Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
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위에서 설명한 연구는 NIH TL1 TR002549-03 교육 보조금의 지원을 받았습니다. 입자 크기 분석기 기기에 쉽게 접근할 수 있도록 해주신 John C. Tilton 박사와 Zachary Troyer 박사(케이스 웨스턴 리저브 대학교)에게 감사드립니다. 입자 크기 분포 데이터의 분석에 대한 기술 지원을 위한 루라다인(Spectradyne); 코넬 대학교의 데이비드 퍼트넘 박사가 pClyA-GFP 플라스미드14를 제공한 공로; 펜실베니아 대학의 Mark Goulian 박사는 대장균 MP113을 제공했습니다.

알림: 박테리아 및 재조합 DNA와 관련된 모든 작업이 각 균주의 생물안전 위험 수준에 적합한 생물안전 억제를 위한 모범 사례를 따르는지 확인하십시오. 작업은 지역, 국가 및 국제 생물 안전 규정에 따라 수행되어야합니다.
1. 세균 균주 및 배양 조건
참고: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP113, Akkermansia muc...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

위의 프로토콜에서는 확장 가능하고 다양한 그람 음성/양성 및 호기성/혐기성 박테리아로부터 EV를 안정적으로 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 잠재적인 정지 지점이 있지만 컨디셔닝된 박테리아 배양 배지에서 EV를 분리하는 데 48시간 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.
첫째, 컨디셔닝 된 박테리아 배양 배지를 생성하기 위해 박테리아를 배양?...

세포외 소포(EV)는 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에서 분비되는 지질, 단백질, 글리칸 및 핵산으로 구성된 나노미터 크기의 리포솜 유사 구조입니다1. 그람 음성 박테리아2에서 EV의 방출을 시각화하는 초기 연구 이후, 박테리아 EV (직경 20-300 nm)에 기인 한 생물학적 기능의 수는 지난 수십 년 동안 지속적으로 증가하고 있습니다. 이들의 기능에는 항생제 내성전달3, 생물막 형성4, 쿼럼 감지5 및 독소 전달6이 포함됩니다. 또한 박테리아 EV를 치료제로 사용하는 것, 특히 백신학7 및 암 치료8에 대한 관심이 증가하고 있습니다.
EV 연구에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고 격리 방법에 대한 기술적 과제는 여전히 남아 있습니다. 특히, 재현 가능하고 확장 가능하며 다양한 EV 생산 유기체와 호환되는 분리 방법이 필요합니다. EV 분리 및 연구 방법을 계획하고 보고하기 위한 통일된 원칙을 만들기 위해 국제 세포외 소포 학회는 MISEV 입장 논문9를 발행하고 업데이트합니다. 또한 EV-TRACK 컨소시엄은 투명성을 높이기 위해 출판된 원고에 사용된 EV 격리에 대한 세부 방법론을 보고할 수 있는 개방형 플랫폼을 제공합니다10.
이 프로토콜에서, 포유류 세포 배양으로부터 EV의 분리에 사용된 이전의 방법론은 박테리아 세포 배양으로부터 EV의 분리를 가능하게 하기 위해11,12 조정되었다. 우리는 확장 가능한 다양한 미생물로부터 EV를 분리하고 EV 순도와 수율의 균형을 맞추는 방법을 사용하려고 했습니다(MISEV 입장논문 9에서 논의됨). 원심분리 및 여과로 박테리아 세포 및 파편을 제거한 후, 배양 배지는 원심 장치 한외여과(최대 ~100mL의 부피) 또는 펌프 구동 TFF(더 큰 부피의 경우)에 의해 농축됩니다. 그런 다음 EV는 소형 EV의 정제에 최적화된 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 분리됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> 그림 1: 박테리아 EV 격리 워크플로 회로도 개요. 약어 : EV = 세포 외 소포; TFF = 접선 유동 여과; SEC = 크기 배제 크로마토그래피; MWCO = 분자량 컷오프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
Escherichia coli (즉, E. coli MP113)의 마우스-공생 균주를 모델 유기체로서 사용하였고, 이전에 보고된 바와 같이, 세포리신 A에의 융합에 의해 EV-관련 나노루시퍼라제를 발현하도록 변형시켰다14. 여기에 사용 된 방법은 적어도 몇 리터의 박테리아 배양을 처리하고 EV 관련 단백질과 비 EV 관련 단백질을 효과적으로 분리 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 다른 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 종에도 사용할 수 있습니다. 보고된 실험의 모든 관련 데이터는 EV-TRACK 지식 베이스(EV-TRACK ID: EV210211)10에 제출되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

다양한 박테리아 종은 지질, 단백질, 핵산, 글리칸 및 모 세포에서 파생된 기타 분자로 구성된 ~20-300nm의 세포외 소포(EV)를 분비합니다. EV는 종내 및 종간 통신 벡터로 기능하는 동시에 감염 및 식민지화의 맥락에서 박테리아와 숙주 유기체 간의 상호 작용에 기여합니다. 건강 및 질병에서 EV에 기인하는 다양한 기능을 감안할 때 체외 및 생체 내 연구를 위해 EV를 분리하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 물리적 특성, 즉 크기에 기반한 EV의 분리는 다양한 박테리아 배양에서 소포의 분리를 용이하게 할 것이라는 가설이 세워졌습니다. 
분리 워크플로우는 박테리아 배양에서 EV를 분리하기 위한 원심분리, 여과, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 구성됩니다. 펌프 구동 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통합하여 확장성을 향상시켜 시작 세포 배양 리터에서 물질을 분리할 수 있습니다. 대장균 은 EV 관련 나노루시퍼라제 및 비EV 관련 mCherry를 리포터 단백질로 발현하는 모델 시스템으로 사용되었습니다. 나노루시페라아제는 N-말단을 사이토리신 A와 융합하여 EV를 표적으로 삼았습니다. 관련 사이토리신 A-나노루크와 함께 20-100nm EV를 포함하는 초기 크로마토그래피 분획은 유리 단백질을 포함하는 후기 분획과 구별되었습니다. EV-관련 나노루시퍼라제의 존재는 면역금 표지 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었다. 이 EV 분리 워크플로우는 다른 인간 장 관련 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 종에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 원심분리, 여과, 한외여과/TFF 및 SEC를 결합하면 다양한 박테리아 종에서 EV를 확장 가능한 분리할 수 있습니다. 표준화된 분리 워크플로우를 사용하면 종 간 미생물 EV의 비교 연구가 용이해질 것입니다.

EV에 대해 어떤 SEC 크로마토그래피 분획이 농축되었는지 평가하기 위해 SEC 컬럼에 TFF에 의해 1,000배 농축된 대장균 MP1 조절 배양액 2mL를 로드하고 순차적 분획을 수집했습니다. MRPS를 사용하여 분획 1-6에 가장 많은 EV가 포함되어 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). 후속 분획에는 EV가 없는 단백질 대신 포함된 EV가 거의 포함되어 있지 않았습니다(그림 2B</st...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

이 프로토콜은 재현성이 높은 방식으로 다양한 박테리아로부터 세포외 소포를 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 박테리아 배양의 상당히 큰 환경에서 EV를 분리하는 데 사용할 수 있어 생체 내 연구가 가능하다는 것입니다. 우리가 보여주는 데이터는 전임상 응용 프로그램을 반영하지만, 이 프로토콜은 치료제용 박테리아 EV 제조에 적용될 수 있을 것으로 예상됩니다.이 방법은 약간의 수정으로 확장 가능한 모든 세포 배양 시스템에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 확장성 때문에 박테리아 세포 배양의 원하는 시작 부피를 처리하기 위해 적절한 크기의 필터와 SEC 컬럼을 갖는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 저스틴 라티아 박사 연구실의 보조 기술자 인 새디 존슨, 저스틴 라시아 박사 연구실의 종양학 펠로우 인 디오니시우스 왓슨, 내 연구실의 연구 기술자 인 아킴 산토스입니다.멸균 루프를 사용하여 대장균의 단일 콜로니를 250-1000 밀리리터의 Luria-Bertani 또는 LB 국물에 접종하여 시작하십시오. 그런 다음 진탕 인큐베이터에서 분당 300회전 및 섭씨 37도의 호기성 배양액을 배양합니다. 배양 48 시간 후, 세포 배양 물을 깨끗한 500 밀리리터 폴리 프로필렌 원심 분리기 병으로 옮겨 섭씨 4도 및 5, 000 배 G에서 대용량 고정각 로터에서 15 분 동안 원심 분리하여 박테리아 배양 배지를 정화합니다.상층액을 15분 동안 10, 000회 G로 조심스럽게 원심분리기에 부어 세척한 원심분리기 병으로 옮긴다. 다음으로, 상청액을 적절한 크기의 0.2-마이크론 폴리에테르설폰 진공 구동 필터 장치로 옮기고 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 재료를 새 장치로 옮기십시오.여과된 배지는 섭씨 4도에서 밤새 보관하거나 즉시 추가 처리할 수 있습니다. 생존 가능한 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해, 여과된 상청액의 분취량을 적합한 한천 플레이트에 퍼뜨리고 박테리아 균주에 대한 최적 조건에서 배양한 후 임의의 콜로니가 없는지 확인한다. 여과된 배지를 100밀리리터의 부피로 농축하기 위해, 여과된 배양 배지 90밀리리터를 100킬로달톤의 분자량 차단을 갖는 원심 한외여과 장치의 저장소에 로딩하고, 스윙 버킷 로터에서 배지를 섭씨 4도에서 원심분리하고 2, 000배 G 상단 저장소의 부피가 0.5밀리리터 미만으로 농축될 때까지 15 내지 30분 간격으로 사용한다.남아 있는 여과된 배양 배지로 저장소를 채우려면 장치 바닥의 플로우 스루를 제거하여 균형을 재조정합니다. 저장소에서 농축된 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면 배지를 PBS로 희석하고 원심분리로 재농축하여 분자량 컷오프인 100킬로달톤보다 작은 비세포외 소포 또는 EV 단백질을 줄입니다. 그런 다음 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 100밀리리터보다 큰 부피로 여과된 배지를 농축하려면 분자량 컷오프가 100킬로달톤인 적절한 크기의 접선 유동 여과 또는 TFF 장치를 선택합니다.원고에 설명 된대로 여과 회로를 조립 한 후 200ml의 PBS를 눈금이있는 용기에 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 속도를 결정합니다. 속도가 설정되면, 여과된 조절 배지를 실온에서 분당 약 200 밀리리터로 순환시키고, 100 킬로달톤보다 작은 분자를 수집하고, 한외여과막을 가로질러 별도의 용기에서 폐기물로서 컨디셔닝 배지의 부피가 100 내지 200 밀리리터로 감소될 때까지. 여과된 부피를 PBS로 2배 순차적으로 희석하고 더 작은 용기에서 펌프로 배지를 계속 순환시켜 부피를 75 내지 100 밀리리터로 농축한 다음 25 밀리리터 및 10 밀리리터로 농축합니다.시료 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 펌프를 펌핑하여 필터를 퍼지하여 시료의 최대량을 회수합니다. 농축 된 샘플을 분자량 컷오프가 100 킬로 달톤 인 15 밀리리터 원심 한외 여과 장치로 옮기고 섭씨 4도 및 2, 000 배 G의 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기를 상단 저장소의 배지 부피가 2 밀리리터 미만이 될 때까지 15-30 분 간격으로 이동합니다. 농축된 배지를 저단백 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.EV의 분리를 위해 100밀리리터 미만의 출발 물질에 대해 10밀리리터 베드 부피의 작은 컬럼과 100밀리리터 이상의 출발 물질에 대해 47밀리리터 베드 부피를 갖는 더 큰 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행합니다. 실험 전 몇 시간에 걸쳐 SEC 컬럼과 PBS를 실온으로 가져온 다음 표준 실험실 스탠드 및 홀더를 사용하여 수직 위치에서 컬럼을 안정화합니다. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5밀리리터의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 샘플 저장소에 수분을 공급합니다.그런 다음 컬럼의 입구 캡을 풀어 샘플 저장소에 2밀리리터의 PBS를 추가하고 PBS가 프릿을 통해 떨어지므로 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다. 컬럼의 평형을 위해 샘플 저장소에 47ml의 PBS를 추가한 다음 SEC 컬럼의 하단을 풉니다. 그런 다음 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통과하도록 하고 플로우 스루를 폐기합니다.2밀리리터의 시료를 시료 저장소에 넣은 후 시료가 컬럼에 완전히 들어가도록 하고 플로우 스루를 수집합니다. PBS를 시료 부피를 뺀 14.25ml의 부피로 시료 저장소에 즉시 추가하여 용액이 컬럼을 통해 흐를 수 있도록 하고 컬럼 빈 부피와 동일한 양을 폐기합니다. 다음으로, 2밀리리터의 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 위치시켜 2밀리리터의 PBS가 컬럼을 통과하도록 허용한 후 첫 번째 플로우 스루 또는 분획 1을 수집합니다.샘플 저장소에 2 밀리리터의 PBS를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다. 수집 된 분획을 단기 보관의 경우 섭씨 4도, 장기 보관의 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 수집된 EV 분획의 무균 테스트를 위해 3밀리리터의 배양 배지에 분석에 사용할 100마이크로리터의 분획을 접종합니다.이어서, 배지를 최적 조건 하에서 배양하면서 적어도 3일 동안 탁도를 관찰하였다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용한 다음 콜로니 형성을 확인할 수 있습니다. 다음으로, 동결-해동 주기를 피하기 위해 개별 또는 풀링된 분획의 25-50%를 섭씨 영하 80도의 저단백 결합 튜브로 옮겨 EV를 보관하십시오.대표적인 분석은 초기 크로마토그래피 분획에서 대장균 MP1 EV의 용출을 보여줍니다. 분획 1에서 6까지는 평균 직경이 100나노미터 미만인 가장 많은 EV를 포함했습니다. 동시에, 후속 분획에는 EV가없는 단백질과 매우 적은 EV가 포함되었습니다.EV 농축 및 크기는 투과 전자 현미경에 의해, 특히 분획 2 내지 6에서 확인되었다. EV가 풍부한 분획 2 내지 7은 높은 나노루시퍼라제 활성을 갖는 것으로 관찰되었지만, 이후 분획에 비해 비 EV-관련 mCherry로부터의 형광 신호는 매우 낮았다. 면역금 표지는 분획 2 내지 5에서 나노루시퍼라아제의 EV 결합을 확인하였다.다른 박테리아 종에 대한 프로토콜의 적용 가능성은 다양한 혐기성 박테리아의 배양물에서 EV를 분리함으로써 평가되었습니다. 초기 크로마토그래피 분획 1에서 4는 직경 크기가 100나노미터 미만인 EV에 대해 농축된 것으로 관찰되었습니다. 복잡한 뇌-심장 주입 또는 BHI는 총 EV 수율의 25 % 미만으로 EV 크기의 입자를 포함했습니다.박테리아 세포 배양의 시작 부피를 처리 할 수있는 TFF 장치를 사용하는 것이 중요합니다. 이 기술을 통해 복잡한 동물 모델에서 기능에 대한 생물학적 질문을 할 수있는 충분한 EV를 생성 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

연구

생물학

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electrocompetent의 준비를위한 신속한 프로토콜<em&gt; 대장균</em&gt;와<em&gt; 콜레라 균</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures 및 Extracellular Vesicles에서 microRNAs의 분리

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...