Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

La recherche décrite ci-dessus a été soutenue par la subvention de formation NIH TL1 TR002549-03. Nous remercions les Drs John C. Tilton et Zachary Troyer (Case Western Reserve University) d’avoir facilité l’accès à l’instrument d’analyse granulométrique; Lew Brown (Spectradyne) pour l’assistance technique à l’analyse des données de distribution granulométrique; Dr David Putnam de l’Université Cornell pour avoir fourni le plasmide14 pClyA-GFP; et le Dr Mark Goulian de l’Université de Pennsylvanie pour nous avoir fourni le MP113 de E. coli.

REMARQUE : Veiller à ce que tous les travaux impliquant des bactéries et de l’ADN recombinant suivent les pratiques exemplaires en matière de confinement de la biosécurité appropriées au niveau de risque pour la biosécurité de chaque souche. Le travail doit être effectué conformément aux réglementations locales, nationales et internationales en matière de biosécurité.
1. Souches bactériennes et conditions de culture
REMARQUE : Les so...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

Dans le protocole ci-dessus, une méthode est décrite qui est évolutive et isole de manière fiable les VE de diverses bactéries gram-négatives/positives et aérobies/anaérobies. Il a plusieurs points d’arrêt potentiels tout au long de la procédure, bien qu’il soit préférable d’éviter de prendre plus de 48 heures pour isoler les VE des milieux de culture bactériens conditionnés.
Tout d’abord, il consiste à cultiver des bactéries pour générer un milieu de culture bactér...

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures de type liposome, de taille nanométrique, composées de lipides, de protéines, de glycanes et d’acides nucléiques, sécrétées par les cellules procaryotes et eucaryotes1. Depuis les premières études visualisant la libération de VE par les bactéries à Gram négatif2, le nombre de fonctions biologiques attribuées aux VE bactériens (20-300 nm de diamètre) n’a cessé de croître au cours des dernières décennies. Leurs fonctions comprennent le transfert de la résistance aux antibiotiques3, la formation de biofilm4, la détection du quorum5 et l’administration de toxines6. L’utilisation des VE bactériens comme thérapeutique suscite également un intérêt croissant, en particulier en vaccinologie7 et en traitement du cancer8.
Malgré l’intérêt croissant pour la recherche sur les véhicules électriques, il existe encore des défis techniques concernant les méthodes d’isolement. Plus précisément, il existe un besoin de méthodes d’isolement reproductibles, évolutives et compatibles avec divers organismes producteurs de VE. Afin de créer un ensemble unifié de principes pour la planification et le rapport sur l’isolement des VE et les méthodes de recherche, la Société internationale pour les vésicules extracellulaires publie et met à jour le document de positionMISEV 9. En outre, le consortium EV-TRACK fournit une plate-forme ouverte pour rendre compte des méthodologies détaillées pour l’isolation des VE utilisées dans les manuscrits publiés afin d’améliorer la transparence10.
Dans ce protocole, les méthodologies précédentes utilisées pour l’isolement des VE à partir de cultures de cellules de mammifères ont été adaptées11,12 pour permettre l’isolement des VE à partir de la culture de cellules bactériennes. Nous avons cherché à utiliser des méthodes qui permettent d’isoler les VE d’une variété de microbes, ce qui peut être évolutif, et d’équilibrer la pureté et le rendement des VE (comme discuté dans le document de positionMISEV 9). Après élimination des cellules bactériennes et des débris par centrifugation et filtration, le milieu de culture est concentré soit par ultrafiltration par dispositif centrifuge (pour un volume allant jusqu’à ~100 mL), soit par TFF entraîné par pompe (pour les plus grands volumes). Les véhicules électriques sont ensuite isolés par SEC à l’aide de colonnes optimisées pour la purification des petits véhicules électriques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du flux de travail d’isolation bactérienne des véhicules électriques. Abréviations : EV = vésicule extracellulaire; TFF = filtration à flux tangentiel; SEC = chromatographie d’exclusion de taille; MWCO = seuil de poids moléculaire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Une souche commenssale de souris d’Escherichia coli (c.-à-d. E. coli MP1 13) a été utilisée comme organisme modèle et modifiée pour exprimer la nanoluciférase associée à l’EV par fusion avec la cytolysine A, comme indiqué précédemment14. Les méthodes utilisées ici peuvent traiter au moins jusqu’à plusieurs litres de cultures bactériennes et séparer efficacement les protéines associées à EV des protéines non associées à EV. Enfin, cette méthode peut également être utilisée pour d’autres espèces bactériennes à Gram positif et à Gram négatif. Toutes les données pertinentes des expériences rapportées ont été soumises à la base de connaissances EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Diverses espèces bactériennes sécrètent ~20-300 nm de vésicules extracellulaires (VE), composées de lipides, de protéines, d’acides nucléiques, de glycanes et d’autres molécules dérivées des cellules parentales. Les VE fonctionnent comme des vecteurs de communication intra et inter-espèces tout en contribuant à l’interaction entre les bactéries et les organismes hôtes dans le contexte de l’infection et de la colonisation. Compte tenu de la multitude de fonctions attribuées aux VE dans la santé et la maladie, il y a un intérêt croissant pour l’isolement des VE pour les études in vitro et in vivo . On a émis l’hypothèse que la séparation des VE en fonction des propriétés physiques, à savoir la taille, faciliterait l’isolement des vésicules provenant de diverses cultures bactériennes. 
Le flux de travail d’isolement comprend la centrifugation, la filtration, l’ultrafiltration et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) pour l’isolement des VE à partir de cultures bactériennes. Une étape de filtration à flux tangentiel (TFF) entraînée par pompe a été incorporée pour améliorer l’évolutivité, permettant l’isolation du matériau des litres de culture cellulaire de départ. Escherichia coli a été utilisé comme système modèle exprimant la nanoluciférase associée à EV et la mCherry non associée à EV en tant que protéines rapporteures. La nanoluciférase a été ciblée sur les VE en fusionnant son extrémité N avec la cytolysine A. Les premières fractions chromatographiques contenant 20-100 nm EVs avec cytolysine A - nanoLuc associée étaient distinctes des fractions ultérieures contenant les protéines libres. La présence de nanoluciférase associée à l’EV a été confirmée par marquage immuno-or et microscopie électronique à transmission. Ce flux de travail d’isolation EV est applicable à d’autres espèces bactériennes à Gram négatif et à Gram positif associées à l’intestin humain. En conclusion, la combinaison de la centrifugation, de la filtration, de l’ultrafiltration/TFF et de la SEC permet une isolation évolutive des VE de diverses espèces bactériennes. L’utilisation d’un flux de travail d’isolement normalisé facilitera les études comparatives des VE microbiennes entre les espèces.

Pour évaluer quelles fractions chromatographiques SEC ont été enrichies pour les VE, la colonne SEC a été chargée de 2 mL de milieu de culture conditionné à E. coli MP1 qui avait été concentré 1 000 fois par TFF, et des fractions séquentielles ont été recueillies. À l’aide de MRPS, il a été constaté que les fractions 1 à 6 contenaient le plus de VE (figure 2A). Les fractions suivantes contenaient très peu de VE, comprenant au lieu de protéines sans VE (<strong...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Les bactéries sécrètent des vésicules extracellulaires (VE) de taille nanométrique transportant des molécules biologiques bioactives. La recherche sur les véhicules électriques se concentre sur la compréhension de leur biogenèse, de leur rôle dans les interactions microbes-microbes et hôte-microbe et des maladies, ainsi que de leurs applications thérapeutiques potentielles. Un flux de travail pour l’isolation évolutive des véhicules électriques de diverses bactéries est présenté pour faciliter la normalisation de la recherche sur les véhicules électriques.

Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Ce protocole est important car il fournit un moyen d’isoler les vésicules extracellulaires d’une variété de bactéries d’une manière hautement reproductible. La grande chose à propos de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour isoler des véhicules électriques à partir d’environnements assez grands de cultures bactériennes, ce qui permettra des études in vivo. Bien que les données que nous montrons reflètent des applications précliniques, il est prévisible que ce protocole pourrait être adapté à la fabrication de véhicules électriques bactériens à des fins thérapeutiques.Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système de culture cellulaire évolutif avec une modification mineure. En raison de l’évolutivité du protocole, il est important d’avoir des filtres et des colonnes SEC de taille appropriée pour gérer les volumes de départ souhaités de culture cellulaire bactérienne. Sadie Johnson, technologue adjointe dans le laboratoire du Dr Justin Lathia, Dionysius Watson, boursier en oncologie dans le laboratoire du Dr Justin Lathia, et Akeem Santos, technologue de recherche dans mon laboratoire, font la démonstration des procédures.Commencez par inoculer des colonies uniques d’Escherichia coli dans 250 à 1000 millilitres de bouillon Luria-Bertani, ou LB, à l’aide d’une boucle stérile. Ensuite, incuber la culture en aérobie dans un incubateur à agitation à 300 rotations par minute et 37 degrés Celsius. Après 48 heures d’incubation, clarifier le milieu de culture bactérien en transférant les cultures cellulaires dans des flacons de centrifugeuses en polypropylène de 500 millilitres pour les centrifuger dans un rotor à angle fixe de grande capacité à quatre degrés Celsius et 5 000 fois G pendant 15 minutes.Transférer le surnageant dans les bouteilles de centrifugeuses propres en versant soigneusement sur centrifugeuse à 10 000 fois G pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le surnageant dans un dispositif filtrant sous vide en polyéthersulfone de 0,2 micron d’une taille appropriée et connectez le dispositif de filtration à une alimentation en paroi sous vide. Si le taux de filtration diminue considérablement, déplacez le matériau non filtré vers un nouvel appareil.Le milieu filtré peut être stocké à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou peut être traité immédiatement. Pour vérifier l’élimination complète des cellules viables, étaler une partie aliquote du surnageant filtré sur des plaques de gélose appropriées et s’assurer de l’absence de colonies après l’incubation dans des conditions optimales pour la souche bactérienne. Pour concentrer le milieu filtré d’un volume de 100 millilitres, chargez 90 millilitres de milieu de culture filtré sur le réservoir du dispositif d’ultrafiltration centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons et centrifugez le milieu dans un rotor de godet oscillant à quatre degrés Celsius et 2 000 fois G pendant des intervalles de 15 à 30 minutes jusqu’à ce que le volume du réservoir dans le réservoir supérieur ait été concentré à moins de 0,5 millilitre.Pour remplir le réservoir avec tout milieu de culture filtré restant, retirez le flux dans le bas de l’appareil pour le rééquilibrer. Si la viscosité du milieu concentré dans le réservoir est visiblement augmentée, diluer le milieu avec du PBS et le reconcentrer par centrifugation pour réduire toute vésicule non extracellulaire, ou protéines EV, inférieure à la limite de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Ensuite, transférer le milieu concentré dans un tube de liaison à faible teneur en protéines pour stocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Pour concentrer le milieu filtré avec un volume supérieur à 100 millilitres, choisissez un dispositif de filtration à flux tangentiel de taille appropriée, ou TFF, avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons.Après avoir assemblé un circuit de filtration comme expliqué dans le manuscrit, pomper 200 millilitres de PBS dans une cuve graduée pour déterminer la vitesse appropriée correspondant au débit souhaité. Lorsque la vitesse est réglée, faire circuler le milieu conditionné filtré à environ 200 millilitres par minute à température ambiante et recueillir les molécules inférieures à 100 kilodaltons, en traversant la membrane d’ultrafiltration comme déchets dans un récipient séparé jusqu’à ce que le volume du milieu conditionné ait été réduit à 100 à 200 millilitres. Diluer séquentiellement le volume filtré deux fois avec du PBS et continuer à faire circuler le fluide avec la pompe dans des récipients plus petits pour concentrer le volume à 75 à 100 millilitres, puis à 25 millilitres et 10 millilitres.Soulevez le tube d’alimentation hors du réservoir d’échantillon et pompez pour purger le filtre afin de récupérer la quantité maximale de l’échantillon. Déplacer l’échantillon concentré vers un dispositif d’ultrafiltration centrifuge de 15 millilitres avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons et centrifuger dans un rotor à godet oscillant à quatre degrés Celsius et 2 000 fois G pendant des intervalles de 15 à 30 minutes jusqu’à ce que le volume du milieu dans le réservoir supérieur soit inférieur à deux millilitres. Transférer le milieu concentré dans un tube de liaison à faible teneur en protéines pour le stocker à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Pour l’isolation des véhicules électriques, effectuez une chromatographie d’exclusion de taille, ou SEC, en utilisant une petite colonne avec un volume de lit de 10 millilitres pour moins de 100 millilitres de matériau de départ et une colonne plus grande avec un volume de lit de 47 millilitres pour plus de 100 millilitres de matériau de départ. Pendant plusieurs heures avant l’expérience, amener la colonne SEC et le PBS à température ambiante, puis stabiliser la colonne en position verticale à l’aide d’un support de laboratoire et d’un support standard. Avant de vous connecter à la colonne SEC, hydratez le réservoir d’échantillon en laissant cinq millilitres de PBS s’écouler à travers la fritte dans un conteneur à déchets.Ensuite, dévissez le bouchon d’entrée de la colonne pour ajouter deux millilitres de PBS au réservoir d’échantillon et connectez soigneusement le réservoir à la colonne pendant que le PBS s’égoutte à travers la frette. Pour l’équilibrage de la colonne, ajouter 47 millilitres de PBS au réservoir d’échantillon, puis déboucher le bas de la colonne SEC. Ensuite, laissez toute la mémoire tampon d’échantillon chargée circuler dans la colonne et ignorez le flux.Après avoir chargé deux millilitres de l’échantillon sur le réservoir d’échantillon, laissez l’échantillon entrer complètement dans la colonne et collectez le flux continu. Ajouter immédiatement du PBS au réservoir d’échantillon à un volume de 14,25 millilitres moins le volume de l’échantillon pour permettre à la solution de s’écouler à travers la colonne, tout en éliminant la quantité égale au volume de vide de la colonne. Ensuite, placez un microtube à faible liaison de deux millilitres directement sous la colonne SEC pour recueillir le premier écoulement continu ou fraction un après avoir laissé passer deux millilitres de PBS à travers la colonne.Continuez à ajouter deux millilitres de PBS au réservoir d’échantillon pour recueillir chaque fraction subséquente. Conservez les fractions collectées à quatre degrés Celsius pour un stockage à court terme ou à moins 80 degrés Celsius pour un stockage à long terme. Pour les essais de stérilité des fractions collectées de VE, inoculer trois millilitres du milieu de culture avec 100 microlitres des fractions à utiliser dans les essais.Ensuite, cultiver le milieu dans des conditions optimales tout en observant la turbidité pendant au moins trois jours. Alternativement, les échantillons de fraction peuvent être appliqués sur des plaques de gélose contenant le milieu utilisé pour développer les bactéries productrices, puis vérifier la formation de colonies. Ensuite, entreposez les VE en transférant 25 à 50% des fractions individuelles ou regroupées dans des tubes de liaison à faible teneur en protéines à moins 80 degrés Celsius pour éviter les cycles de gel-dégel.L’analyse représentative montre l’élution des EV MP1 d’Escherichia coli dans les premières fractions chromatographiques. Les fractions un à six contenaient le plus de véhicules électriques, avec un diamètre moyen inférieur à 100 nanomètres. Dans le même temps, les fractions suivantes contenaient des protéines sans EV et très peu de EV.L’enrichissement et la taille de l’EV ont été confirmés par microscopie électronique à transmission, en particulier dans les fractions deux à six. Il a été observé que les fractions enrichies en EV deux à sept avaient une activité nanoluciférase élevée, mais seulement un signal fluorescent très faible de mCherry non associé à EV par rapport à celui des fractions ultérieures. Le marquage immunogold a confirmé l’association EV de la nanoluciférase dans les fractions deux à cinq.L’applicabilité du protocole aux autres espèces bactériennes a été évaluée en isolant les VE des cultures de diverses bactéries anaérobies. Il a été observé que les premières fractions chromatographiques un à quatre étaient enrichies pour les VE, avec un diamètre inférieur à 100 nanomètres. La perfusion complexe cerveau-cœur, ou BHI, contenait les particules de la taille d’un VE à moins de 25% du rendement total de l’EV.Il est important d’utiliser des dispositifs TFF capables de manipuler le volume de départ de la culture cellulaire bactérienne. Cette technique nous permet de générer suffisamment de VE pour poser des questions biologiques sur leur fonction dans des modèles animaux complexes.

Research

JoVE Journal

Biology

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