Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
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Die oben beschriebene Forschung wurde durch NIH TL1 TR002549-03 Training Grant unterstützt. Wir danken Dr. John C. Tilton und Dr. Zachary Troyer (Case Western Reserve University) für die Erleichterung des Zugangs zum Partikelgrößenanalysegerät; Lew Brown (Spectradyne) für technische Unterstützung bei der Analyse der Partikelgrößenverteilungsdaten; Dr. David Putnam von der Cornell University für die Bereitstellung von pClyA-GFP-Plasmid14; und Dr. Mark Goulian von der University of Pennsylvania für die Bereitstellung des E. coli MP113.

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Arbeiten mit Bakterien und rekombinanter DNA den besten Praktiken für die biologische Sicherheitseindämmung entsprechen, die der biologischen Sicherheitsrisikostufe jedes Stammes entsprechen. Die Arbeit sollte in Übereinstimmung mit lokalen, nationalen und internationalen Biosicherheitsvorschriften erfolgen.
1. Bakterienstämme und Kulturbedingungen
HINWEIS: In dieser Studie verwendete Bakterienstämme waren <...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

Im obigen Protokoll wird eine Methode beschrieben, die skalierbar ist und EVs zuverlässig von verschiedenen gramnegativen/positiven und aeroben/anaeroben Bakterien isoliert. Es hat mehrere potenzielle Haltepunkte während des gesamten Verfahrens, obwohl es besser ist, nicht länger als 48 Stunden zu benötigen, um EVs aus konditionierten Bakterienkulturmedien zu isolieren.
Erstens besteht es aus der Kultivierung von Bakterien, um ein konditioniertes Bakterienkulturmedium zu erzeugen. Es wurde...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanometergroße, liposomenähnliche Strukturen, die aus Lipiden, Proteinen, Glykanen und Nukleinsäuren bestehen und sowohl von prokaryotischen als auch von eukaryotischen Zellen abgesondert werden1. Seit den frühen Studien, die die Freisetzung von EVs aus gramnegativen Bakterien visualisierten2, hat die Anzahl der biologischen Funktionen, die bakteriellen EVs (20-300 nm Durchmesser) zugeschrieben werden, in den letzten Jahrzehnten stetig zugenommen. Zu ihren Funktionen gehören die Übertragung von Antibiotikaresistenz3, Biofilmbildung4, Quorum Sensing5 und Toxinabgabe6. Es besteht auch ein wachsendes Interesse an der Verwendung bakterieller EVs als Therapeutika, insbesondere in der Vakzinologie7 und Krebstherapie8.
Trotz des wachsenden Interesses an der EV-Forschung gibt es immer noch technische Herausforderungen in Bezug auf Methoden der Isolierung. Insbesondere besteht ein Bedarf an Isolationsmethoden, die reproduzierbar, skalierbar und kompatibel mit verschiedenen EV-produzierenden Organismen sind. Um einen einheitlichen Satz von Prinzipien für die Planung und Berichterstattung von EV-Isolierung und Forschungsmethoden zu schaffen, veröffentlicht und aktualisiert die International Society for Extracellular Vesicles das MISEV-Positionspapier9. Darüber hinaus bietet das EV-TRACK-Konsortium eine offene Plattform für die Berichterstattung über detaillierte Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die in veröffentlichten Manuskripten verwendet werden, um die Transparenz zu erhöhen10.
In diesem Protokoll wurden frühere Methoden zur Isolierung von EVs aus Säugetierzellkulturen angepasst11,12, um die Isolierung von EVs aus bakteriellen Zellkulturen zu ermöglichen. Wir haben versucht, Methoden einzusetzen, die eine EV-Isolierung von einer Vielzahl von Mikroben ermöglichen, die skalierbar sein können, und EV-Reinheit und -Ausbeute ausgleichen (wie im MISEV-Positionspapier9 diskutiert). Nach dem Entfernen von Bakterienzellen und Trümmern durch Zentrifugation und Filtration wird das Kulturmedium entweder durch Zentrifugalgeräte-Ultrafiltration (für ein Volumen von bis zu ~100 ml) oder pumpengetriebene TFF (für größere Volumina) konzentriert. Elektrofahrzeuge werden dann durch SEC mit Säulen isoliert, die für die Reinigung kleiner Elektrofahrzeuge optimiert sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Abbildung 1: Übersicht über den Workflow für die bakterielle EV-Isolierung. Abkürzungen: EV = extrazelluläres Vesikel; TFF = tangentiale Strömungsfiltration; SEC = Größenausschlusschromatographie; MWCO = Molekulargewichtsgrenze. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ein Mauskommensalstamm von Escherichia coli (d.h. E. coli MP113) wurde als Modellorganismus verwendet und modifiziert, um EV-assoziierte Nanoluciferase durch Fusion zu Cytolysin A zu exprimieren, wie bereits berichtet14. Die hier verwendeten Methoden können mindestens bis zu mehreren Litern Bakterienkulturen verarbeiten und EV-assoziierte von nicht-EV-assoziierten Proteinen effektiv trennen. Schließlich kann diese Methode auch für andere grampositive und gramnegative Bakterienarten angewendet werden. Alle relevanten Daten der gemeldeten Experimente wurden an die EV-TRACK Knowledgebase (EV-TRACK ID: EV210211)10 übermittelt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Verschiedene Bakterienarten sezernieren ~20-300 nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Glykanen und anderen Molekülen bestehen, die von den Elternzellen stammen. EVs fungieren als intra- und interspezielle Kommunikationsvektoren und tragen gleichzeitig zur Interaktion zwischen Bakterien und Wirtsorganismen im Kontext von Infektion und Besiedlung bei. Angesichts der Vielzahl von Funktionen, die EVs in Gesundheit und Krankheit zugeschrieben werden, besteht ein wachsendes Interesse daran, EVs für In-vitro- und In-vivo-Studien zu isolieren. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Trennung von EVs basierend auf physikalischen Eigenschaften, nämlich der Größe, die Isolierung von Vesikeln aus verschiedenen Bakterienkulturen erleichtern würde.
Der Isolationsworkflow besteht aus Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie (SEC) zur Isolierung von EVs aus Bakterienkulturen. Ein pumpengetriebener Tangential-Flow-Filtrationsschritt (TFF) wurde integriert, um die Skalierbarkeit zu verbessern und die Isolierung von Material aus Litern Ausgangszellkultur zu ermöglichen. Escherichia coli wurde als Modellsystem verwendet, das EV-assoziierte Nanoluciferase und nicht-EV-assoziierte mCherry als Reporterproteine exprimiert. Die Nanoluciferase wurde gezielt auf die EVs gerichtet, indem ihr N-Terminus mit Cytolysin A fusioniert wurde. Frühe Chromatographiefraktionen, die 20-100 nm EVs mit assoziiertem Cytolysin A - nanoLuc enthielten, unterschieden sich von den späteren Fraktionen, die die freien Proteine enthielten. Das Vorhandensein von EV-assoziierter Nanoluciferase wurde durch Immunogold-Markierung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Dieser EV-Isolations-Workflow ist auf andere gramnegative und grampositive Bakterienarten anwendbar, die mit dem menschlichen Darm assoziiert sind. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination von Zentrifugation, Filtration, Ultrafiltration/TFF und SEC eine skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterienarten ermöglicht. Die Verwendung eines standardisierten Isolationsworkflows wird vergleichende Studien mikrobieller Elektrofahrzeuge über Spezies hinweg erleichtern.

Um zu beurteilen, welche SEC-Chromatographiefraktionen für EVs angereichert waren, wurde die SEC-Säule mit 2 ml E. coli MP1-konditioniertem Kulturmedium beladen, das 1.000-fach durch TFF konzentriert worden war, und sequentielle Fraktionen wurden gesammelt. Unter Verwendung von MRPS wurde festgestellt, dass die Fraktionen 1-6 die meisten EVs enthielten (Abbildung 2A). Nachfolgende Fraktionen enthielten sehr wenige EVs, die anstelle von EV-freien Proteinen bestanden (<strong class=...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Dieses Protokoll ist wichtig, da es eine Möglichkeit bietet, extrazelluläre Vesikel aus einer Vielzahl von Bakterien auf hochreproduzierbare Weise zu isolieren. Das Tolle an dieser Technik ist, dass sie verwendet werden kann, um EVs aus ziemlich großen Umgebungen von Bakterienkulturen zu isolieren, was In-vivo-Studien ermöglicht. Während die Daten, die wir zeigen, präklinische Anwendungen widerspiegeln, ist es absehbar, dass dieses Protokoll an die Herstellung bakterieller EVs für Therapeutika angepasst werden könnte.Diese Methode kann mit geringfügigen Modifikationen auf jedes skalierbare Zellkultursystem angewendet werden. Aufgrund der Skalierbarkeit des Protokolls ist es wichtig, Filter und SEC-Spalten in geeigneter Größe zu haben, um die gewünschten Startvolumina der bakteriellen Zellkultur zu bewältigen. Die Verfahren demonstrieren Sadie Johnson, eine stellvertretende Technologin im Labor von Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, ein Onkologie-Stipendiat im Labor von Dr. Justin Lathia, und Akeem Santos, ein Forschungstechnologe in meinem Labor.Beginnen Sie mit der Impfung einzelner Kolonien von Escherichia coli in 250 bis 1000 Milliliter Luria-Bertani oder LB-Brühe mit einer sterilen Schleife. Dann inkubieren Sie die Kultur aerob in einem Schüttelinkubator bei 300 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius. Nach 48 Stunden Inkubation klären Sie das Bakterienkulturmedium, indem Sie die Zellkulturen in saubere 500-Milliliter-Polypropylen-Zentrifugenflaschen überführen, um sie 15 Minuten lang in einem großvolumigen Rotor mit festem Winkel bei vier Grad Celsius und 5.000 mal G zu zentrifugieren.Den Überstand in saubere Zentrifugenflaschen überführen, indem Sie ihn 15 Minuten lang vorsichtig bei 10.000 mal G zentrifugieren. Als nächstes wird der Überstand in eine 0,2-μm-Polyethersulfon-Vakuumfiltervorrichtung geeigneter Größe überführt und die Filtervorrichtung an eine Vakuumwandversorgung angeschlossen. Wenn die Filtrationsrate deutlich sinkt, bewegen Sie das ungefilterte Material in ein neues Gerät.Das gefilterte Medium kann über Nacht bei vier Grad Celsius gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Um die vollständige Entfernung der lebensfähigen Zellen zu überprüfen, verteilen Sie ein Aliquot des gefilterten Überstands auf geeigneten Agarplatten und stellen Sie sicher, dass nach der Inkubation unter optimalen Bedingungen für den Bakterienstamm keine Kolonien vorhanden sind. Zum Aufkonzentrieren des gefilterten Mediums mit einem Volumen von 100 Milliliter werden 90 Milliliter gefiltertes Kulturmedium auf das Reservoir der Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer 100-Kilodaltonnen-Molekulargewichtsabschaltung geladen und das Medium im schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15- bis 30-Minuten-Intervalle zentrifugiert, bis das Volumen des im oberen Reservoir befindlichen Reservoirs auf weniger als 0,5 Milliliter konzentriert ist.Um das Reservoir mit dem verbleibenden gefilterten Kulturmedium aufzufüllen, entfernen Sie den Durchfluss in der Unterseite des Geräts, um das Gleichgewicht wiederherzustellen. Wenn die Viskosität des konzentrierten Mediums im Reservoir sichtbar erhöht ist, verdünnen Sie das Medium mit PBS und konzentrieren Sie sich durch Zentrifugation erneut, um nicht-extrazelluläre Vesikel oder EV-Proteine zu reduzieren, die kleiner als der Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton sind. Dann das konzentrierte Medium in ein proteinarmes Binderohr überführen, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern Um das gefilterte Medium mit einem Volumen von mehr als 100 Milliliter zu konzentrieren, wählen Sie eine entsprechend große tangentiale Durchflussfiltration oder TFF-Vorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton.Nach dem Zusammenbau eines Filtrationskreislaufs, wie im Manuskript erläutert, pumpen Sie 200 Milliliter PBS in ein graduiertes Gefäß, um die geeignete Geschwindigkeit entsprechend der gewünschten Durchflussrate zu bestimmen. Wenn die Geschwindigkeit eingestellt ist, zirkulieren Sie das gefilterte konditionierte Medium mit etwa 200 Milliliter pro Minute bei Raumtemperatur und sammeln Sie die Moleküle, die kleiner als 100 Kilodalton sind, wobei die Ultrafiltrationsmembran als Abfall in einem separaten Gefäß durchquert wird, bis das Volumen des konditionierten Mediums auf 100 bis 200 Milliliter reduziert wurde. Verdünnen Sie das gefilterte Volumen nacheinander um das Zweifache mit PBS und zirkulieren Sie das Medium mit der Pumpe in kleineren Gefäßen, um das Volumen auf 75 bis 100 Milliliter und dann auf 25 Milliliter und 10 Milliliter zu konzentrieren.Heben Sie den Zufuhrschlauch aus dem Probenbehälter und pumpen Sie, um den Filter zu reinigen, um die maximale Menge der Probe zu gewinnen. Die konzentrierte Probe wird in eine 15-Milliliter-Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100 Kilodalton gebracht und in einem schwingenden Schaufelrotor bei vier Grad Celsius und 2.000 mal G für 15 bis 30 Minuten zentrifugiert, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir weniger als zwei Milliliter beträgt. Das konzentrierte Medium wird in ein proteinarmes Binderohr überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu lagern.Führen Sie zur Isolierung der EVs eine Größenausschlusschromatographie (SEC) durch, wobei eine kleine Säule mit einem 10-Milliliter-Bettvolumen für weniger als 100 Milliliter Ausgangsmaterial und eine größere Säule mit einem 47-Milliliter-Bettvolumen für mehr als 100 Milliliter Ausgangsmaterial verwendet wird. Einige Stunden vor dem Experiment bringen Sie die SEC-Säule und PBS auf Raumtemperatur und stabilisieren Sie die Säule anschließend in vertikaler Position mit einem Standard-Laborständer und -halter. Bevor Sie es an die SEC-Säule anschließen, hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie fünf Milliliter PBS durch die Fritte in einen Abfallbehälter fließen lassen.Schrauben Sie dann die Einlasskappe der Säule ab, um dem Probenreservoir zwei Milliliter PBS hinzuzufügen, und verbinden Sie das Reservoir vorsichtig mit der Säule, während das PBS durch die Fritte tropft. Für die Äquilibrierung der Säule fügen Sie 47 Milliliter PBS in das Probenreservoir hinzu, gefolgt von der Entdeckelung der Unterseite der SEC-Spalte. Lassen Sie dann den gesamten geladenen Probenpuffer durch die Spalte fließen und verwerfen Sie den Durchfluss.Nachdem Sie zwei Milliliter der Probe auf das Probenreservoir geladen haben, lassen Sie die Probe vollständig in die Säule eindringen und sammeln Sie den Durchfluss. Sofort PBS in das Probenreservoir mit einem Volumen von 14,25 Milliliter abzüglich des Probenvolumens geben, damit die Lösung durch die Säule fließen kann, während die Menge verworfen wird, die dem Volumen des Säulenhohlraums entspricht. Als nächstes positionieren Sie ein Zwei-Milliliter-Mikroröhrchen mit niedriger Bindung direkt unter der SEC-Säule, um den ersten Durchfluss oder die erste Fraktion zu sammeln, nachdem zwei Milliliter PBS durch die Säule laufen können.Fügen Sie dem Probenreservoir weiterhin zwei Milliliter PBS hinzu, um jede nachfolgende Fraktion zu sammeln. Lagern Sie die gesammelten Fraktionen bei vier Grad Celsius für die kurzfristige Lagerung oder minus 80 Grad Celsius für die Langzeitlagerung. Für die Sterilitätsprüfung der gesammelten EV-Fraktionen werden drei Milliliter des Kulturmediums mit 100 Mikrolitern der in Assays zu verwendenden Fraktionen beimpft.Dann kultivieren Sie das Medium unter optimalen Bedingungen unter Beobachtung der Trübung für mindestens drei Tage. Alternativ können die Fraktionsproben auf Agarplatten aufgetragen werden, die das Medium enthalten, das zum Züchten der produzierenden Bakterien verwendet wird, und dann auf Koloniebildung prüfen. Als nächstes lagern Sie die EVs, indem Sie 25 bis 50% der einzelnen oder gepoolten Fraktionen bei minus 80 Grad Celsius in proteinarme Binderöhrchen übertragen, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.Die repräsentative Analyse zeigt die Elution von Escherichia coli MP1 EVs in den frühen Chromatographiefraktionen. Die Fraktionen eins bis sechs enthielten die meisten EVs mit einem durchschnittlichen Durchmesser von weniger als 100 Nanometern. Gleichzeitig enthielten die nachfolgenden Fraktionen EV-freie Proteine und sehr wenige EVs.Die EV-Anreicherung und -Größe wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt, insbesondere in den Fraktionen zwei bis sechs. Es wurde beobachtet, dass EV-angereicherte Fraktionen zwei bis sieben eine hohe Nanoluciferase-Aktivität aufwiesen, aber nur ein sehr niedriges Fluoreszenzsignal von nicht-EV-assoziiertem mCherry im Vergleich zu dem der späteren Fraktionen. Die Immunogold-Markierung bestätigte die EV-Assoziation von Nanoluciferase in Fraktionen zwei bis fünf.Die Anwendbarkeit des Protokolls auf die anderen Bakterienarten wurde bewertet, indem EVs aus den Kulturen verschiedener anaerober Bakterien isoliert wurden. Es wurde beobachtet, dass die frühen Chromatographie-Fraktionen eins bis vier für EVs mit einer Durchmessergröße von weniger als 100 Nanometern angereichert waren. Die komplexe Hirn-Herz-Infusion (BHI) enthielt die EV-großen Partikel bei weniger als 25% der gesamten EV-Ausbeute.Es ist wichtig, TFF-Geräte zu verwenden, die in der Lage sind, das Startvolumen der bakteriellen Zellkultur zu handhaben. Diese Technik ermöglicht es uns, genügend EVs zu erzeugen, um biologische Fragen zu ihrer Funktion in komplexen Tiermodellen zu stellen.

Research

JoVE Journal

Biology

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