Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

تم دعم البحث الموصوف أعلاه من خلال منحة تدريب NIH TL1 TR002549-03. نشكر الدكتور جون سي تيلتون وزاكاري تروير (جامعة كيس ويسترن ريزيرف) لتسهيل الوصول إلى أداة تحليل حجم الجسيمات. Lew Brown (Spectradyne) للمساعدة التقنية في تحليل بيانات توزيع حجم الجسيمات ؛ الدكتور ديفيد بوتنام في جامعة كورنيل لتوفير البلازميد pClyA-GFP14 ؛ والدكتور مارك جوليان من جامعة بنسلفانيا لتزويدنا ب E. coli MP113.

ملاحظة: تأكد من أن جميع الأعمال التي تنطوي على البكتيريا والحمض النووي المؤتلف تتبع أفضل الممارسات لاحتواء السلامة الأحيائية المناسبة لمستوى خطر السلامة البيولوجية لكل سلالة. وينبغي أن يتم العمل وفقا للوائح السلامة الأحيائية المحلية والوطنية والدولية.
1. السلالات البك...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

في البروتوكول أعلاه ، يتم وصف طريقة قابلة للتطوير وتعزل المركبات الكهربائية بشكل موثوق من مختلف البكتيريا سالبة الجرام / الإيجابية والهوائية / اللاهوائية. لديها العديد من نقاط التوقف المحتملة طوال الإجراء ، على الرغم من أنه من الأفضل تجنب أخذ أكثر من 48 ساعة لعزل المركبات الكهربائية عن وسا...

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي هياكل تشبه الجسيمات الشحمية بحجم النانومتر تتكون من الليبيدات والبروتينات والجليكان والأحماض النووية ، تفرزها كل من الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة1. منذ الدراسات المبكرة التي تصور إطلاق EVs من البكتيريا سالبة الجرام2 ، كان عدد الوظائف البيولوجية المنسوبة إلى EVs البكتيرية (قطرها 20-300 نانومتر) ينمو باستمرار في العقود الماضية. وتشمل وظائفها نقل مقاومة المضادات الحيوية3 ، وتشكيل الأغشية الحيوية4 ، واستشعار النصاب5 ، وتوصيل السموم6. هناك أيضا اهتمام متزايد باستخدام المركبات الكهربائية البكتيرية كعلاجات ، خاصة في علم اللقاحات7 وعلاج السرطان8.
على الرغم من الاهتمام المتزايد بأبحاث المركبات الكهربائية ، لا تزال هناك تحديات تقنية فيما يتعلق بطرق العزل. على وجه التحديد ، هناك حاجة إلى طرق عزل قابلة للتكرار وقابلة للتطوير ومتوافقة مع الكائنات الحية المتنوعة المنتجة للمركبات الكهربائية. لإنشاء مجموعة موحدة من المبادئ لتخطيط والإبلاغ عن عزل EV وطرق البحث ، تقوم الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية بنشر وتحديث ورقة موقف MISEV9. علاوة على ذلك ، يوفر اتحاد EV-TRACK منصة مفتوحة للإبلاغ عن المنهجيات التفصيلية لعزل EV المستخدمة في المخطوطات المنشورة لتعزيز الشفافية10.
في هذا البروتوكول ، تم تكييف المنهجيات السابقة المستخدمة لعزل EVs من زراعة خلايا الثدييات11,12 لتمكين عزل EVs من زراعة الخلايا البكتيرية. سعينا إلى استخدام الأساليب التي تمكن من عزل EV من مجموعة متنوعة من الميكروبات ، والتي يمكن أن تكون قابلة للتطوير ، وتحقيق التوازن بين نقاء EV والعائد (كما تمت مناقشته في ورقة موقف MISEV9). بعد إزالة الخلايا البكتيرية والحطام عن طريق الطرد المركزي والترشيح ، يتركز وسط الاستزراع إما عن طريق الترشيح الفائق لجهاز الطرد المركزي (لحجم يصل إلى ~ 100 مل) أو TFF الذي يحركه المضخة (للأحجام الأكبر). ثم يتم عزل المركبات الكهربائية بواسطة SEC باستخدام أعمدة محسنة لتنقية المركبات الكهربائية الصغيرة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على سير عمل عزل EV البكتيري. الاختصارات: EV = حويصلة خارج الخلية ؛ TFF = ترشيح التدفق العرضي ؛ SEC = كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ؛ MWCO = قطع الوزن الجزيئي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
تم استخدام سلالة فأر كومنسال من Escherichia coli (أي E. coli MP113) ككائن نموذجي وتم تعديلها للتعبير عن نانولوسيفيراز المرتبط ب EV عن طريق الاندماج مع cytolysin A ، كما ورد سابقا14. يمكن للطرق المستخدمة هنا معالجة ما يصل إلى عدة لترات على الأقل من الثقافات البكتيرية وفصل البروتينات المرتبطة ب EV عن البروتينات غير المرتبطة ب EV بشكل فعال. أخيرا ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للأنواع البكتيرية الأخرى إيجابية الجرام وسالبة الجرام. تم تقديم جميع البيانات ذات الصلة بالتجارب المبلغ عنها إلى قاعدة معارف EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

تفرز الأنواع البكتيرية المتنوعة ~ 20-300 نانومتر حويصلات خارج الخلية (EVs) ، تتكون من الدهون والبروتينات والأحماض النووية والجليكان والجزيئات الأخرى المشتقة من الخلايا الأبوية. تعمل المركبات الكهربائية كناقلات اتصال داخل الأنواع وفيما بينها بينما تساهم أيضا في التفاعل بين البكتيريا والكائنات المضيفة في سياق العدوى والاستعمار. نظرا للعديد من الوظائف المنسوبة إلى EVs في الصحة والمرض ، هناك اهتمام متزايد بعزل EVs للدراسات في المختبر وفي الجسم الحي . تم افتراض أن فصل المركبات الكهربائية على أساس الخصائص الفيزيائية ، أي الحجم ، من شأنه أن يسهل عزل الحويصلات من الثقافات البكتيرية المتنوعة. 
يتكون سير عمل العزل من الطرد المركزي والترشيح والترشيح الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لعزل المركبات الكهربائية عن الثقافات البكتيرية. تم دمج خطوة ترشيح التدفق العرضي (TFF) التي تعمل بالمضخة لتعزيز قابلية التوسع ، مما يتيح عزل المواد من لترات زراعة الخلايا الأولية. تم استخدام الإشريكية القولونية كنظام نموذجي يعبر عن نانولوسيفيراز المرتبط ب EV و mCherry غير المرتبط ب EV كبروتينات مراسلة. تم استهداف nanoluciferase إلى EVs عن طريق دمج نهايته N مع cytolysin A. كانت كسور الكروماتوغرافيا المبكرة التي تحتوي على 20-100 نانومتر EVs مع السيتوليسين A - nanoLuc المرتبط بها متميزة عن الكسور اللاحقة التي تحتوي على البروتينات الحرة. تم تأكيد وجود نانولوسيفيراز المرتبط ب EV من خلال وضع العلامات المناعية والمجهر الإلكتروني المرسل. ينطبق سير عمل عزل EV هذا على الأنواع البكتيرية الأخرى سالبة الجرام وإيجابية الجرام المرتبطة بالأمعاء البشرية. في الختام ، يتيح الجمع بين الطرد المركزي والترشيح والترشيح الفائق / TFF و SEC عزلا قابلا للتطوير للمركبات الكهربائية من الأنواع البكتيرية المتنوعة. سيؤدي استخدام سير عمل عزل موحد إلى تسهيل الدراسات المقارنة للمركبات الكهربائية الميكروبية عبر الأنواع.

لتقييم أجزاء كروماتوغرافيا SEC التي تم إثراؤها ل EVs ، تم تحميل عمود SEC ب 2 مل من وسيط الاستزراع المشروط E. coli MP1 الذي تم تركيزه 1000 ضعف بواسطة TFF ، وتم جمع الكسور المتسلسلة. باستخدام MRPS ، وجد أن الكسور 1-6 تحتوي على معظم المركبات الكهربائية (الشكل 2 أ). احتوت الكسور اللاحقة على عد...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

تفرز البكتيريا حويصلات خارج الخلية بحجم النانومتر (EVs) تحمل جزيئات بيولوجية نشطة بيولوجيا. تركز أبحاث EV على فهم تكوينها الحيوي ، ودورها في تفاعلات الميكروب والميكروب والميكروب المضيف والمرض ، بالإضافة إلى تطبيقاتها العلاجية المحتملة. يتم تقديم سير عمل للعزل القابل للتطوير للمركبات الكهربائية من البكتيريا المختلفة لتسهيل توحيد أبحاث المركبات الكهربائية.

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يوفر طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية من مجموعة متنوعة من البكتيريا بطريقة قابلة للتكاثر بدرجة كبيرة. إن الشيء العظيم في هذه التقنية هو أنه يمكن استخدامها لعزل المركبات الكهربائية من بيئات كبيرة جدا من الثقافات البكتيرية ، مما سيمكن من إجراء دراسات في الجسم الحي. في حين أن البيانات التي نعرضها تعكس التطبيقات قبل السريرية ، فمن المتوقع أن يتم تكييف هذا البروتوكول لتصنيع المركبات الكهربائية البكتيرية للعلاجات.يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام زراعة خلايا قابل للتطوير مع تعديل طفيف. نظرا لقابلية تطوير البروتوكول ، من المهم أن يكون لديك مرشحات ذات حجم مناسب وأعمدة SEC للتعامل مع أحجام البدء المطلوبة لثقافة الخلايا البكتيرية. يوضح الإجراءات سادي جونسون ، مساعد تقني في مختبر الدكتور جاستن لاثيا ، ديونيسيوس واتسون ، زميل الأورام في مختبر الدكتور جاستن لاثيا ، وأكيم سانتوس ، تقني أبحاث في مختبري.ابدأ بتلقيح مستعمرات مفردة من الإشريكية القولونية إلى 250 إلى 1000 ملليلتر من مرق لوريا بيرتاني ، أو مرق LB ، باستخدام حلقة معقمة. بعد ذلك ، احتضان الثقافة هوائيا في حاضنة تهتز بمعدل 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد 48 ساعة من الحضانة ، قم بتوضيح وسط الاستزراع البكتيري عن طريق نقل مزارع الخلايا لتنظيف زجاجات الطرد المركزي المصنوعة من مادة البولي بروبيلين سعة 500 مل إلى أجهزة الطرد المركزي في دوار كبير السعة وثابت الزاوية عند أربع درجات مئوية و 5000 مرة G لمدة 15 دقيقة.نقل الطافي لتنظيف زجاجات الطرد المركزي عن طريق صب بعناية إلى أجهزة الطرد المركزي في 10،000 مرة G لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية إلى جهاز مرشح يعمل بالفراغ من البولي إيثر سلفون بحجم مناسب وقم بتوصيل جهاز الترشيح بمصدر جدار مفرغ. إذا انخفض معدل الترشيح بشكل كبير ، فانقل المادة غير المفلترة إلى جهاز جديد.يمكن تخزين الوسيط المصفى عند أربع درجات مئوية طوال الليل أو يمكن معالجته على الفور. للتحقق من الإزالة الكاملة للخلايا القابلة للحياة ، قم بنشر حصص من المادة الطافية المفلترة على ألواح أجار مناسبة وتأكد من عدم وجود أي مستعمرات بعد الحضانة في الظروف المثلى للسلالة البكتيرية. لتركيز الوسط المصفى بحجم 100 ملليلتر، قم بتحميل 90 ملليلتر من وسط الاستزراع المرشح على خزان جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون وجهاز الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية و 2000 مرة G لفترات 15 إلى 30 دقيقة حتى يتركز حجم الخزان العلوي إلى أقل من 0.5 ملليلتر.لتعبئة الخزان بأي وسيط استزراع مفلتر متبقي، قم بإزالة التدفق في الجزء السفلي من الجهاز لإعادة التوازن. إذا زادت لزوجة الوسط المركز في الخزان بشكل واضح ، قم بتخفيف الوسط باستخدام PBS وأعد التركيز عن طريق الطرد المركزي لتقليل أي حويصلة غير خارج الخلية ، أو بروتينات EV ، أصغر من قطع الوزن الجزيئي البالغ 100 كيلو دالتون. بعد ذلك ، انقل الوسط المركز إلى أنبوب ربط منخفض البروتين لتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل لتركيز الوسط المصفى بحجم أكبر من 100 ملليلتر ، حدد ترشيح التدفق العرضي بحجم مناسب ، أو جهاز TFF ، مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلو دالتون.بعد تجميع دائرة ترشيح كما هو موضح في المخطوطة ، قم بضخ 200 ملليلتر من PBS في وعاء مدرج لتحديد السرعة المناسبة المقابلة لمعدل التدفق المطلوب. عند ضبط السرعة ، قم بتدوير الوسط المكيف المصفى بحوالي 200 ملليلتر في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع الجزيئات الأصغر من 100 كيلو دالتون ، وعبور غشاء الترشيح الفائق كنفايات في وعاء منفصل حتى يتم تقليل حجم الوسط المكيف إلى 100 إلى 200 ملليلتر. قم بتخفيف الحجم المصفى بالتتابع مرتين باستخدام PBS واستمر في تدوير الوسط مع المضخة في أوعية أصغر لتركيز الحجم على 75 إلى 100 ملليلتر ، ثم إلى 25 ملليلتر و 10 ملليلتر.ارفع أنبوب التغذية من خزان العينة وضخ لتطهير المرشح لاستعادة أكبر قدر ممكن من العينة. انقل العينة المركزة إلى جهاز ترشيح فائق بالطرد المركزي سعة 15 ملليلتر مع قطع الوزن الجزيئي بمقدار 100 كيلو دالتون وأجهزة طرد مركزي في دوار دلو متأرجح عند أربع درجات مئوية و 2،000 مرة G لفترات تتراوح من 15 إلى 30 دقيقة حتى يصبح حجم الوسط في الخزان العلوي أقل من ملليلتر. انقل الوسط المركز إلى أنبوب ربط منخفض البروتين لتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل.لعزل المركبات الكهربائية ، قم بإجراء كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، أو SEC ، باستخدام عمود صغير بحجم سرير 10 ملليلتر لأقل من 100 ملليلتر من مواد البدء وعمود أكبر بحجم سرير 47 ملليلتر لأكثر من 100 ملليلتر من مواد البدء. على مدى عدة ساعات قبل التجربة ، أحضر عمود SEC و PBS إلى درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بتثبيت العمود في وضع رأسي باستخدام حامل وحامل مختبر قياسي. قبل الاتصال بعمود SEC ، قم بترطيب خزان العينة عن طريق السماح لخمسة ملليلتر من PBS بالتدفق عبر الفريت إلى حاوية نفايات.بعد ذلك ، قم بفك غطاء مدخل العمود لإضافة ملليلتر من PBS إلى خزان العينة وقم بتوصيل الخزان بالعمود بعناية أثناء تساقط PBS من خلال الفريت. لموازنة العمود ، أضف 47 ملليلترا من PBS إلى خزان العينة ، متبوعا بإلغاء تغطية الجزء السفلي من عمود SEC. بعد ذلك، اسمح لكل المخزن المؤقت للعينة المحملة بالتدفق عبر العمود وتجاهل التدفق من خلاله.بعد تحميل ملليلتر من العينة على خزان العينة، اسمح للعينة بدخول العمود بالكامل وجمع التدفق. أضف PBS على الفور إلى خزان العينة بحجم 14.25 ملليلتر مطروحا منه حجم العينة للسماح للمحلول بالتدفق عبر العمود ، مع تجاهل الكمية التي تساوي حجم فراغ العمود. بعد ذلك ، ضع أنبوبا صغيرا منخفض الربط بسعة 2 ملليلتر أسفل عمود SEC مباشرة لجمع التدفق الأول أو الكسر الأول بعد السماح لملليلتر من PBS بالمرور عبر العمود.استمر في إضافة مليلتر من PBS إلى خزان العينة لجمع كل جزء لاحق. قم بتخزين الكسور المجمعة عند أربع درجات مئوية للتخزين على المدى القصير أو 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. لاختبار العقم للأجزاء المجمعة من المركبات الكهربائية ، قم بتلقيح ثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من الكسور لاستخدامها في المقايسات.بعد ذلك ، قم بزراعة الوسط في ظل الظروف المثلى مع مراقبة التعكر لمدة ثلاثة أيام على الأقل. بدلا من ذلك ، يمكن تطبيق عينات الكسور على ألواح أجار تحتوي على الوسط المستخدم لزراعة البكتيريا المنتجة ، ثم التحقق من تكوين مستعمرة. بعد ذلك ، قم بتخزين المركبات الكهربائية عن طريق نقل 25 إلى 50٪ من الكسور الفردية أو المجمعة إلى أنابيب ربط منخفضة البروتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتجنب دورات التجميد والذوبان.يظهر التحليل التمثيلي شطف الإشريكية القولونية MP1 EVs في كسور الكروماتوغرافيا المبكرة. احتوت الكسور من واحد إلى ستة على معظم المركبات الكهربائية ، بمتوسط قطر أقل من 100 نانومتر. في الوقت نفسه ، احتوت الكسور اللاحقة على بروتينات خالية من EV وعدد قليل جدا من EVs.تم تأكيد تخصيب EV وحجمه بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ، خاصة في الكسور من الثاني إلى السادس. لوحظ أن الكسور المخصبة ب EV من اثنين إلى سبعة لها نشاط نانولوسيفيراز مرتفع ، ولكن فقط إشارة فلورية منخفضة جدا من mCherry غير المرتبطة ب EV مقارنة بتلك الموجودة في الأجزاء اللاحقة. أكدت علامة immunogold ارتباط EV ل nanoluciferase في الكسور من اثنين إلى خمسة.تم تقييم قابلية تطبيق البروتوكول على الأنواع البكتيرية الأخرى عن طريق عزل EVs من مزارع البكتيريا اللاهوائية المتنوعة. لوحظ أن الكسور اللونية المبكرة من واحد إلى أربعة تم إثراؤها للمركبات الكهربائية ، بحجم قطر أقل من 100 نانومتر. احتوى التسريب المعقد للدماغ والقلب ، أو BHI ، على جزيئات بحجم EV بأقل من 25٪ من إجمالي عائد EV.من المهم استخدام أجهزة TFF القادرة على التعامل مع حجم البداية لثقافة الخلايا البكتيرية. تسمح لنا هذه التقنية بتوليد ما يكفي من المركبات الكهربائية لطرح أسئلة بيولوجية حول وظيفتها في النماذج الحيوانية المعقدة.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

ارتفاع المناولة فحص النشاط Endoglucanase الفطرية في القولونية</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

بروتوكول السريع لإعداد Electrocompetent<em&gt; كولاي</em&gt; و<em&gt; ضمة الكوليرا</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

تنقية الكروماتوغرافي من غير البروتينية المؤتلف الإيلاستين مثل والإنشطار مع الببتيدات والبروتينات من<em&gt; كولاي</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

والسريعة، طريقة قابلة للعزل، دراسة وظيفية، وتحليل المصفوفة خارج الخلية المشتقة من خلية

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية البكتيرية الزرقاء

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

عزل الحمض النووي الريبي الميكروي عن ثقافات الغدد اللعابية خارج الجسم الحي والحويصلات خارج الخلية

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...