Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

A pesquisa descrita acima foi apoiada pela bolsa de treinamento NIH TL1 TR002549-03. Agradecemos aos Drs. John C. Tilton e Zachary Troyer (Case Western Reserve University) por facilitarem o acesso ao instrumento analisador de tamanho de partícula; Lew Brown (Spectradyne) para assistência técnica com análise dos dados de distribuição de tamanho de partícula; Dr. David Putnam na Universidade de Cornell por fornecer plasmídeo pClyA-GFP14; e o Dr. Mark Goulian da Universidade da Pensilvânia por nos fornecer a E. coli MP113.

NOTA: Garantir que todo o trabalho que envolva bactérias e ADN recombinante siga as melhores práticas de contenção de biossegurança adequadas ao nível de risco de biossegurança de cada estirpe. O trabalho deve ser feito de acordo com os regulamentos de biossegurança locais, nacionais e internacionais.
1. Estirpes bacterianas e condições de cultura
NOTA: As cepas bacterianas utilizadas neste estudo foram Escherichia coli MP1<sup clas...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

No protocolo acima, é descrito um método que é escalável e isola de forma confiável os EVs de várias bactérias gram-negativas/positivas e aeróbicas/anaeróbias. Tem vários pontos de parada potenciais ao longo do procedimento, embora seja melhor evitar levar mais de 48 h para isolar os EVs dos meios de cultura bacteriana condicionados.
Primeiro, consiste em cultivar bactérias para gerar meio de cultura bacteriana condicionado. Verificou-se que aumentar o tempo de cultura para pelo men...

As vesículas extracelulares (EVs) são estruturas do tamanho nanométrico, semelhantes a lipossomas, compostas por lipídios, proteínas, glicanos e ácidos nucleicos, secretadas por células procarióticas e eucarióticas1. Desde os primeiros estudos que visualizaram a liberação de EVs de bactérias gram-negativas2, o número de funções biológicas atribuídas a EVs bacterianas (20-300 nm de diâmetro) tem crescido constantemente nas últimas décadas. Suas funções incluem transferência de resistência a antibióticos3, formação de biofilme4, detecção de quórum5 e entrega de toxinas6. Há também um interesse crescente no uso de EVs bacterianos como terapêutica, especialmente em vacinologia7 e terapia do câncer8.
Apesar do crescente interesse na pesquisa de VE, ainda existem desafios técnicos em relação aos métodos de isolamento. Especificamente, há uma necessidade de métodos de isolamento que sejam reprodutíveis, escaláveis e compatíveis com diversos organismos produtores de EV. Para criar um conjunto unificado de princípios para o planejamento e relato de isolamento de EV e métodos de pesquisa, a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares publica e atualiza o documento de posição MISEV9. Além disso, o consórcio EV-TRACK fornece uma plataforma aberta para relatar metodologias detalhadas para o isolamento de EV usadas em manuscritos publicados para aumentar a transparência10.
Neste protocolo, metodologias anteriores utilizadas para o isolamento de EVs da cultura de células de mamíferos foram adaptadas11,12 para permitir o isolamento de EVs da cultura de células bacterianas. Procuramos empregar métodos que permitam o isolamento de EV de uma variedade de micróbios, que podem ser escaláveis, e equilibrar a pureza e o rendimento do EV (conforme discutido no documentode posição MISEV 9). Após a remoção de células bacterianas e detritos por centrifugação e filtração, o meio de cultura é concentrado por ultrafiltração por dispositivo centrífugo (para um volume de até ~100 mL) ou TFF acionado por bomba (para volumes maiores). Os EVs são então isolados pela SEC usando colunas otimizadas para a purificação de pequenos EVs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho de isolamento de EV bacteriano. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TFF = filtração de fluxo tangencial; SEC = cromatografia de exclusão de tamanho; MWCO = ponto de corte do peso molecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Uma cepa comensal de camundongo de Escherichia coli (isto é, E. coli MP113) foi utilizada como organismo modelo e modificada para expressar nanoluciferase associada a EV por fusão com citolisina A, conforme relatado anteriormente14. Os métodos utilizados aqui podem processar pelo menos até vários litros de culturas bacterianas e efetivamente separar as proteínas associadas ao EV das proteínas não associadas ao EV. Finalmente, este método também pode ser usado para outras espécies bacterianas gram-positivas e gram-negativas. Todos os dados relevantes dos experimentos relatados foram submetidos à base de conhecimento EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Diversas espécies bacterianas secretam ~20-300 nm de vesículas extracelulares (EVs), compostas de lipídios, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos e outras moléculas derivadas das células parentais. Os EVs funcionam como vetores de comunicação intra e interespécies, ao mesmo tempo em que contribuem para a interação entre bactérias e organismos hospedeiros no contexto de infecção e colonização. Dada a multiplicidade de funções atribuídas aos EVs na saúde e na doença, há um interesse crescente em isolar EVs para estudos in vitro e in vivo. Hipotetizou-se que a separação dos EVs com base em propriedades físicas, ou seja, tamanho, facilitaria o isolamento de vesículas de diversas culturas bacterianas. 
O fluxo de trabalho de isolamento consiste em centrifugação, filtração, ultrafiltração e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para o isolamento de EVs de culturas bacterianas. Uma etapa de filtragem de fluxo tangencial (TFF) acionada por bomba foi incorporada para melhorar a escalabilidade, permitindo o isolamento do material de litros de cultura de células iniciais. Escherichia coli foi utilizada como um sistema modelo que expressa nanoluciferase associada a EV e mCherry não associada a EV como proteínas repórteres. A nanoluciferase foi direcionada aos EVs pela fusão de seu N-terminal com a citolisina A. Frações de cromatografia inicial contendo EVs de 20-100 nm com citolisina A associada - nanoLuc foram distintas das frações posteriores contendo as proteínas livres. A presença de nanoluciferase associada à EV foi confirmada por marcação imunodourada e microscopia eletrônica de transmissão. Este fluxo de trabalho de isolamento EV é aplicável a outras espécies bacterianas gram-negativas e gram-positivas associadas ao intestino humano. Em conclusão, a combinação de centrifugação, filtração, ultrafiltração/TFF e SEC permite o isolamento escalável de EVs de diversas espécies bacterianas. Empregar um fluxo de trabalho de isolamento padronizado facilitará estudos comparativos de EVs microbianos entre espécies.

Para avaliar quais frações de cromatografia SEC foram enriquecidas para EVs, a coluna SEC foi carregada com 2 mL de meio de cultura condicionado por E. coli MP1 que havia sido concentrado 1.000 vezes por TFF, e frações sequenciais foram coletadas. Utilizando MRPS, verificou-se que as frações 1-6 continham a maioria dos EVs (Figura 2A). As frações subsequentes continham muito poucos EVs, compreendendo em vez de proteínas livres de EV (Figura 2B)...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Este protocolo é importante porque fornece uma maneira de isolar vesículas extracelulares de uma variedade de bactérias de uma maneira altamente reprodutível. A grande coisa sobre esta técnica é que ela pode ser usada para isolar EVs de ambientes bastante grandes de culturas bacterianas, o que permitirá estudos in vivo. Embora os dados que mostramos reflitam aplicações pré-clínicas, é previsível que este protocolo possa ser adaptado para a fabricação de EVs bacterianos para terapia.Este método pode ser aplicado a qualquer sistema de cultura de células escalável com pequenas modificações. Devido à escalabilidade do protocolo, é importante ter filtros de tamanho apropriado e colunas SEC para lidar com os volumes iniciais desejados de cultura de células bacterianas. Demonstrando os procedimentos estão Sadie Johnson, uma tecnóloga assistente no laboratório do Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, um bolsista de oncologia no laboratório do Dr. Justin Lathia, e Akeem Santos, um tecnólogo de pesquisa no meu laboratório.Comece inoculando colônias únicas de Escherichia coli em 250 a 1000 mililitros de caldo de Luria-Bertani, ou LB, usando uma alça estéril. Em seguida, incube a cultura aerobicamente em uma incubadora de agitação a 300 rotações por minuto e 37 graus Celsius. Após 48 horas de incubação, esclareça o meio de cultura bacteriana transferindo as culturas celulares para limpar frascos de centrífuga de polipropileno de 500 mililitros para centrífuga em um rotor de ângulo fixo de grande capacidade a quatro graus Celsius e 5.000 vezes G por 15 minutos.Transfira o sobrenadante para limpar os frascos de centrífuga despejando cuidadosamente a centrífuga a 10.000 vezes G por 15 minutos. Em seguida, transfira o sobrenadante para um dispositivo de filtro a vácuo de polietersulfona de 0,2 mícron de um tamanho apropriado e conecte o dispositivo de filtragem a uma fonte de parede a vácuo. Se a taxa de filtração cair significativamente, mova o material não filtrado para um novo dispositivo.O meio filtrado pode ser armazenado a quatro graus Celsius durante a noite ou pode ser processado imediatamente. Para verificar a remoção completa das células viáveis, espalhe uma alíquota do sobrenadante filtrado em placas de ágar adequadas e assegure a ausência de colônias após a incubação em condições ótimas para a cepa bacteriana. Para concentrar o meio filtrado com um volume de 100 mililitros, carregar 90 mililitros de meio de cultura filtrado no reservatório do dispositivo de ultrafiltração centrífuga com um corte de peso molecular de 100 quilodaltons e centrifugar o meio no rotor da caçamba oscilante a quatro graus Celsius e 2.000 vezes G por intervalos de 15 a 30 minutos até que o volume do reservatório superior tenha sido concentrado a menos de 0,5 mililitros.Para completar o reservatório com qualquer meio de cultura filtrado restante, remova o fluxo no fundo do dispositivo para reequilibrar. Se a viscosidade do meio concentrado no reservatório estiver visivelmente aumentada, diluir o meio com PBS e reconcentrar por centrifugação para reduzir qualquer vesícula não extracelular, ou proteínas EV, menores que o ponto de corte de peso molecular de 100 quilodaltons. Em seguida, transfira o meio concentrado para um tubo de ligação de baixa proteína para armazenar a quatro graus Celsius durante a noite Para concentrar o meio filtrado com um volume maior que 100 mililitros, selecione uma filtração de fluxo tangencial de tamanho apropriado, ou dispositivo TFF, com um corte de peso molecular de 100 kilodaltons.Depois de montar um circuito de filtração, conforme explicado no manuscrito, bombeie 200 mililitros de PBS em um recipiente graduado para determinar a velocidade apropriada correspondente à taxa de fluxo desejada. Quando a velocidade estiver definida, faça circular o meio condicionado filtrado a aproximadamente 200 mililitros por minuto à temperatura ambiente e recolher as moléculas inferiores a 100 quilodaltons, atravessando a membrana de ultrafiltração como resíduo num recipiente separado até que o volume do meio condicionado tenha sido reduzido para 100 a 200 mililitros. Diluir sequencialmente o volume filtrado duas vezes com PBS e continuar circulando o meio com a bomba em recipientes menores para concentrar o volume em 75 a 100 mililitros e, em seguida, a 25 mililitros e 10 mililitros.Levante a tubulação de alimentação para fora do reservatório da amostra e bombeie para purgar o filtro para recuperar a quantidade máxima da amostra. Mover a amostra concentrada para um dispositivo de ultrafiltração centrífuga de 15 mililitros com corte de peso molecular de 100 quilodaltons e centrífuga em um rotor de balde oscilante a quatro graus Celsius e 2.000 vezes G por intervalos de 15 a 30 minutos até que o volume do meio no reservatório superior seja inferior a dois mililitros. Transfira o meio concentrado para um tubo de ligação de baixa proteína para armazenar a quatro graus Celsius durante a noite.Para o isolamento dos VEs, realize cromatografia de exclusão de tamanho, ou SEC, usando uma pequena coluna com um volume de leito de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida e uma coluna maior com um volume de leito de 47 mililitros para mais de 100 mililitros de material de partida. Durante várias horas antes do experimento, traga a coluna SEC e a PBS à temperatura ambiente, seguidas pela estabilização da coluna em uma posição vertical usando um suporte e suporte de laboratório padrão. Antes de se conectar à coluna SEC, hidrate o reservatório da amostra permitindo que cinco mililitros de PBS fluam através da frita para um recipiente de resíduos.Em seguida, desparafuse a tampa de entrada da coluna para adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório da amostra e conecte cuidadosamente o reservatório à coluna à medida que o PBS estiver escorrendo pela frita. Para o equilíbrio da coluna, adicione 47 mililitros de PBS ao reservatório da amostra, seguido de destampar o fundo da coluna SEC. Em seguida, permita que todo o buffer de amostra carregado flua através da coluna e descarte o fluxo.Depois de carregar dois mililitros da amostra no reservatório da amostra, permita que a amostra entre completamente na coluna e recolha o fluxo. Adicionar imediatamente PBS ao reservatório da amostra a um volume de 14,25 mililitros menos o volume da amostra para permitir que a solução flua através da coluna, descartando a quantidade igual ao volume vazio da coluna. Em seguida, posicione um microtubo de baixa ligação de dois mililitros diretamente abaixo da coluna SEC para coletar o primeiro fluxo ou fração um, depois de permitir que dois mililitros de PBS percorram a coluna.Continue a adicionar dois mililitros de PBS ao reservatório da amostra para coletar cada fração subsequente. Armazene as frações coletadas a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou menos 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Para o teste de esterilidade das frações coletadas de EVs, inocular três mililitros do meio de cultura com 100 microlitros das frações a serem utilizadas nos ensaios.Em seguida, cultive o meio em condições ideais enquanto observa a turbidez por pelo menos três dias. Alternativamente, as amostras de fração podem ser aplicadas a placas de ágar contendo o meio usado para cultivar as bactérias produtoras e, em seguida, verificar a formação de colônias. Em seguida, armazene os EVs transferindo 25 a 50% das frações individuais ou agrupadas para tubos de ligação de baixa proteína a menos 80 graus Celsius para evitar ciclos de congelamento-descongelamento.A análise representativa mostra a eluição de Escherichia coli MP1 EVs nas frações iniciais de cromatografia. As frações de um a seis continham a maioria dos EVs, com diâmetro médio inferior a 100 nanômetros. Ao mesmo tempo, as frações subsequentes continham proteínas livres de EV e muito poucos EVs.O enriquecimento e o tamanho do EV foram confirmados por microscopia eletrônica de transmissão, particularmente nas frações dois a seis. Observou-se que as frações enriquecidas com EV de dois a sete apresentaram alta atividade de nanoluciferase, mas apenas um sinal fluorescente muito baixo de mCherry não associado a EV em comparação com o das frações posteriores. A marcação imunoouro confirmou a associação EV da nanoluciferase nas frações dois a cinco.A aplicabilidade do protocolo às demais espécies bacterianas foi avaliada por meio do isolamento de EVs das culturas de diversas bactérias anaeróbias. Observou-se que as primeiras frações de cromatografia de um a quatro foram enriquecidas para EVs, com diâmetro inferior a 100 nanômetros. A complexa infusão cérebro-coração, ou BHI, continha as partículas do tamanho de EV em menos de 25% do rendimento total de EV.É importante utilizar dispositivos TFF capazes de manusear o volume inicial da cultura de células bacterianas. Esta técnica nos permite gerar EVs suficientes para fazer perguntas biológicas sobre sua função em modelos animais complexos.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Biologia

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

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Protocolo Rápido para Preparação de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

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A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

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The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

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Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Isolamento de microRNAs de Tick Ex Vivo Culturas de Glândulas Salivares e Vesículos Extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...