Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Het hierboven beschreven onderzoek werd ondersteund door NIH TL1 TR002549-03 trainingsbeurs. We bedanken Drs. John C. Tilton en Zachary Troyer (Case Western Reserve University) voor het vergemakkelijken van de toegang tot het deeltjesgrootte-analyse-instrument; Lew Brown (Spectradyne) voor technische assistentie bij de analyse van de deeltjesgrootteverdelingsgegevens; Dr. David Putnam aan de Cornell University voor het verstrekken van pClyA-GFPplasmide 14; en Dr. Mark Goulian aan de Universiteit van Pennsylvania voor het verstrekken van de E. coli MP113.

OPMERKING: Zorg ervoor dat al het werk met bacteriën en recombinant DNA de beste praktijken voor bioveiligheidsinsluiting volgt die geschikt zijn voor het bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam. Het werk moet worden gedaan in overeenstemming met lokale, nationale en internationale bioveiligheidsvoorschriften.
1. Bacteriestammen en kweekomstandigheden
OPMERKING: Bacteriestammen die in deze studie werden gebruikt, waren Escherichia coli <sup...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

In het bovenstaande protocol wordt een methode beschreven die schaalbaar is en ev's betrouwbaar isoleert van verschillende gramnegatieve / positieve en aerobe / anaërobe bacteriën. Het heeft verschillende potentiële stoppunten tijdens de procedure, hoewel het beter is om te voorkomen dat het langer dan 48 uur duurt om EV's te isoleren van geconditioneerde bacteriële kweekmedia.
Ten eerste bestaat het uit het kweken van bacteriën om geconditioneerd bacteriekweekmedium te genereren. Het ble...

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanometergrote, liposoomachtige structuren die bestaan uit lipiden, eiwitten, glycanen en nucleïnezuren, uitgescheiden door zowel prokaryote als eukaryote cellen1. Sinds de vroege studies die de afgifte van EV's van gramnegatieve bacteriën2 visualiseren, is het aantal biologische functies dat wordt toegeschreven aan bacteriële EV's (20-300 nm in diameter) de afgelopen decennia voortdurend gegroeid. Hun functies omvatten het overbrengen van antibioticaresistentie3, biofilmvorming4, quorumdetectie5 en toxineafgifte6. Er is ook een groeiende belangstelling voor het gebruik van bacteriële EV's als therapieën, vooral in vaccinologie7 en kankertherapie8.
Ondanks de groeiende belangstelling voor EV-onderzoek, zijn er nog steeds technische uitdagingen met betrekking tot isolatiemethoden. In het bijzonder is er behoefte aan isolatiemethoden die reproduceerbaar, schaalbaar en compatibel zijn met diverse EV-producerende organismen. Om een uniforme reeks principes te creëren voor het plannen en rapporteren van EV-isolatie en onderzoeksmethoden, publiceert en actualiseert de International Society for Extracellular Vesicles de MISEV-position paper9. Bovendien biedt het EV-TRACK-consortium een open platform voor het rapporteren van gedetailleerde methodologieën voor EV-isolatie die worden gebruikt in gepubliceerde manuscripten om de transparantie te vergroten10.
In dit protocol werden eerdere methodologieën die werden gebruikt voor de isolatie van EV's uit zoogdiercelkweekaangepast 11,12 om de isolatie van EV's uit bacteriële celkweek mogelijk te maken. We hebben geprobeerd methoden te gebruiken die EV-isolatie van een verscheidenheid aan microben mogelijk maken, die schaalbaar kunnen zijn en de zuiverheid en opbrengst van EV's in evenwicht brengen (zoals besproken in de MISEV-position paper9). Na het verwijderen van bacteriële cellen en puin door centrifugering en filtratie, wordt het kweekmedium geconcentreerd door ultrafiltratie van centrifugaalapparaten (voor een volume tot ~ 100 ml) of pompaangedreven TFF (voor grotere volumes). EV's worden vervolgens geïsoleerd door SEC met behulp van kolommen die zijn geoptimaliseerd voor de zuivering van kleine EV's.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figuur 1: Bacterial EV isolatie workflow schematisch overzicht. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; TFF = tangentiële stromingsfiltratie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; MWCO = afsnijding van het molecuulgewicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Een muis-commensale stam van Escherichia coli (d.w.z. E. coli MP113) werd gebruikt als een modelorganisme en gemodificeerd om EV-geassocieerd nanoluciferase tot expressie te brengen door fusie tot cytolysine A, zoals eerder gemeld14. De methoden die hier worden gebruikt, kunnen ten minste enkele liters bacterieculturen verwerken en EV-geassocieerde van niet-EV-geassocieerde eiwitten effectief scheiden. Ten slotte kan deze methode ook worden gebruikt voor andere grampositieve en gramnegatieve bacteriesoorten. Alle relevante gegevens van de gerapporteerde experimenten werden ingediend bij de EV-TRACK-kennisbank (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Diverse bacteriesoorten scheiden ~ 20-300 nm extracellulaire blaasjes (EV's) af, bestaande uit lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, glycanen en andere moleculen afgeleid van de ouderlijke cellen. EV's functioneren als intra- en inter-species communicatievectoren en dragen tegelijkertijd bij aan de interactie tussen bacteriën en gastheerorganismen in de context van infectie en kolonisatie. Gezien de veelheid aan functies die aan EV's worden toegeschreven in gezondheid en ziekte, is er een groeiende interesse in het isoleren van EV's voor in vitro en in vivo studies. Er werd verondersteld dat de scheiding van EV's op basis van fysieke eigenschappen, namelijk grootte, de isolatie van blaasjes uit verschillende bacterieculturen zou vergemakkelijken. 
De isolatieworkflow bestaat uit centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor de isolatie van EV's uit bacterieculturen. Een pompgestuurde tangentiële flowfiltratie (TFF) stap werd opgenomen om de schaalbaarheid te verbeteren, waardoor materiaal uit liters startcelcultuur kon worden geïsoleerd. Escherichia coli werd gebruikt als een modelsysteem dat EV-geassocieerde nanoluciferase en niet-EV-geassocieerde mCherry tot expressie brengt als reportereiwitten. De nanoluciferase was gericht op de EV's door zijn N-terminus te fuseren met cytolysine A. Vroege chromatografiefracties met 20-100 nm EV's met geassocieerd cytolysine A - nanoLuc verschilden van de latere fracties die de vrije eiwitten bevatten. De aanwezigheid van EV-geassocieerd nanoluciferase werd bevestigd door immunogold labeling en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze EV-isolatieworkflow is van toepassing op andere menselijke darmgerelateerde gramnegatieve en grampositieve bacteriesoorten. Kortom, de combinatie van centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie / TFF en SEC maakt schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriesoorten mogelijk. Het gebruik van een gestandaardiseerde isolatieworkflow zal vergelijkende studies van microbiële EV's tussen soorten vergemakkelijken.

Om te beoordelen welke SEC-chromatografiefracties werden verrijkt voor EV's, werd de SEC-kolom geladen met 2 ml E. coli MP1-geconditioneerd kweekmedium dat 1.000 keer door TFF was geconcentreerd en werden sequentiële fracties verzameld. Met behulp van MRPS bleek dat fracties 1-6 de meeste EV's bevatten (figuur 2A). Latere fracties bevatten zeer weinig EV's, bestaande uit in plaats van EV-vrije eiwitten (figuur 2B). EV's hadden voornamelijk een diameter...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een manier biedt om extracellulaire blaasjes te isoleren van een verscheidenheid aan bacteriën op een zeer reproduceerbare manier. Het mooie van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om EV's te isoleren uit vrij grote omgevingen van bacterieculturen, wat in vivo studies mogelijk maakt. Hoewel de gegevens die we tonen preklinische toepassingen weerspiegelen, is het te verwachten dat dit protocol kan worden aangepast aan de productie van bacteriële EV's voor therapeutica.Deze methode kan worden toegepast op elk schaalbaar celkweeksysteem met kleine wijzigingen. Vanwege de schaalbaarheid van het protocol is het belangrijk om filters van de juiste grootte en SEC-kolommen te hebben om de gewenste startvolumes van bacteriële celkweek te verwerken. De procedures worden gedemonstreerd door Sadie Johnson, een assistent-technoloog in het laboratorium van Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, een oncologiemedewerker in het laboratorium van Dr. Justin Lathia, en Akeem Santos, een onderzoekstechnoloog in mijn laboratorium.Begin met het inenten van enkele kolonies Escherichia coli in 250 tot 1000 milliliter Luria-Bertani, of LB-bouillon, met behulp van een steriele lus. Incubeer vervolgens de cultuur aeroob in een schuddende incubator met 300 rotaties per minuut en 37 graden Celsius. Na 48 uur incubatie, verduidelijk het bacteriële kweekmedium door de celculturen over te brengen naar schone polypropyleencentrifugeflessen van 500 milliliter om gedurende 15 minuten te centrifugeren in een rotor met een grote capaciteit met vaste hoek bij vier graden Celsius en 5.000 keer G.Breng het supernatant over in schone centrifugeflessen door het gedurende 15 minuten voorzichtig in de centrifuge te gieten op 10.000 keer G. Breng vervolgens het supernatant over naar een 0,2-micron polyethersulfon vacuümaangedreven filterapparaat van de juiste grootte en sluit het filtratieapparaat aan op een vacuümwandtoevoer. Als de filtratiesnelheid aanzienlijk daalt, verplaatst u het ongefilterde materiaal naar een nieuw apparaat.Het gefilterde medium kan 's nachts bij vier graden Celsius worden bewaard of kan onmiddellijk verder worden verwerkt. Om te controleren op de volledige verwijdering van de levensvatbare cellen, verspreidt u een aliquot van het gefilterde supernatant op geschikte agarplaten en zorgt u ervoor dat er na incubatie geen kolonies zijn onder optimale omstandigheden voor de bacteriestam. Voor het concentreren van het gefilterde medium met een volume van 100 milliliter, laadt u 90 milliliter gefilterd kweekmedium op het reservoir van centrifugale ultrafiltratie-apparaat met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton en centrifugeert u het medium in zwenkbakrotor bij vier graden Celsius en 2.000 keer G gedurende intervallen van 15 tot 30 minuten totdat het volume van het bovenste reservoir is geconcentreerd tot minder dan 0,5 milliliter.Om het reservoir bij te vullen met een eventueel overgebleven gefilterd kweekmedium, verwijdert u de doorstroom in de bodem van het apparaat om het apparaat opnieuw in evenwicht te brengen. Als de viscositeit van het geconcentreerde medium in het reservoir zichtbaar is verhoogd, verdun het medium met PBS en reconcentraeer het door centrifugatie om niet-extracellulaire blaasjes of EV-eiwitten te verminderen die kleiner zijn dan de moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton. Breng vervolgens het geconcentreerde medium over naar een eiwitarme bindingsbuis om 's nachts bij vier graden Celsius op te slaan Voor het concentreren van het gefilterde medium met een volume groter dan 100 milliliter, selecteert u een tangentiële stroomfiltratie van de juiste grootte, of TFF-apparaat, met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton.Na het samenstellen van een filtratiecircuit zoals uitgelegd in het manuscript, pompt u 200 milliliter PBS in een gegradueerd vat om de juiste snelheid te bepalen die overeenkomt met het gewenste debiet. Wanneer de snelheid is ingesteld, circuleert u het gefilterde geconditioneerde medium met ongeveer 200 milliliter per minuut bij kamertemperatuur en verzamelt u de moleculen kleiner dan 100 kilodalton, waarbij u het ultrafiltratiemembraan als afval in een apart vat doorkruist totdat het volume van het geconditioneerde medium is teruggebracht tot 100 tot 200 milliliter. Verdun het gefilterde volume sequentieel tweevoudig met PBS en blijf het medium met de pomp in kleinere vaten circuleren om het volume te concentreren tot 75 tot 100 milliliter en vervolgens tot 25 milliliter en 10 milliliter.Til de voedingsslang uit het monsterreservoir en pomp om het filter te zuiveren om de maximale hoeveelheid van het monster terug te winnen. Verplaats het geconcentreerde monster naar een centrifugaal ultrafiltratieapparaat van 15 milliliter met een moleculaire gewichtsafsnijding van 100 kilodalton en centrifugeer in een zwenkbakrotor bij vier graden Celsius en 2.000 maal G gedurende intervallen van 15 tot 30 minuten totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir minder dan twee milliliter is. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme bindbuis om 's nachts bij vier graden Celsius te bewaren.Voer voor de isolatie van de EV's grootte-uitsluitingschromatografie of SEC uit met behulp van een kleine kolom met een bedvolume van 10 milliliter voor minder dan 100 milliliter uitgangsmateriaal en een grotere kolom met een bedvolume van 47 milliliter voor meer dan 100 milliliter uitgangsmateriaal. Breng gedurende enkele uren voor het experiment de SEC-kolom en PBS op kamertemperatuur, gevolgd door de kolom in een verticale positie te stabiliseren met behulp van een standaard laboratoriumstandaard en houder. Voordat u verbinding maakt met de SEC-kolom, hydrateert u het monsterreservoir door vijf milliliter PBS door de frit in een afvalcontainer te laten stromen.Schroef vervolgens de inlaatdop van de kolom los om twee milliliter PBS aan het monsterreservoir toe te voegen en sluit het reservoir voorzichtig aan op de kolom terwijl de PBS door de friet naar buiten druipt. Voeg voor de evenwicht van de kolom 47 milliliter PBS toe aan het monsterreservoir, gevolgd door de onderkant van de SEC-kolom los te maken. Laat vervolgens alle geladen monsterbuffer door de kolom stromen en verwijder de doorstroom.Nadat u twee milliliter van het monster op het monsterreservoir hebt geladen, laat u het monster volledig in de kolom komen en verzamelt u de doorstroom. Voeg onmiddellijk PBS toe aan het monsterreservoir met een volume van 14,25 milliliter minus het monstervolume om de oplossing door de kolom te laten stromen, terwijl de hoeveelheid die gelijk is aan het kolomleegvolume wordt weggegooid. Plaats vervolgens een microbuis met een lage binding van twee milliliter direct onder de SEC-kolom om de eerste doorstroom of fractie één te verzamelen nadat twee milliliter PBS door de kolom is gelopen.Blijf twee milliliter PBS aan het monsterreservoir toevoegen om elke volgende fractie te verzamelen. Bewaar de verzamelde fracties bij vier graden Celsius voor korte termijn opslag of min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Voor steriliteitstests van de verzamelde fracties van EV's ent u drie milliliter van het kweekmedium met 100 microliter van de fracties die in assays moeten worden gebruikt.Kweek vervolgens het medium onder optimale omstandigheden terwijl u troebelheid gedurende ten minste drie dagen observeert. Als alternatief kunnen de fractiemonsters worden aangebracht op agarplaten die het medium bevatten dat wordt gebruikt om de producerende bacteriën te laten groeien en vervolgens controleren op kolonievorming. Sla vervolgens de EV's op door 25 tot 50% van de individuele of gepoolde fracties over te brengen naar eiwitarme bindingsbuizen bij min 80 graden Celsius om vries-dooicycli te voorkomen.De representatieve analyse toont de elutie van Escherichia coli MP1 EV's in de vroege chromatografiefracties. De fracties één tot zes bevatten de meeste EV's, met een gemiddelde diameter lager dan 100 nanometer. Tegelijkertijd bevatten de daaropvolgende fracties EV-vrije eiwitten en zeer weinig EV's.De EV-verrijking en -grootte werden bevestigd door transmissie-elektronenmicroscopie, met name in fracties twee tot zes. Er werd waargenomen dat EV-verrijkte fracties twee tot zeven een hoge nanoluciferase-activiteit hadden, maar slechts een zeer laag fluorescerend signaal van niet-EV-geassocieerde mCherry in vergelijking met dat van de latere fracties. De immunogold-etikettering bevestigde de EV-associatie van nanoluciferase in fracties twee tot vijf.De toepasbaarheid van het protocol op de andere bacteriesoorten werd beoordeeld door EV's te isoleren van de culturen van diverse anaerobe bacteriën. Er werd waargenomen dat de vroege chromatografiefracties één tot vier werden verrijkt voor EV's, met een diameter kleiner dan 100 nanometer. De complexe hersen-hartinfusie, of BHI, bevatte de EV-deeltjes op minder dan 25% van de totale EV-opbrengst.Het is belangrijk om TFF-apparaten te gebruiken die het startvolume van de bacteriële celcultuur kunnen verwerken. Deze techniek stelt ons in staat om voldoende EV's te genereren om biologische vragen te stellen over hun functie in complexe diermodellen.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolatie en zuivering van kinesine uit Drosophila Embryo&#39;s

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid protocol voor de bereiding van Elektrocompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Niet-chromatografische zuivering van recombinant elastine-achtige polypeptiden en hun Fusies met peptiden en eiwitten van<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Een snelle, schaalbare methode voor het isoleren, functionele studie en analyse van cel-afgeleide extracellulaire matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Zuivering en analyse van Caenorhabditis elegans Extracellular Blaasjes

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolatie van microRNA's van Tick Ex Vivo Speekselklierculturen en Extracellulaire Blaasjes

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...