Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Den ovenfor beskrevne forskning blev støttet af NIH TL1 TR002549-03 uddannelsesstøtte. Vi takker Dr. John C. Tilton og Zachary Troyer (Case Western Reserve University) for at lette adgangen til partikelstørrelsesanalysatorinstrumentet; Lew Brown (Spectradyne) for teknisk bistand med analyse af partikelstørrelsesfordelingsdata; Dr. David Putnam ved Cornell University for at levere pClyA-GFP plasmid14; og Dr. Mark Goulian ved University of Pennsylvania for at have forsynet os med E. coli MP113.

BEMÆRK: Sørg for, at alt arbejde, der involverer bakterier og rekombinant DNA, følger bedste praksis for indeslutning af biosikkerhed, der passer til biosikkerhedsrisikoniveauet for hver stamme. Arbejdet skal udføres i overensstemmelse med lokale, nationale og internationale biosikkerhedsbestemmelser.
1. Bakteriestammer og dyrkningsbetingelser
BEMÆRK: Bakteriestammer, der blev anvendt i denne undersøgelse, var Escherichia coli MP1<sup c...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

I protokollen ovenfor beskrives en metode, der er skalerbar og pålideligt isolerer elbiler fra forskellige gramnegative / positive og aerobe / anaerobe bakterier. Det har flere potentielle stoppunkter under hele proceduren, selvom det er bedre at undgå at tage længere tid end 48 timer at isolere elbiler fra konditionerede bakteriekulturmedier.
For det første består det af dyrkning af bakterier for at generere betinget bakteriekulturmedium. Det blev konstateret, at forøgelse af kulturtide...

Ekstracellulære vesikler (EV'er) er nanometerstore, liposomlignende strukturer bestående af lipider, proteiner, glycaner og nukleinsyrer, udskilt af både prokaryote og eukaryote celler1. Siden de tidlige undersøgelser, der visualiserer frigivelsen af elbiler fra gramnegative bakterier2, er antallet af biologiske funktioner, der tilskrives bakterielle elbiler (20-300 nm i diameter) konstant vokset i de sidste årtier. Deres funktioner omfatter overførsel af antibiotikaresistens3, biofilmdannelse4, quorum sensing5 og toksinlevering6. Der er også stigende interesse for brugen af bakterielle elbiler som terapi, især i vaccinologi7 og kræftbehandling8.
På trods af den stigende interesse for ev-forskning er der stadig tekniske udfordringer med hensyn til isolationsmetoder. Specifikt er der behov for isoleringsmetoder, der er reproducerbare, skalerbare og kompatible med forskellige EV-producerende organismer. For at skabe et samlet sæt principper for planlægning og rapportering af EV-isolation og forskningsmetoder offentliggør og opdaterer International Society for Extracellular Vesicles MISEV-positionspapiret9. Desuden udgør EV-TRACK-konsortiet en åben platform for rapportering af detaljerede metoder til isolering af elektriske køretøjer, der anvendes i offentliggjorte manuskripter for at øge gennemsigtigheden10.
I denne protokol blev tidligere metoder, der blev anvendt til isolering af elektriske køretøjer fra pattedyrcellekultur, tilpasset11,12 for at muliggøre isolering af elektriske køretøjer fra bakteriecellekultur. Vi forsøgte at anvende metoder, der muliggør EV-isolering fra en række mikrober, som kan være skalerbare, og balancere EV-renhed og udbytte (som diskuteret i MISEV-positionspapiret9). Efter fjernelse af bakterieceller og snavs ved centrifugering og filtrering koncentreres kulturmediet enten ved centrifugalanordningens ultrafiltrering (for et volumen på op til ~ 100 ml) eller pumpedrevet TFF (for større volumener). Elbiler isoleres derefter af SEC ved hjælp af kolonner, der er optimeret til rensning af små elbiler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk oversigt over bakteriel ev-isoleringsarbejdsgang. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikel; TFF = filtrering af tangentiel strøm; SEC = størrelsesekskluderingskromatografi; MWCO = afskæring af molekylvægt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
En muse-kommensal stamme af Escherichia coli (dvs. E. coli MP113) blev anvendt som en modelorganisme og modificeret til at udtrykke EV-associeret nanoluciferase ved fusion til cytolysin A, som tidligere rapporteret14. De metoder, der anvendes her, kan behandle mindst op til flere liter bakteriekulturer og effektivt adskille EV-associerede fra ikke-EV-associerede proteiner. Endelig kan denne metode også bruges til andre gram-positive og gram-negative bakteriearter. Alle relevante data fra de rapporterede eksperimenter blev indsendt til EV-TRACK-videnbasen (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Forskellige bakteriearter udskiller ~ 20-300 nm ekstracellulære vesikler (EV'er), der består af lipider, proteiner, nukleinsyrer, glycaner og andre molekyler afledt af forældrecellerne. Elbiler fungerer som kommunikationsvektorer inden for og mellem arter, samtidig med at de bidrager til interaktionen mellem bakterier og værtsorganismer i forbindelse med infektion og kolonisering. I betragtning af de mange funktioner, der tilskrives elbiler inden for sundhed og sygdom, er der en stigende interesse for at isolere elbiler til in vitro- og in vivo-undersøgelser. Det blev antaget, at adskillelsen af elbiler baseret på fysiske egenskaber, nemlig størrelse, ville lette isoleringen af vesikler fra forskellige bakteriekulturer.
Isolationsarbejdsgangen består af centrifugering, filtrering, ultrafiltrering og størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) til isolering af elbiler fra bakteriekulturer. Et pumpedrevet tangentielt flowfiltreringstrin (TFF) blev inkorporeret for at forbedre skalerbarheden, hvilket muliggør isolering af materiale fra liter startcellekultur. Escherichia coli blev brugt som et modelsystem, der udtrykker EV-associeret nanoluciferase og ikke-EV-associeret mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferase blev målrettet mod elbilerne ved at fusionere sin N-endestation med cytolysin A. Tidlige kromatografifraktioner indeholdende 20-100 nm elbiler med tilhørende cytolysin A - nanoLuc adskilte sig fra de senere fraktioner indeholdende de frie proteiner. Tilstedeværelsen af EV-associeret nanoluciferase blev bekræftet ved immunogold mærkning og transmission elektronmikroskopi. Denne EV-isolationsarbejdsgang gælder for andre humane tarmassocierede gramnegative og gram-positive bakteriearter. Afslutningsvis muliggør kombination af centrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF og SEC skalerbar isolering af elbiler fra forskellige bakteriearter. Anvendelse af en standardiseret isolationsarbejdsgang vil lette sammenlignende undersøgelser af mikrobielle elbiler på tværs af arter.

For at vurdere, hvilke SEC-kromatografifraktioner der blev beriget for elbiler, blev SEC-kolonnen fyldt med 2 ml E. coli MP1-konditioneret kulturmedium, der var blevet koncentreret 1.000 gange af TFF, og sekventielle fraktioner blev indsamlet. Ved hjælp af MRPS blev det konstateret, at fraktion 1-6 indeholdt flest elbiler (figur 2A). Efterfølgende fraktioner indeholdt meget få elbiler, der i stedet for EV-frie proteiner (figur 2B). Elbiler var primæ...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bakterier udskiller ekstracellulære vesikler (EV'er) på størrelse med nanometer, der bærer bioaktive biologiske molekyler. EV-forskning fokuserer på at forstå deres biogenese, rolle i mikrobe-mikrobe og værtsmikrobe interaktioner og sygdom samt deres potentielle terapeutiske anvendelser. En arbejdsgang til skalerbar isolering af elbiler fra forskellige bakterier præsenteres for at lette standardisering af EV-forskning.

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Denne protokol er vigtig, fordi den giver en måde at isolere ekstracellulære vesikler fra en række bakterier på en meget reproducerbar måde. Det fantastiske ved denne teknik er, at den kan bruges til at isolere elbiler fra ganske store miljøer af bakteriekulturer, hvilket vil muliggøre in vivo-undersøgelser. Mens de data, vi viser, afspejler prækliniske anvendelser, er det forudsigeligt, at denne protokol kan tilpasses til fremstilling af bakterielle elbiler til terapi.Denne metode kan anvendes på ethvert skalerbart cellekultursystem med mindre ændringer. På grund af protokollens skalerbarhed er det vigtigt at have filtre og SEC-kolonner i passende størrelse til at håndtere de ønskede startvolumener af bakteriecellekultur. Sadie Johnson, en assisterende teknolog i Dr. Justin Lathias laboratorium, Dionysius Watson, en onkologisk stipendiat i Dr. Justin Lathias laboratorium, og Akeem Santos, en forskningsteknolog i mit laboratorium.Begynd med at inokulere enkeltkolonier af Escherichia coli i 250 til 1000 ml Luria-Bertani eller LB bouillon ved hjælp af en steril løkke. Derefter inkuberes kulturen aerobt i en rystende inkubator ved 300 rotationer i minuttet og 37 grader Celsius. Efter 48 timers inkubation afklares bakteriekulturmediet ved at overføre cellekulturerne til rengøring af 500 ml polypropylencentrifugeflasker til centrifuge i en rotor med stor kapacitet med fast vinkel ved fire grader Celsius og 5.000 gange G i 15 minutter.Overfør supernatanten til rene centrifugeflasker ved forsigtigt at hælde til centrifuge ved 10.000 gange G i 15 minutter. Overfør derefter supernatanten til en 0,2 mikron polyethersulfon vakuumdrevet filteranordning af en passende størrelse og tilslut filtreringsanordningen til en vakuumvægforsyning. Hvis filtreringshastigheden falder betydeligt, skal du flytte det ufiltrerede materiale til en ny enhed.Det filtrerede medium kan opbevares ved fire grader Celsius natten over eller kan behandles yderligere med det samme. For at kontrollere, at de levedygtige celler fjernes fuldstændigt, spredes en aliquot af den filtrerede supernatant på egnede agarplader og sikres, at der ikke er kolonier efter inkubation under optimale betingelser for bakteriestammen. For at koncentrere det filtrerede medium med et volumen på 100 ml skal du fylde 90 ml filtreret kulturmedium på reservoiret af centrifugal ultrafiltreringsanordning med en 100 kilodalton molekylvægtafskæring og centrifuge mediet i svingende spandrotor ved fire grader Celsius og 2.000 gange G i intervaller på 15 til 30 minutter, indtil volumenet af det øverste reservoir er koncentreret til mindre end 0,5 ml.For at fylde reservoiret op med et eventuelt resterende filtreret kulturmedium skal du fjerne gennemstrømningen i bunden af enheden for at afbalancere. Hvis viskositeten af det koncentrerede medium i reservoiret øges synligt, fortyndes mediet med PBS og koncentreres igen ved centrifugering for at reducere eventuelle ikke-ekstracellulære vesikler eller EV-proteiner, der er mindre end molekylvægtsafskæringen på 100 kilodalton. Overfør derefter det koncentrerede medium til et lavproteinbindingsrør til opbevaring ved fire grader Celsius natten over For at koncentrere det filtrerede medium med et volumen større end 100 milliliter skal du vælge en passende størrelse tangentiel flowfiltrering eller TFF-enhed med en molekylvægtafskæring på 100 kilodalton.Efter at have samlet et filtreringskredsløb som forklaret i manuskriptet, pumpes 200 ml PBS i en gradueret beholder for at bestemme den passende hastighed svarende til den ønskede strømningshastighed. Når hastigheden er indstillet, cirkuleres det filtrerede konditionerede medium ved ca. 200 ml i minuttet ved stuetemperatur og opsamles molekylerne mindre end 100 kilodalton, krydser ultrafiltreringsmembranen som affald i en separat beholder, indtil volumenet af det konditionerede medium er reduceret til 100 til 200 ml. Fortynd det filtrerede volumen to gange med PBS sekventielt, og fortsæt med at cirkulere mediet med pumpen i mindre beholdere for at koncentrere volumenet til 75 til 100 ml og derefter til 25 ml og 10 ml.Løft foderslangen ud af prøvebeholderen, og pump for at rense filteret for at genvinde den maksimale mængde af prøven. Flyt den koncentrerede prøve til en 15 milliliter centrifugal ultrafiltreringsanordning med molekylvægtsafskæring på 100 kilodalton og centrifuge i en svingende spandrotorrotor ved fire grader Celsius og 2.000 gange G i intervaller på 15 til 30 minutter, indtil mediets volumen i det øverste reservoir er mindre end to milliliter. Overfør det koncentrerede medium til et lavproteinbindingsrør for at opbevare ved fire grader Celsius natten over.Til isolering af elbilerne skal du udføre størrelsesekskluderingskromatografi eller SEC ved hjælp af en lille søjle med et 10 milliliter sengevolumen til mindre end 100 ml udgangsmateriale og en større søjle med et 47 ml sengevolumen til mere end 100 ml udgangsmateriale. Over flere timer før eksperimentet bringes SEC-søjlen og PBS til stuetemperatur, efterfulgt af stabilisering af søjlen i lodret position ved hjælp af et standard laboratoriestativ og holder. Før du tilslutter til SEC-kolonnen, skal du hydrere prøvebeholderen ved at lade fem milliliter PBS strømme gennem fritten ind i en affaldsbeholder.Skru derefter søjlens indløbshætte af for at tilføje to milliliter PBS til prøvebeholderen, og tilslut forsigtigt reservoiret til søjlen, da PBS drypper ud gennem fritten. For ækvilibrering af kolonnen tilsættes 47 ml PBS til prøvebeholderen efterfulgt af afdækning af bunden af SEC-kolonnen. Lad derefter hele den indlæste prøvebuffer strømme gennem kolonnen, og kassér gennemstrømningen.Efter at have lagt to milliliter af prøven på prøvebeholderen, lad prøven komme helt ind i søjlen og opsamle gennemstrømningen. Der tilsættes straks PBS til prøvebeholderen med et volumen på 14,25 ml minus prøvevolumenet for at lade opløsningen strømme gennem kolonnen, mens mængden svarende til kolonnens tomrumsvolumen kasseres. Placer derefter et to-milliliter lavbindende mikrorør direkte under SEC-kolonnen for at indsamle den første gennemstrømning eller fraktion en efter at have ladet to milliliter PBS løbe gennem søjlen.Fortsæt med at tilføje to milliliter PBS til prøvebeholderen for at indsamle hver efterfølgende fraktion. Opbevar de indsamlede fraktioner ved fire grader Celsius til kortvarig opbevaring eller minus 80 grader Celsius til langtidsopbevaring. Til sterilitetstest af de indsamlede fraktioner af elektriske køretøjer podes tre milliliter af dyrkningsmediet med 100 mikroliter af de fraktioner, der skal anvendes i assays.Derefter dyrkes mediet under optimale forhold, mens du observerer turbiditet i mindst tre dage. Alternativt kan fraktionsprøverne påføres agarplader, der indeholder det medium, der bruges til at dyrke de producerende bakterier, og derefter kontrollere for kolonidannelse. Opbevar derefter elbilerne ved at overføre 25 til 50% af de individuelle eller samlede fraktioner til lavproteinbindingsrør ved minus 80 grader Celsius for at undgå fryse-optøningscyklusser.Den repræsentative analyse viser elueringen af Escherichia coli MP1 elbiler i de tidlige kromatografifraktioner. Brøkerne et til seks indeholdt flest elbiler med en gennemsnitlig diameter på under 100 nanometer. Samtidig indeholdt de efterfølgende fraktioner EV-fri proteiner og meget få elbiler.EV-berigelsen og størrelsen blev bekræftet ved transmissionselektronmikroskopi, især i fraktion to til seks. Det blev observeret, at EV-berigede fraktioner to til syv havde høj nanoluciferaseaktivitet, men kun et meget lavt fluorescerende signal fra ikke-EV-associeret mCherry sammenlignet med de senere fraktioner. Immunogold-mærkningen bekræftede EV-foreningen af nanoluciferase i fraktioner to til fem.Anvendeligheden af protokollen på de andre bakteriearter blev vurderet ved at isolere elbiler fra kulturer af forskellige anaerobe bakterier. Det blev observeret, at de tidlige kromatografifraktioner en til fire blev beriget for elbiler med en diameterstørrelse lavere end 100 nanometer. Den komplekse hjerne-hjerteinfusion, eller BHI, indeholdt partiklerne i EV-størrelse med mindre end 25% af det samlede EV-udbytte.Det er vigtigt at bruge TFF-enheder, der er i stand til at håndtere startvolumenet af bakteriecellekulturen. Denne teknik giver os mulighed for at generere nok elbiler til at stille biologiske spørgsmål om deres funktion i komplekse dyremodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og oprensning af kinesin fra Drosophila Embryoner

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifikation af protein-komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjælp Sekventiel Peptide Affinitetsrensning i kombination med Tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Hurtig Protokol for Udarbejdelse af elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Ikke-kromatografisk oprensning af rekombinant elastin-lignende polypeptider og deres fusioner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

En hurtig, skalerbar fremgangsmåde til isolering, funktionel Study, og analyse af celleafledt ekstracellulære matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolering og karakterisering af cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering af mikroRNA'er fra Tick Ex Vivo spytkirtelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...