dans un cône de nez après l’induction de l’anesthésie et collez ses pattes. Administrer la lidocaïne par injection sous-cutanée bilatérale dans la région antérieure de la crête iliaque. Effectuez un test de pincement des orteils pour confirmer l’absence de tous les réflexes de douleur.Effectuez une céliotomie pour exposer les organes internes en faisant une incision de trois centimètres de large. Élargissez l’incision à l’aide d’un hémostat qui tire la traction en serrant le processus xiphoïde. Utilisez un applicateur à pointe de coton pour dégager le petit et le gros intestin recouvrant la veine porte.Placez une suture de soie sous l’arche de la veine porte proximale du foie. Placez la deuxième suture de soie proximale ou distale de la veine mésentérique inférieure distale du foie à l’aide d’une suture 2-0. Une fois les sutures en place, canulez la veine porte avec un cathéter de calibre 22, en gardant le biseau pointant vers le haut.Entrez dans la veine porte à un angle ne dépassant pas 15 degrés. Attachez la première suture au-delà du tapper du cathéter. Une fois la veine porte canulée, ancrez le cathéter distal de deux à trois millimètres de la branche de la veine porte avec la suture en soie.Fixez la partie inférieure du cathéter avec la deuxième suture. Nouez un nœud avec la suture pour fixer le cathéter à la partie distale de la veine porte et au tissu environnant. Une fois le cathéter fixé, insérez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 27 de 38,1 millimètres de longueur dans le cathéter pour rincer les bulles de sang et d’air.Utilisez un tube en silicone d’un millimètre de diamètre intérieur et de cinq millimètres de diamètre extérieur avec un robinet d’arrêt fixe pour coupler la colonne de perfusion au cathéter, permettant l’écoulement du tampon dans le foie, marquant le début de la perfusion. Après avoir démarré une minuterie, soulager la pression vasculaire accrue par incision à l’aide de ciseaux dans la veine cave inférieure. Confirmez l’écoulement du perfusat dans le foie en observant le changement homogène de la couleur du foie du rose ou du rouge au jaune pâle.Une fois le débit confirmé, excisez l’estomac, l’intestin grêle, le gros intestin et le rein droit des tissus environnants. Avec l’aide de l’assistant chirurgical, manœuvrez le foie autour de la cavité abdominale et thoracique pendant que le chirurgien coupe à travers le péritoine pariétal et le tissu thoracique pour réséquer le foie. Soulevez le foie vers le haut et coupez les tissus conjonctifs restants qui maintiennent le foie en place avec des ciseaux.Manipulez lentement le foie pour faciliter la vue. Les mesures du débit et de la consommation d’oxygène sont essentielles pour surveiller la santé et le fonctionnement du foie. Il y a souvent une légère différence dans la consommation d’oxygène entre les foies nourris et à jeun, ce qui peut être attribué à l’augmentation des demandes d’énergie imposées par la glucogenèse dans le foie à jeun.Les étapes les plus importantes comprennent l’insertion du cathéter à un angle de 15 degrés, la visualisation de la pointe du cathéter, le roulement du poignet et des épaules lors de l’attache de la suture et l’évitement de la torsion sur la veine porte. Le tissu excisé peut être étudié après la perfusion avec un certain nombre d’approches biochimiques ou analytiques. Les perfusions ex vivo combinées à l’IRM et à la spectroscopie en temps réel permettent de mesurer les flux métaboliques en temps réel.Naturellement, cela s’étend à la perturbation du flux d’un état de contrôle en réponse aux maladies.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Détection de l&#39;activité dépendant du pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; et<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

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