Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
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La ricerca sopra descritta è stata supportata dalla borsa di formazione NIH TL1 TR002549-03. Ringraziamo i dottori John C. Tilton e Zachary Troyer (Case Western Reserve University) per aver facilitato l'accesso allo strumento analizzatore di dimensioni delle particelle; Lew Brown (Spectradyne) per l'assistenza tecnica nell'analisi dei dati di distribuzione granulometrica; Dr. David Putnam presso la Cornell University per aver fornito pClyA-GFP plasmide14; e il Dr. Mark Goulian dell'Università della Pennsylvania per averci fornito l'E. coli MP113.

NOTA: Assicurarsi che tutto il lavoro che coinvolge batteri e DNA ricombinante segua le migliori pratiche per il contenimento della biosicurezza appropriate per il livello di pericolo per la biosicurezza di ciascun ceppo. Il lavoro dovrebbe essere svolto in conformità con le normative locali, nazionali e internazionali sulla biosicurezza.
1. Ceppi batterici e condizioni di coltura
NOTA: I ceppi batterici utilizzati in questo studio erano Escheric...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

Nel protocollo di cui sopra, viene descritto un metodo scalabile e che isola in modo affidabile le EV da vari batteri gram-negativi / positivi e aerobici / anaerobici. Ha diversi potenziali punti di arresto durante la procedura, anche se è meglio evitare di impiegare più di 48 ore per isolare gli EV dai terreni di coltura batterica condizionati.
In primo luogo, consiste nel coltivare batteri per generare terreno di coltura batterica condizionato. È stato riscontrato che aumentare il tempo d...

Le vescicole extracellulari (EV) sono strutture simili a liposomi di dimensioni nanometriche composte da lipidi, proteine, glicani e acidi nucleici, secrete da cellule procariotiche ed eucariotiche1. Fin dai primi studi che visualizzavano il rilascio di EV da batteri gram-negativi2, il numero di funzioni biologiche attribuite alle EV batteriche (20-300 nm di diametro) è cresciuto costantemente negli ultimi decenni. Le loro funzioni includono il trasferimento della resistenza agli antibiotici3, la formazione di biofilm4, il quorum sensing5 e il rilascio di tossine6. C'è anche un crescente interesse per l'uso di EV batteriche come terapie, specialmente in vaccinologia7 e terapia del cancro8.
Nonostante il crescente interesse per la ricerca sui veicoli elettrici, ci sono ancora sfide tecniche per quanto riguarda i metodi di isolamento. In particolare, vi è la necessità di metodi di isolamento che siano riproducibili, scalabili e compatibili con diversi organismi produttori di veicoli elettrici. Per creare un insieme unificato di principi per la pianificazione e la segnalazione dei metodi di isolamento e ricerca dei veicoli elettrici, l'International Society for Extracellular Vesicles pubblica e aggiorna il documento di posizione MISEV9. Inoltre, il consorzio EV-TRACK fornisce una piattaforma aperta per la segnalazione di metodologie dettagliate per l'isolamento dei veicoli elettrici utilizzate nei manoscritti pubblicati per migliorare la trasparenza10.
In questo protocollo, le precedenti metodologie utilizzate per l'isolamento di EV da colture cellulari di mammifero sono state adattate11,12 per consentire l'isolamento di EV da colture cellulari batteriche. Abbiamo cercato di impiegare metodi che consentano l'isolamento dei veicoli elettrici da una varietà di microbi, che possono essere scalabili, e bilanciare la purezza e la resa dei veicoli elettrici (come discusso nel documento di posizione MISEV9). Dopo aver rimosso cellule batteriche e detriti mediante centrifugazione e filtrazione, il terreno di coltura viene concentrato mediante ultrafiltrazione del dispositivo centrifugo (per un volume fino a ~ 100 ml) o TFF azionato da pompa (per volumi maggiori). I veicoli elettrici vengono quindi isolati dalla SEC utilizzando colonne ottimizzate per la purificazione di piccoli veicoli elettrici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica schematica del flusso di lavoro di isolamento EV batterico. Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; TFF = filtrazione tangenziale a flusso; SEC = cromatografia ad esclusione dimensionale; MWCO = cut-off del peso molecolare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Un ceppo commensale di topo di Escherichia coli (cioè E. coli MP113) è stato utilizzato come organismo modello e modificato per esprimere nanoluciferasi associata a EV mediante fusione alla citolisina A, come precedentemente riportato14. I metodi utilizzati qui possono elaborare almeno fino a diversi litri di colture batteriche e separare efficacemente le proteine associate a EV da quelle non associate a EV. Infine, questo metodo può essere utilizzato anche per altre specie batteriche gram-positive e gram-negative. Tutti i dati rilevanti degli esperimenti riportati sono stati inviati alla knowledge base EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Diverse specie batteriche secernono ~ 20-300 nm vescicole extracellulari (EV), composte da lipidi, proteine, acidi nucleici, glicani e altre molecole derivate dalle cellule parentali. Le EV funzionano come vettori di comunicazione intra e interspecie, contribuendo anche all'interazione tra batteri e organismi ospiti nel contesto dell'infezione e della colonizzazione. Data la moltitudine di funzioni attribuite alle EV in salute e malattia, vi è un crescente interesse nell'isolamento delle EV per studi in vitro e in vivo . È stato ipotizzato che la separazione dei veicoli elettrici in base alle proprietà fisiche, vale a dire le dimensioni, faciliterebbe l'isolamento delle vescicole da diverse colture batteriche. 
Il flusso di lavoro di isolamento consiste in centrifugazione, filtrazione, ultrafiltrazione e cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) per l'isolamento di EV da colture batteriche. È stata incorporata una fase di filtrazione a flusso tangenziale (TFF) azionata da una pompa per migliorare la scalabilità, consentendo l'isolamento del materiale da litri di coltura cellulare iniziale. Escherichia coli è stato utilizzato come sistema modello che esprime nanoluciferasi associata a EV e mCherry non associata a EV come proteine reporter. La nanoluciferasi è stata mirata alle EV fondendo il suo N-terminale con la citolisina A. Le prime frazioni cromatografiche contenenti EV 20-100 nm con citolisina A - nanoLuc associata erano distinte dalle frazioni successive contenenti le proteine libere. La presenza di nanoluciferasi associate a EV è stata confermata dalla marcatura immunogold e dalla microscopia elettronica a trasmissione. Questo flusso di lavoro di isolamento EV è applicabile ad altre specie batteriche gram-negative e gram-positive associate all'intestino umano. In conclusione, la combinazione di centrifugazione, filtrazione, ultrafiltrazione / TFF e SEC consente l'isolamento scalabile di EV da diverse specie batteriche. L'impiego di un flusso di lavoro di isolamento standardizzato faciliterà gli studi comparativi delle EV microbiche tra le specie.

Per valutare quali frazioni cromatografiche SEC sono state arricchite per EV, la colonna SEC è stata caricata con 2 ml di terreno di coltura condizionato da E. coli MP1 che era stato concentrato 1.000 volte dal TFF e sono state raccolte frazioni sequenziali. Utilizzando MRPS, è stato riscontrato che le frazioni 1-6 contenevano il maggior numero di veicoli elettrici (Figura 2A). Le frazioni successive contenevano pochissime EV, comprendenti invece proteine prive di EV (<strong clas...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Questo protocollo è importante perché fornisce un modo per isolare le vescicole extracellulari da una varietà di batteri in modo altamente riproducibile. La cosa grandiosa di questa tecnica è che può essere utilizzata per isolare EV da ambienti abbastanza grandi di colture batteriche, il che consentirà studi in vivo. Mentre i dati che mostriamo riflettono le applicazioni precliniche, è prevedibile che questo protocollo potrebbe essere adattato alla produzione di EV batterici per le terapie.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema di coltura cellulare scalabile con piccole modifiche. A causa della scalabilità del protocollo, è importante disporre di filtri e colonne SEC di dimensioni appropriate per gestire i volumi iniziali desiderati di coltura cellulare batterica. A dimostrare le procedure sono Sadie Johnson, un assistente tecnologo nel laboratorio del Dr.Justin Lathia, Dionysius Watson, un collega di oncologia nel laboratorio del Dr.Justin Lathia, e Akeem Santos, un tecnologo di ricerca nel mio laboratorio.Inizia inoculando singole colonie di Escherichia coli in 250-1000 millilitri di Luria-Bertani, o brodo LB, usando un ciclo sterile. Quindi, incubare la coltura aerobicamente in un incubatore vibrante a 300 rotazioni al minuto e 37 gradi Celsius. Dopo 48 ore di incubazione, chiarire il terreno di coltura batterica trasferendo le colture cellulari in bottiglie di centrifuga in polipropilene da 500 millilitri pulite per centrifugare in un rotore ad angolo fisso di grande capacità a quattro gradi Celsius e 5.000 volte G per 15 minuti.Trasferire il surnatante per pulire le bottiglie della centrifuga versando accuratamente alla centrifuga a 10.000 volte G per 15 minuti. Quindi, trasferire il surnatante a un dispositivo filtrante sottovuoto in polietersulfone da 0,2 micron di dimensioni appropriate e collegare il dispositivo di filtrazione a un'alimentazione a parete sottovuoto. Se la velocità di filtrazione diminuisce in modo significativo, spostare il materiale non filtrato su un nuovo dispositivo.Il mezzo filtrato può essere conservato a quattro gradi Celsius durante la notte o può essere ulteriormente elaborato immediatamente. Per verificare la completa rimozione delle cellule vitali, distribuire un'aliquota del surnatante filtrato su apposite piastre di agar e garantire l'assenza di colonie dopo l'incubazione in condizioni ottimali per il ceppo batterico. Per concentrare il mezzo filtrato con un volume di 100 millilitri, caricare 90 millilitri di terreno di coltura filtrato sul serbatoio del dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga con un cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton e centrifugare il mezzo nel rotore della benna oscillante a quattro gradi Celsius e 2.000 volte G per intervalli da 15 a 30 minuti fino a quando il volume del nel serbatoio superiore è stato concentrato a meno di 0,5 millilitri.Per rabboccare il serbatoio con qualsiasi terreno di coltura filtrato rimanente, rimuovere il flusso nella parte inferiore del dispositivo per ribilanciarlo. Se la viscosità del mezzo concentrato nel serbatoio è visibilmente aumentata, diluire il mezzo con PBS e rifocalizzarlo mediante centrifugazione per ridurre qualsiasi vescicola non extracellulare, o proteine EV, più piccole del limite di peso molecolare di 100 kilodalton. Quindi, trasferire il mezzo concentrato in un tubo legante a basso contenuto proteico per conservare a quattro gradi Celsius durante la notte Per concentrare il mezzo filtrato con un volume superiore a 100 millilitri, selezionare una filtrazione a flusso tangenziale di dimensioni appropriate, o un dispositivo TFF, con un limite di peso molecolare di 100 kilodalton.Dopo aver assemblato un circuito di filtrazione come spiegato nel manoscritto, pompare 200 millilitri di PBS in un recipiente graduato per determinare la velocità appropriata corrispondente alla portata desiderata. Quando la velocità è impostata, far circolare il mezzo filtrato condizionato a circa 200 millilitri al minuto a temperatura ambiente e raccogliere le molecole più piccole di 100 kilodalton, attraversando la membrana di ultrafiltrazione come rifiuti in un recipiente separato fino a quando il volume del mezzo condizionato è stato ridotto a 100-200 millilitri. Diluire sequenzialmente il volume filtrato due volte con PBS e continuare a far circolare il mezzo con la pompa in recipienti più piccoli per concentrare il volume a 75-100 millilitri, quindi a 25 millilitri e 10 millilitri.Sollevare il tubo di alimentazione dal serbatoio del campione e pompare per spurgare il filtro per recuperare la quantità massima del campione. Spostare il campione concentrato su un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga da 15 millilitri con cutoff di peso molecolare di 100 kilodalton e centrifugare in un rotore a benna oscillante a quattro gradi Celsius e 2.000 volte G per intervalli da 15 a 30 minuti fino a quando il volume del mezzo nel serbatoio superiore è inferiore a due millilitri. Trasferire il mezzo concentrato in un tubo legante a basso contenuto proteico per conservare a quattro gradi Celsius durante la notte.Per l'isolamento dei veicoli elettrici, eseguire la cromatografia di esclusione dimensionale, o SEC, utilizzando una piccola colonna con un volume del letto di 10 millilitri per meno di 100 millilitri di materiale di partenza e una colonna più grande con un volume del letto di 47 millilitri per più di 100 millilitri di materiale di partenza. Per diverse ore prima dell'esperimento, portare la colonna SEC e PBS a temperatura ambiente, quindi stabilizzare la colonna in posizione verticale utilizzando un supporto e un supporto da laboratorio standard. Prima di collegarlo alla colonna SEC, idratare il serbatoio del campione consentendo a cinque millilitri di PBS di fluire attraverso la fritta in un contenitore per rifiuti.Quindi, svitare il tappo di ingresso della colonna per aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione e collegare con attenzione il serbatoio alla colonna mentre il PBS gocciola attraverso la fritta. Per l'equilibrio della colonna, aggiungere 47 millilitri di PBS al serbatoio del campione, quindi aprire la parte inferiore della colonna SEC. Quindi, consentire a tutto il buffer di campionamento caricato di fluire attraverso la colonna ed eliminare il flusso continuo.Dopo aver caricato due millilitri del campione sul serbatoio del campione, lasciare che il campione entri completamente nella colonna e raccolga il flusso attraverso. Aggiungere immediatamente PBS al serbatoio del campione ad un volume di 14,25 millilitri meno il volume del campione per consentire alla soluzione di fluire attraverso la colonna, scartando la quantità uguale al volume vuoto della colonna. Quindi, posizionare un microtubo a basso legame da due millilitri direttamente sotto la colonna SEC per raccogliere il primo flusso o frazione dopo aver permesso a due millilitri di PBS di passare attraverso la colonna.Continuare ad aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione per raccogliere ogni frazione successiva. Conservare le frazioni raccolte a quattro gradi Celsius per la conservazione a breve termine o meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Per i test di sterilità delle frazioni raccolte di EV, inoculare tre millilitri del terreno di coltura con 100 microlitri delle frazioni da utilizzare nei saggi.Quindi, coltivare il terreno in condizioni ottimali osservando la torbidità per almeno tre giorni. In alternativa, i campioni di frazione possono essere applicati a piastre di agar contenenti il mezzo utilizzato per far crescere i batteri produttori, quindi verificare la formazione di colonie. Successivamente, conservare gli EV trasferendo dal 25 al 50% delle frazioni singole o raggruppate in tubi leganti a basso contenuto proteico a meno 80 gradi Celsius per evitare cicli di congelamento-disgelo.L'analisi rappresentativa mostra l'eluizione di EV MP1 di Escherichia coli nelle prime frazioni cromatografiche. Le frazioni da uno a sei contenevano il maggior numero di veicoli elettrici, con un diametro medio inferiore a 100 nanometri. Allo stesso tempo, le frazioni successive contenevano proteine prive di EV e pochissime EV.L'arricchimento e le dimensioni dell'EV sono stati confermati dalla microscopia elettronica a trasmissione, in particolare nelle frazioni da due a sei. È stato osservato che le frazioni arricchite di EV da due a sette avevano un'elevata attività della nanoluciferasi, ma solo un segnale fluorescente molto basso da mCherry non associato a EV rispetto a quello delle frazioni successive. L'etichettatura immunogold ha confermato l'associazione EV della nanoluciferasi nelle frazioni da due a cinque.L'applicabilità del protocollo alle altre specie batteriche è stata valutata isolando le EV dalle colture di diversi batteri anaerobici. È stato osservato che le prime frazioni cromatografiche da uno a quattro erano arricchite per EV, con una dimensione del diametro inferiore a 100 nanometri. La complessa infusione cervello-cuore, o BHI, conteneva le particelle delle dimensioni di EV a meno del 25% della resa totale di EV.È importante utilizzare dispositivi TFF in grado di gestire il volume iniziale della coltura cellulare batterica. Questa tecnica ci consente di generare abbastanza EV per porre domande biologiche sulla loro funzione in modelli animali complessi.

Research

JoVE Journal

Biology

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