Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Forskningen beskrevet ovenfor ble støttet av NIH TL1 TR002549-03 treningsstipend. Vi takker Dr. John C. Tilton og Zachary Troyer (Case Western Reserve University) for å lette tilgangen til partikkelstørrelsesanalysatorinstrumentet; Lew Brown (Spectradyne) for teknisk assistanse med analyse av partikkelstørrelsesfordelingsdata; Dr. David Putnam ved Cornell University for å gi pClyA-GFP plasmid14; og Dr. Goulian ved University of Pennsylvania for å gi oss E. coli MP113.

MERK: Sørg for at alt arbeid som involverer bakterier og rekombinant DNA følger beste praksis for biosikkerhetsoppsamling som passer for biosikkerhetsfarenivået for hver stamme. Arbeidet skal utføres i samsvar med lokale, nasjonale og internasjonale biosikkerhetsforskrifter.
1. Bakteriestammer og dyrkingsforhold
MERK: Bakteriestammer som ble brukt i denne studien var Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinoph...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

I protokollen ovenfor beskrives en metode som er skalerbar og pålitelig isolerer elbiler fra forskjellige gramnegative/positive og aerobe/anaerobe bakterier. Det har flere potensielle stoppesteder gjennom hele prosedyren, selv om det er bedre å unngå å ta lengre tid enn 48 timer å isolere elbiler fra betingede bakteriekulturmedier.
For det første består den av dyrking av bakterier for å generere betinget bakteriekulturmedium. Det ble funnet at å øke kulturtiden til minst 48 timer og ...

Ekstracellulære vesikler (EV) er nanometerstore, liposomlignende strukturer som består av lipider, proteiner, glykaner og nukleinsyrer, utskilt av både prokaryote og eukaryote celler1. Siden de tidlige studiene som visualiserer frigjøring av elbiler fra gramnegative bakterier2, har antall biologiske funksjoner som tilskrives bakterielle EV (20-300 nm i diameter) stadig vokst de siste tiårene. Deres funksjoner inkluderer overføring av antibiotikaresistens3, biofilmdannelse4, quorumsføling5 og toksinlevering6. Det er også økende interesse for bruk av bakterielle elbiler som terapi, spesielt i vaksinologi7 og kreftbehandling8.
Til tross for den økende interessen for EV-forskning, er det fortsatt tekniske utfordringer når det gjelder isoleringsmetoder. Spesielt er det behov for isolasjonsmetoder som er reproduserbare, skalerbare og kompatible med ulike EV-produserende organismer. For å skape et enhetlig sett med prinsipper for planlegging og rapportering av EV-isolasjon og forskningsmetoder, publiserer og oppdaterer International Society for Extracellular Vesicles MISEV-posisjonspapiret9. Videre gir EV-TRACK-konsortiet en åpen plattform for rapportering av detaljerte metoder for EV-isolasjon som brukes i publiserte manuskripter for å øke åpenheten10.
I denne protokollen ble tidligere metoder brukt for isolering av elbiler fra pattedyrcellekultur tilpasset11,12 for å muliggjøre isolering av elbiler fra bakteriecellekultur. Vi søkte å bruke metoder som muliggjør EV-isolasjon fra en rekke mikrober, som kan skaleres, og balansere EV-renhet og utbytte (som diskutert i MISEV-posisjonspapiret9). Etter fjerning av bakterieceller og rusk ved sentrifugering og filtrering, konsentreres kulturmediet enten ved sentrifugalanordning ultrafiltrering (for et volum på opptil ~ 100 ml) eller pumpedrevet TFF (for større volumer). EV-er isoleres deretter av SEC ved hjelp av kolonner som er optimalisert for rensing av små elbiler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over arbeidsflyt for bakteriell EV-isolasjon. Forkortelser: EV = ekstracellulær vesikkel; TFF = tangentiell strømningsfiltrering; SEC = størrelse eksklusjonskromatografi; MWCO = molekylvekt cut-off. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
En mus-commensal stamme av Escherichia coli (dvs. E. coli MP113) ble brukt som en modellorganisme og modifisert for å uttrykke EV-assosiert nanoluciferase ved fusjon til cytolysin A, som tidligere rapportert14. Metodene som brukes her kan behandle minst opptil flere liter bakteriekulturer og effektivt skille EV-assosiert fra ikke-EV-assosierte proteiner. Endelig kan denne metoden også brukes til andre gram-positive og gram-negative bakteriearter. Alle relevante data fra de rapporterte eksperimentene ble sendt til kunnskapsbasen EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Ulike bakteriearter utskiller ~ 20-300 nm ekstracellulære vesikler (EV), bestående av lipider, proteiner, nukleinsyrer, glykaner og andre molekyler avledet fra foreldrecellene. Elbiler fungerer som intra- og inter-arter kommunikasjonsvektorer samtidig som de bidrar til samspillet mellom bakterier og vertsorganismer i sammenheng med infeksjon og kolonisering. Gitt de mange funksjonene som tilskrives elbiler i helse og sykdom, er det en økende interesse for å isolere elbiler for in vitro og in vivo studier. Det ble antatt at separasjonen av elbiler basert på fysiske egenskaper, nemlig størrelse, ville lette isoleringen av vesikler fra forskjellige bakteriekulturer. 
Isolasjonsarbeidsflyten består av sentrifugering, filtrering, ultrafiltrering og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) for isolering av elbiler fra bakteriekulturer. Et pumpedrevet tangentielt strømningsfiltreringstrinn (TFF) ble innlemmet for å forbedre skalerbarheten, noe som muliggjør isolering av materiale fra liter startcellekultur. Escherichia coli ble brukt som et modellsystem som uttrykker EV-assosiert nanoluciferase og ikke-EV-assosiert mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferase ble målrettet mot elbilene ved å fusjonere sin N-endestasjon med cytolysin A. Tidlige kromatografifraksjoner inneholdende 20-100 nm EV med tilhørende cytolysin A-nanoLuc var forskjellige fra de senere fraksjonene som inneholdt de frie proteinene. Tilstedeværelsen av EV-assosiert nanoluciferase ble bekreftet ved immungullmerking og transmisjonselektronmikroskopi. Denne arbeidsflyten for EV-isolasjon gjelder for andre humane tarmassosierte gram-negative og gram-positive bakteriearter. Avslutningsvis muliggjør kombinering av sentrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF og SEC skalerbar isolering av elbiler fra forskjellige bakteriearter. Å bruke en standardisert isolasjonsarbeidsflyt vil lette komparative studier av mikrobielle elbiler på tvers av arter.

For å vurdere hvilke SEC-kromatografifraksjoner som ble beriket for elbiler, ble SEC-kolonnen lastet med 2 ml E. coli MP1-betinget kulturmedium som hadde blitt konsentrert 1,000 ganger av TFF, og sekvensielle fraksjoner ble samlet inn. Ved hjelp av MRPS ble det funnet at brøk 1-6 inneholdt flest elbiler (figur 2A). Påfølgende fraksjoner inneholdt svært få elbiler, bestående i stedet for EV-frie proteiner (figur 2B). Elbiler var hovedsakelig <100 ...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bakterier utskiller nanometerstore ekstracellulære vesikler (EV) som bærer bioaktive biologiske molekyler. EV-forskning fokuserer på å forstå deres biogenese, rolle i mikrobe-mikrobe og vertsmikrobe-interaksjoner og sykdom, samt deres potensielle terapeutiske anvendelser. En arbeidsflyt for skalerbar isolering av elbiler fra ulike bakterier presenteres for å lette standardisering av EV-forskning.

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Denne protokollen er viktig fordi den gir en måte å isolere ekstracellulære vesikler fra en rekke bakterier på en svært reproduserbar måte. Det flotte med denne teknikken er at den kan brukes til å isolere elbiler fra ganske store miljøer av bakteriekulturer, noe som vil muliggjøre in vivo-studier. Mens dataene vi viser gjenspeiler prekliniske applikasjoner, er det forutsigbart at denne protokollen kan tilpasses produksjon av bakterielle elbiler for terapi.Denne metoden kan brukes på ethvert skalerbart cellekultursystem med mindre modifikasjoner. På grunn av protokollens skalerbarhet er det viktig å ha filtre og SEC-kolonner i passende størrelse for å håndtere de ønskede startvolumene av bakteriecellekultur. Demonstrere prosedyrene er Sadie Johnson, en assisterende teknolog i Dr. Justin Lathia laboratorium, Dionysius Watson, en onkologi stipendiat i Dr.Justin Lathia laboratorium, og Akeem Santos, en forskningsteknolog i laboratoriet mitt.Begynn med å inokulere enkeltkolonier av Escherichia coli i 250 til 1000 ml Luria-Bertani, eller LB-buljong, ved hjelp av en steril sløyfe. Deretter inkuberer du kulturen aerobt i en ristende inkubator ved 300 rotasjoner per minutt og 37 grader Celsius. Etter 48 timers inkubasjon, avklare bakteriekulturmediet ved å overføre cellekulturene til å rengjøre 500 milliliter polypropylen sentrifugeflasker for å sentrifugere i en storkapasitet, fastvinkelrotor ved fire grader Celsius og 5.000 ganger G i 15 minutter.Overfør supernatanten til rengjør sentrifugeflasker ved å helle forsiktig til sentrifugen ved 10.000 ganger G i 15 minutter. Overfør deretter supernatanten til en 0,2 mikron polyetersulfon vakuumdrevet filteranordning av passende størrelse og koble filtreringsenheten til en vakuumveggforsyning. Hvis filtreringshastigheten synker betydelig, flytter du det ufiltrerte materialet til en ny enhet.Det filtrerte mediet kan lagres ved fire grader Celsius over natten eller kan behandles videre umiddelbart. For å kontrollere fullstendig fjerning av levedyktige celler, spred en aliquot av den filtrerte supernatanten på egnede agarplater og sørg for fravær av kolonier etter inkubering under optimale forhold for bakteriestammen. For å konsentrere det filtrerte mediet med et volum på 100 milliliter, last 90 milliliter filtrert kulturmedium på reservoaret av sentrifugal ultrafiltreringsanordning med en 100 kilodaltons molekylvekt cutoff og sentrifuger mediet i svingende bøtterotor ved fire grader Celsius og 2.000 ganger G i 15 til 30 minutters intervaller til volumet av i toppreservoaret er konsentrert til mindre enn 0,5 milliliter.For å fylle opp reservoaret med et gjenværende filtrert kulturmedium, fjern gjennomstrømningen i bunnen av enheten for å balansere. Hvis viskositeten til det konsentrerte mediet i reservoaret økes synlig, fortynn mediet med PBS og rekonsentrat ved sentrifugering for å redusere ikke-ekstracellulær vesikkel eller EV-proteiner, mindre enn molekylvektgrensen på 100 kilodalton. Overfør deretter det konsentrerte mediet til et lavproteinbindende rør for å lagre ved fire grader Celsius over natten For å konsentrere det filtrerte mediet med et volum større enn 100 milliliter, velg en passende størrelse tangentiell strømningsfiltrering, eller TFF-enhet, med en molekylvektavskjæring på 100 kilodalton.Etter montering av en filtreringskrets som forklart i manuskriptet, pump 200 milliliter PBS i et gradert fartøy for å bestemme riktig hastighet som tilsvarer ønsket strømningshastighet. Når hastigheten er satt, sirkulerer det filtrerte kondisjonerte mediet ved ca. 200 milliliter per minutt ved romtemperatur og samler molekylene mindre enn 100 kilodalton, krysser ultrafiltreringsmembranen som avfall i en separat beholder til volumet av det betingede mediet er redusert til 100 til 200 milliliter. Fortynn sekvensielt det filtrerte volumet to ganger med PBS og fortsett å sirkulere mediet med pumpen i mindre kar for å konsentrere volumet til 75 til 100 milliliter, og deretter til 25 milliliter og 10 milliliter.Løft fôrslangen ut av prøvereservoaret og pumpen for å rense filteret for å gjenvinne den maksimale mengden av prøven. Flytt den konsentrerte prøven til en 15 milliliter sentrifugal ultrafiltreringsanordning med molekylvekt på 100 kilodalton og sentrifuge i en svingende bøtterotor ved fire grader Celsius og 2.000 ganger G i 15 til 30 minutters intervaller til volumet av mediet i toppreservoaret er mindre enn to milliliter. Overfør det konsentrerte mediet til et lavproteinbindende rør for å lagre ved fire grader Celsius over natten.For isolering av elbiler, utfør størrelseseksklusjonskromatografi, eller SEC, ved hjelp av en liten kolonne med et 10 milliliter sengevolum for mindre enn 100 milliliter utgangsmateriale og en større kolonne med et 47 milliliter sengvolum for mer enn 100 milliliter utgangsmateriale. Over flere timer før eksperimentet, bring SEC-kolonnen og PBS til romtemperatur, etterfulgt av å stabilisere kolonnen i vertikal stilling ved hjelp av et standard laboratoriestativ og holder. Før du kobler til SEC-kolonnen, må du hydrere prøvereservoaret ved å la fem milliliter PBS strømme gjennom frit i en avfallsbeholder.Skru deretter av innløpshetten på kolonnen for å legge til to milliliter PBS til prøvereservoaret og koble reservoaret forsiktig til kolonnen mens PBS drypper ut gjennom friten. For likevekt av kolonnen, legg til 47 milliliter PBS til prøvereservoaret, etterfulgt av uncapping bunnen av SEC-kolonnen. La deretter all den lastede prøvebufferen flyte gjennom kolonnen og forkaste gjennomstrømningen.Etter å ha lastet to milliliter av prøven på prøvereservoaret, la prøven komme helt inn i kolonnen og samle gjennomstrømningen. Tilsett umiddelbart PBS i prøvereservoaret med et volum på 14, 25 milliliter minus prøvevolumet for å la løsningen strømme gjennom kolonnen, mens mengden som er lik kolonnehullvolumet, kastes. Deretter plasserer du et to milliliter lavbindende mikrorør rett under SEC-kolonnen for å samle den første gjennomstrømningen eller fraksjonen en etter å ha tillatt to milliliter PBS å løpe gjennom kolonnen.Fortsett å legge til to milliliter PBS til prøvereservoaret for å samle hver påfølgende fraksjon. Oppbevar de oppsamlede fraksjonene ved fire grader Celsius for kortvarig lagring eller minus 80 grader Celsius for langtidslagring. For sterilitetstesting av de oppsamlede fraksjonene av elbiler, inokulere tre milliliter av kulturmediet med 100 mikroliter av fraksjonene som skal brukes i analyser.Deretter dyrker du mediet under optimale forhold mens du observerer turbiditet i minst tre dager. Alternativt kan fraksjonsprøvene påføres agarplater som inneholder mediet som brukes til å dyrke de produserende bakteriene, og deretter sjekke for kolonidannelse. Deretter lagrer du elbilene ved å overføre 25 til 50% av de individuelle eller samlede fraksjonene til lavproteinbindende rør ved minus 80 grader Celsius for å unngå fryse-tine-sykluser.Den representative analysen viser eluering av Escherichia coli MP1 EV i de tidlige kromatografifraksjonene. Brøkdelene en til seks inneholdt flest elbiler, med en gjennomsnittlig diameter lavere enn 100 nanometer. Samtidig inneholdt de påfølgende fraksjonene EV-frie proteiner og svært få EV.EV-anrikningen og størrelsen ble bekreftet ved transmisjonselektronmikroskopi, spesielt i fraksjoner to til seks. Det ble observert at EV-berikede fraksjoner to til syv hadde høy nanoluciferaseaktivitet, men bare et svært lavt fluorescerende signal fra ikke-EV-assosiert mCherry sammenlignet med de senere fraksjonene. Immunogold-merkingen bekreftet EV-foreningen av nanoluciferase i fraksjoner to til fem.Anvendelsen av protokollen til de andre bakterieartene ble vurdert ved å isolere elbiler fra kulturer av forskjellige anaerobe bakterier. Det ble observert at de tidlige kromatografifraksjonene en til fire ble beriket for elbiler, med en diameterstørrelse lavere enn 100 nanometer. Den komplekse hjerne-hjerte-infusjonen, eller BHI, inneholdt partiklene i EV-størrelse på mindre enn 25% av det totale EV-utbyttet.Det er viktig å bruke TFF-enheter som er i stand til å håndtere startvolumet av bakteriecellekulturen. Denne teknikken lar oss generere nok elbiler til å stille biologiske spørsmål om deres funksjon i komplekse dyremodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering og rensing av kinesin fra Drosophila Embryoer

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifisering av protein komplekser i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Med sekvensiell Peptide affinitetsrensing i kombinasjon med tandem massespektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protokoll for Utarbeidelse av Electrocompetent<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Og<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Ikke-kromatografisk rensing av rekombinant Elastin-lignende polypeptider og deres Fusjoner med peptider og proteiner fra<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

A Rapid, skalerbar fremgangsmåte for isolering, Functional Study, og analyse av celle-avledet ekstracellulær matriks

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolasjon og karakterisering av cyanobakterielle ekstracellulære vesikler

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA fra Tick Ex Vivo spyttkjertelkulturer og ekstracellulære vesikler

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...