Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

המחקר שתואר לעיל נתמך על ידי מענק ההכשרה NIH TL1 TR002549-03. אנו מודים לד"ר ג'ון טילטון וזכארי טרוייר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב) על שהקלו על הגישה למכשיר ניתוח גודל החלקיקים; לו בראון (ספקטרדין) לסיוע טכני בניתוח נתוני התפלגות גודל החלקיקים; ד"ר דיוויד פוטנאם מאוניברסיטת קורנל על אספקת פלסמיד pClyA-GFP14; וד"ר מארק גוליאן מאוניברסיטת פנסילבניה על שסיפק לנו את ה- E. coli MP113.

הערה: ודא שכל העבודה המערבת חיידקים ודנ"א רקומביננטי תואמת לשיטות עבודה מומלצות להכלת בטיחות ביולוגית המתאימה לרמת הסיכון הביולוגי של כל זן. העבודה צריכה להיעשות בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, לאומיות ובינלאומיות.
1. זני חיידקים ותנאי גידול
ה?...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

בפרוטוקול לעיל מתוארת שיטה הניתנת להרחבה ומבודדת באופן אמין כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם-שליליים/חיוביים ואירוביים/אנאירוביים שונים. יש לו כמה נקודות עצירה פוטנציאליות לאורך ההליך, אם כי עדיף להימנע מלקחת יותר מ 48 שעות כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממדיה תרבית חיידקים מותנה.
...

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים דמויי ליפוזום בגודל ננומטרי, המורכבים מליפידים, חלבונים, גליקנים וחומצות גרעין, המופרשים הן על ידי תאים פרוקריוטים והן על ידי תאים אאוקריוטים1. מאז המחקרים המוקדמים הממחישים את שחרורם של כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם שליליים2, מספר הפונקציות הביולוגיות המיוחסות לרכבים חשמליים חיידקיים (בקוטר 20-300 ננומטר) גדל בהתמדה בעשורים האחרונים. תפקידיהם כוללים העברת עמידות לאנטיביוטיקה3, היווצרות ביופילם4, חישת מניין5 והעברת רעלנים6. יש גם עניין גובר בשימוש ברכבים חשמליים חיידקיים כטיפולים, במיוחד בחיסון7 ובטיפול בסרטן8.
למרות העניין הגובר בחקר כלי רכב חשמליים, עדיין קיימים אתגרים טכניים בנוגע לשיטות בידוד. באופן ספציפי, יש צורך בשיטות בידוד הניתנות לשחזור, מדרגיות ותואמות לאורגניזמים מגוונים המייצרים EV. כדי ליצור מערכת עקרונות אחידה לתכנון ודיווח על בידוד ושיטות מחקר של כלי רכב חשמליים, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות מפרסמת ומעדכנת את נייר העמדה של MISEV9. יתר על כן, קונסורציום EV-TRACK מספק פלטפורמה פתוחה לדיווח על מתודולוגיות מפורטות לבידוד EV המשמשות בכתבי יד שפורסמו כדי לשפר את השקיפות10.
בפרוטוקול זה הותאמו11,12 מתודולוגיות קודמות ששימשו לבידוד כלי רכב חשמליים מתרבית תאי יונקים, כדי לאפשר בידוד של כלי רכב חשמליים מתרבית תאי חיידקים. ביקשנו להשתמש בשיטות המאפשרות בידוד של כלי רכב חשמליים ממגוון מיקרובים, הניתנים להרחבה, ולאזן את הטוהר והתפוקה של EV (כפי שנדון בנייר העמדה של MISEV9). לאחר הסרת תאי חיידקים ופסולת על ידי צנטריפוגה וסינון, מדיום התרבית מרוכז על ידי אולטרה-סינון של מכשיר צנטריפוגלי (בנפח של עד ~100 מ"ל) או TFF מונע משאבה (לנפחים גדולים יותר). לאחר מכן, כלי רכב חשמליים מבודדים על ידי SEC באמצעות עמודות הממוטבות לטיהור כלי רכב חשמליים קטנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> איור 1: סקירה סכמטית של זרימת עבודה של בידוד ר"ח חיידקי. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; TFF = סינון זרימה משיק; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; MWCO = חיתוך משקל מולקולרי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
זן עכבר-קומנסאלי של Escherichia coli (כלומר, E. coli MP113) שימש כאורגניזם מודל ושונה כדי לבטא ננולוציפראז הקשור ל-EV על ידי היתוך לציטוליזין A, כפי שדווח בעבר14. השיטות המשמשות כאן יכולות לעבד לפחות עד כמה ליטרים של תרביות חיידקים ולהפריד ביעילות בין חלבונים הקשורים ל-EV לבין חלבונים שאינם קשורים ל-EV. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם עבור מינים אחרים של חיידקים גראם חיוביים וגרם שליליים. כל הנתונים הרלוונטיים של הניסויים המדווחים הוגשו למאגר הידע EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

מיני חיידקים מגוונים מפרישים ~20-300 ננומטר שלפוחית חוץ-תאית (EVs), המורכבת מליפידים, חלבונים, חומצות גרעין, גליקנים ומולקולות אחרות שמקורן בתאי ההורים. כלי רכב חשמליים מתפקדים כווקטורים לתקשורת תוך-מינית ובין מינים, תוך שהם תורמים גם לאינטראקציה בין חיידקים לאורגניזמים מארחים בהקשר של זיהום והתיישבות. בהתחשב בריבוי התפקודים המיוחסים לרכבים חשמליים בבריאות ובמחלות, יש עניין גובר בבידוד כלי רכב חשמליים למחקרי in vitro ו-in vivo . ההשערה הייתה כי הפרדת כלי רכב חשמליים על בסיס תכונות פיזיקליות, כלומר גודל, תקל על בידוד שלפוחיות מתרביות חיידקים מגוונות. 
תהליך הבידוד מורכב מצנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) לבידוד כלי רכב חשמליים מתרביות חיידקים. שלב סינון זרימה משיק מונע משאבה (TFF) שולב כדי לשפר את המדרגיות, ולאפשר בידוד של חומר מליטרים של תרבית תאים מתחילים. Escherichia coli שימשה כמערכת מודל המבטאת ננו-לוציפראז הקשור ל-EV ו-mCherry שאינו קשור ל-EV כחלבונים מדווחים. הננולוציפראז היה מכוון לרכבים החשמליים על ידי מיזוג ה-N-טרמינל שלו עם ציטוליזין A. שברים כרומטוגרפיים מוקדמים המכילים 20-100 ננומטר EVs עם ציטוליזין A - nanoLuc הקשורים היו שונים מן השברים המאוחרים יותר המכילים את החלבונים החופשיים. נוכחותו של ננולוציפראז הקשור ל- EV אושרה על ידי תיוג אימונוגולד ומיקרוסקופיית אלקטרונים. תהליך עבודה זה של בידוד EV ישים על מינים אחרים של חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים הקשורים למעי אנושיים. לסיכום, שילוב של צנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון/TFF ו-SEC מאפשר בידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. שימוש בתהליך בידוד סטנדרטי יאפשר מחקרים השוואתיים של כלי רכב חשמליים מיקרוביאליים בין מינים.

כדי להעריך אילו שברים כרומטוגרפיים של SEC הועשרו עבור כלי רכב חשמליים, עמודת ה-SEC הועמסה ב-2 מ"ל של מדיום תרבות מותנה E. coli MP1 שהתרכזה פי 1,000 על ידי TFF, ונאספו שברים רציפים. באמצעות MRPS, נמצא כי שברים 1-6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים (איור 2A). השברים הבאים הכילו מעט מאוד כלי רכב ח...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

פרוטוקול זה חשוב מכיוון שהוא מספק דרך לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות ממגוון חיידקים באופן הניתן לשחזור רב. היתרון הגדול בטכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבודד כלי רכב חשמליים מסביבות גדולות למדי של תרביות חיידקים, מה שיאפשר מחקרי in vivo. בעוד שהנתונים שאנו מראים משקפים יישומים פרה-קליניים, ניתן לצפות כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור כלי רכב חשמליים חיידקיים לטיפולים.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת תרבית תאים מדרגית עם שינוי קל. בגלל מדרגיות הפרוטוקול, חשוב שיהיו מסננים בגודל מתאים ועמודות SEC כדי לטפל בנפחים ההתחלתיים הרצויים של תרבית תאי חיידקים. המדגימים את הנהלים הם סיידי ג'ונסון, עוזר טכנולוג במעבדתו של ד"ר ג'סטין לתיה, דיוניסיוס ווטסון, עמית אונקולוגי במעבדתו של ד"ר ג'סטין לתיה, ואקים סנטוס, טכנולוג מחקר במעבדה שלי.התחל על ידי חיסון מושבות בודדות של Escherichia coli לתוך 250 עד 1000 מיליליטר של לוריא-ברטני, או מרק LB, באמצעות לולאה סטרילית. לאחר מכן, דגרו את התרבית באופן אירובי באינקובטור רועד ב-300 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות של דגירה, להבהיר את מדיום תרבית החיידקים על ידי העברת תרביות התאים לניקוי בקבוקי צנטריפוגה פוליפרופילן 500 מיליליטר לצנטריפוגה ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה בארבע מעלות צלזיוס ו -5, 000 פעמים G למשך 15 דקות.העבר את הסופרנטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה בזהירות לצנטריפוגה ב 10, 000 פעמים G במשך 15 דקות. לאחר מכן, העבר את ה- supernatant להתקן מסנן מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל 0.2 מיקרון בגודל המתאים וחבר את התקן הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד באופן משמעותי, העבר את החומר הלא מסונן למכשיר חדש.ניתן לאחסן את המדיום המסונן בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה או לעבד אותו באופן מיידי. כדי לבדוק את ההסרה המלאה של התאים בני הקיימא, פזרו אליקוט של הסופר-נאטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות וודאו היעדר מושבות לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. לריכוז המדיום המסונן בנפח של 100 מיליליטר, טען 90 מיליליטר של מדיום תרבות מסונן על המאגר של מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון וצנטריפוגה של המדיום ברוטור דלי מתנדנד בארבע מעלות צלזיוס ו -2, 000 פעמים G במרווחים של 15 עד 30 דקות עד שנפח המאגר העליון התרכז לפחות מ -0.5 מיליליטר.כדי למלא את המאגר בכל אמצעי תרבות מסונן שנותר, הסר את הזרימה בתחתית המכשיר כדי לאזן מחדש. אם הצמיגות של המדיום המרוכז במאגר גדלה באופן ניכר, דלל את המדיום עם PBS ו reconcentrate על ידי צנטריפוגה כדי להפחית כל שלפוחית שאינה חוץ-תאית, או חלבוני EV, קטן יותר מאשר חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון. לאחר מכן, העבר את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון לאחסון בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לרכז את המדיום המסונן בנפח גדול מ-100 מיליליטר, בחר סינון זרימה משיק בגודל מתאים, או התקן TFF, עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילו-דלטון.לאחר הרכבת מעגל סינון כפי שמוסבר בכתב היד, לשאוב 200 מיליליטר של PBS לתוך כלי מדורג כדי לקבוע את המהירות המתאימה המתאימה לקצב הזרימה הרצוי. כאשר המהירות מוגדרת, מפיצים את המדיום המותנה המסונן בכ-200 מיליליטר לדקה בטמפרטורת החדר ואוספים את המולקולות הקטנות מ-100 קילו-דלטון, תוך חציית קרום האולטרה-סינון כפסולת בכלי נפרד עד שנפח המדיום המותנה הופחת ל-100 עד 200 מיליליטר. ברצף לדלל את הנפח המסונן פי שניים עם PBS ולהמשיך להפיץ את המדיום עם המשאבה בכלי קטנים יותר כדי לרכז את הנפח ל 75 עד 100 מיליליטר, ולאחר מכן ל 25 מיליליטר ו 10 מיליליטר.הרם את צינורות ההזנה ממאגר הדגימה ושאב כדי לטהר את המסנן כדי לשחזר את הכמות המרבית של הדגימה. העבר את הדגימה המרוכזת למכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי של 15 מיליליטר עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד בארבע מעלות צלזיוס ו -2, 000 פעמים G למרווחים של 15 עד 30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון הוא פחות משני מיליליטר. העבירו את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון לאחסון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.לבידוד של כלי הרכב החשמליים, בצע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, או SEC, באמצעות עמודה קטנה עם נפח מיטה של 10 מיליליטר עבור פחות מ-100 מיליליטר של חומר מוצא ועמודה גדולה יותר עם נפח מיטה של 47 מיליליטר עבור יותר מ-100 מיליליטר של חומר מוצא. במשך מספר שעות לפני הניסוי, הביאו את עמודת ה-SEC וה-PBS לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ייצוב העמודה במצב אנכי באמצעות מעמד ומחזיק מעבדה סטנדרטיים. לפני שתתחבר לעמודת ה- SEC, הלח את מאגר הדגימה על ידי מתן אפשרות לחמישה מיליליטרים של PBS לזרום דרך הפריט למיכל פסולת.לאחר מכן, פתח את מכסה הכניסה של העמודה כדי להוסיף שני מיליליטר של PBS למאגר הדגימה וחבר בזהירות את המאגר לעמודה כאשר ה- PBS מטפטף החוצה דרך הפריט. לשיווי משקל של העמודה, הוסף 47 מיליליטר של PBS למאגר הדגימה, ולאחר מכן פתח את החלק התחתון של עמודת ה- SEC. לאחר מכן, אפשר לכל מאגר הדגימה שנטען לזרום דרך העמודה ולהשליך את הזרימה.לאחר טעינת שני מיליליטר של הדגימה על מאגר הדגימה, אפשרו לדגימה להיכנס לעמודה במלואה ולאסוף את הזרימה. הוסף מיד PBS למאגר הדגימה בנפח של 14.25 מיליליטר פחות נפח הדגימה כדי לאפשר לתמיסה לזרום דרך העמודה, תוך השמטת הכמות השווה לנפח ריק העמודה. לאחר מכן, מקם מיקרו-צינורית בעלת קשירה נמוכה של שני מיליליטר ישירות מתחת לעמודת ה-SEC כדי לאסוף את הזרימה הראשונה או את השבריר הראשון לאחר שאפשרה לשני מיליליטרים של PBS לעבור דרך העמודה.המשך להוסיף שני מיליליטר של PBS למאגר הדגימה כדי לאסוף כל שבר עוקב. אחסן את השברים שנאספו בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. לבדיקת סטריליות של השברים שנאספו של כלי רכב חשמליים, יש לחסן שלושה מיליליטרים של מדיום התרבית עם 100 מיקרוליטרים של השברים שישמשו במבחנים.לאחר מכן, תרבו את המדיום בתנאים אופטימליים תוך התבוננות בעכירות במשך שלושה ימים לפחות. לחלופין, ניתן ליישם את דגימות השבר על צלחות אגר המכילות את המדיום המשמש לגידול החיידקים המייצרים, ולאחר מכן לבדוק אם נוצרו מושבות. לאחר מכן, אחסנו את כלי הרכב החשמליים על ידי העברת 25% עד 50% מהשברים הבודדים או המאוגדים לצינורות קשירה דלי חלבון במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הפשרה בהקפאה.הניתוח הייצוגי מראה את ההעתקה של רכבים חשמליים מסוג Escherichia coli MP1 בשברים המוקדמים של הכרומטוגרפיה. השברים 1 עד 6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים, עם קוטר ממוצע נמוך מ-100 ננומטר. יחד עם זאת, השברים הבאים הכילו חלבונים נטולי EV ומעט מאוד כלי רכב חשמליים.העשרת EV וגודלו אושרו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, במיוחד בשברים שניים עד שישה. נצפה כי שברים מועשרים ב-EV שניים עד שבעה היו בעלי פעילות ננו-לוציפראז גבוהה, אך רק אות פלואורסצנטי נמוך מאוד מ-mCherry שאינו קשור ל-EV בהשוואה לזה של השברים המאוחרים יותר. תיוג האימונוגולד אישר את הקשר EV של ננולוציפראז בשברים שניים עד חמישה.תחולת הפרוטוקול על מיני החיידקים האחרים הוערכה על ידי בידוד כלי רכב חשמליים מתרביות של חיידקים אנאירוביים מגוונים. נצפה כי שברי הכרומטוגרפיה המוקדמים 1 עד 4 היו מועשרים עבור כלי רכב חשמליים, עם קוטר נמוך מ -100 ננומטר. עירוי המוח-לב המורכב, או BHI, הכיל את החלקיקים בגודל EV בפחות מ-25% מתפוקת הרכב החשמלי הכוללת.חשוב להשתמש במכשירי TFF המסוגלים להתמודד עם הנפח ההתחלתי של תרבית תאי החיידקים. טכניקה זו מאפשרת לנו לייצר מספיק כלי רכב חשמליים כדי לשאול שאלות ביולוגיות על תפקודם במודלים מורכבים של בעלי חיים.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...