Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Исследование, описанное выше, было поддержано учебным грантом NIH TL1 TR002549-03. Мы благодарим докторов Джона К. Тилтона и Закари Тройера (Case Western Reserve University) за облегчение доступа к прибору для анализа размера частиц; Лью Браун (Spectradyne) за техническую помощь в анализе данных о распределении частиц по размерам; д-р Дэвид Патнэм из Корнелльского университета за предоставление плазмиды pClyA-GFP14; и д-р Марк Гулиан из Университета Пенсильвании за предоставление нам E. coli MP113.

ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечить, чтобы вся работа, связанная с бактериями и рекомбинантной ДНК, соответствовала передовой практике сдерживания биобезопасности, соответствующей уровню опасности биобезопасности каждого штамма. Работа должна проводиться в соответствии с местными, национальным...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

В протоколе выше описан способ, который является масштабируемым и надежно изолирует EV от различных грамотрицательных/положительных и аэробных/анаэробных бактерий. Он имеет несколько потенциальных остановочных точек на протяжении всей процедуры, хотя лучше избегать использования бо?...

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой нанометровые липосомоподобные структуры, состоящие из липидов, белков, гликанов и нуклеиновых кислот, секретируемых как прокариотическими, так и эукариотическими клетками1. Начиная с ранних исследований, визуализирующих высвобождение EV из грамотрицательных бактерий2, количество биологических функций, приписываемых бактериальным EV (20-300 нм в диаметре), постоянно растет в последние десятилетия. Их функции включают перенос устойчивости к антибиотикам3, образование биопленки4, ощущение кворума5 и доставку токсинов6. Растет также интерес к использованию бактериальных EV в качестве терапевтических средств, особенно в вакцинологии7 и терапии рака8.
Несмотря на растущий интерес к исследованиям электромобилей, все еще существуют технические проблемы, связанные с методами изоляции. В частности, существует потребность в методах изоляции, которые являются воспроизводимыми, масштабируемыми и совместимыми с различными организмами, производящими электромобили. Чтобы создать единый набор принципов для планирования и отчетности по изоляции ЭЛЕКТРОМОБИЛей и методам исследования, Международное общество внеклеточных везикул публикует и обновляет позиционный документMISEV 9. Кроме того, консорциум EV-TRACK предоставляет открытую платформу для представления подробных методологий изоляции электромобилей, используемых в опубликованных рукописях для повышения прозрачности10.
В этом протоколе предыдущие методологии, используемые для выделения EV из культуры клеток млекопитающих, были адаптированы11,12, чтобы обеспечить выделение EV из бактериальной клеточной культуры. Мы стремились использовать методы, которые позволяют изолировать EV от различных микробов, которые могут быть масштабируемыми, и сбалансировать чистоту и выход EV (как обсуждалось в позиционном документеMISEV 9). После удаления бактериальных клеток и мусора центрифугированием и фильтрацией питательную среду концентрируют либо ультрафильтрацией центробежного устройства (для объема до ~100 мл), либо насосным ТФФ (для больших объемов). Затем электромобили изолируются SEC с помощью столбцов, оптимизированных для очистки небольших электромобилей.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Рисунок 1: Обзор схемы рабочего процесса изоляции бактериальных электромобилей. Сокращения: EV = внеклеточный везикул; TFF = тангенциальная фильтрация потока; SEC = размерная эксклюзионная хроматография; MWCO = отсечка молекулярной массы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Мышино-комменсальный штамм Escherichia coli (т.е. E. coli MP113) использовали в качестве модельного организма и модифицировали для экспрессии EV-ассоциированной нанолюциферазы путем слияния с цитолизином А, как сообщалось ранее14. Методы, используемые здесь, могут обрабатывать, по крайней мере, до нескольких литров бактериальных культур и эффективно отделять EV-ассоциированные от не-EV-ассоциированных белков. Наконец, этот метод также может быть использован для других грамположительных и грамотрицательных видов бактерий. Все соответствующие данные представленных экспериментов были представлены в базу знаний EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Различные виды бактерий выделяют ~ 20-300 нм внеклеточные везикулы (EV), состоящие из липидов, белков, нуклеиновых кислот, гликанов и других молекул, полученных из родительских клеток. EV функционируют как внутри- и межвидовые коммуникационные векторы, а также способствуют взаимодействию между бактериями и организмами-хозяевами в контексте инфекции и колонизации. Учитывая множество функций, приписываемых ev в здоровье и болезнях, растет интерес к выделению EV для исследований in vitro и in vivo . Было выдвинуто предположение, что разделение электромобилей на основе физических свойств, а именно размера, облегчит выделение везикул из различных бактериальных культур. 
Рабочий процесс изоляции состоит из центрифугирования, фильтрации, ультрафильтрации и хроматографии с исключением размера (SEC) для выделения EV из бактериальных культур. Для повышения масштабируемости была включена стадия тангенциальной фильтрации потока (TFF), управляемая насосом, что позволило отделить материал от литров стартовой клеточной культуры. Escherichia coli использовалась в качестве модельной системы, экспрессирующей EV-ассоциированную нанолюциферазу и не-EV-ассоциированную mCherry в качестве репортерных белков. Нанолюцифераза была нацелена на EV путем слияния ее N-конца с цитолизином A. Ранние фракции хроматографии, содержащие 20-100 нм EV с ассоциированным цитолизином А - наноЛюк, отличались от более поздних фракций, содержащих свободные белки. Наличие EV-ассоциированной нанолюциферазы было подтверждено иммунозолотой маркировкой и просвечивающей электронной микроскопией. Этот рабочий процесс изоляции ЭЛЕКТРОМОБИЛей применим к другим человеческим кишечно-ассоциированным грамотрицательным и грамположительным видам бактерий. В заключение, сочетание центрифугирования, фильтрации, ультрафильтрации / TFF и SEC обеспечивает масштабируемую изоляцию электромобилей от различных видов бактерий. Использование стандартизированного рабочего процесса изоляции облегчит сравнительные исследования микробных ЭЛЕКТРОМОБИЛей между видами.

Чтобы оценить, какие фракции хроматографии SEC были обогащены для электромобилей, колонку SEC загрузили 2 мл питательной среды E. coli MP1, которая была сконцентрирована в 1000 раз TFF, и были собраны последовательные фракции. Используя MRPS, было обнаружено, что фракции 1-6 содержат наибольшее к?...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Бактерии выделяют внеклеточные везикулы (EV) нанометрового размера, несущие биологические молекулы. Исследования ЭЛЕКТРОМОБИЛей сосредоточены на понимании их биогенеза, роли во взаимодействиях микроб-микроб и микроб-хозяин и болезни, а также их потенциальных терапевтических применений. Представлен рабочий процесс для масштабируемой изоляции электромобилей от различных бактерий для облегчения стандартизации исследований электромобилей.

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Этот протокол важен, потому что он обеспечивает способ выделения внеклеточных везикул из различных бактерий высоко воспроизводимым способом. Самое замечательное в этом методе заключается в том, что его можно использовать для выделения электромобилей из довольно больших сред бактериальных культур, что позволит проводить исследования in vivo. Хотя данные, которые мы показываем, отражают доклинические приложения, можно предвидеть, что этот протокол может быть адаптирован для производства бактериальных EV для терапии.Этот метод может быть применен к любой масштабируемой системе клеточных культур с незначительными изменениями. Из-за масштабируемости протокола важно иметь фильтры соответствующего размера и столбцы SEC для обработки желаемых начальных объемов культуры бактериальных клеток. Процедуры демонстрируют Сэди Джонсон, помощник технолога в лаборатории доктора Джастина Латии, Дионисиус Уотсон, специалист по онкологии в лаборатории доктора Джастина Латии, и Аким Сантос, технолог-исследователь в моей лаборатории.Начните с инокуляции одиночных колоний кишечной палочки в 250-1000 миллилитров Лурии-Бертани, или бульона LB, используя стерильную петлю. Затем высиживают культуру аэробно в трясущемся инкубаторе со скоростью 300 оборотов в минуту и 37 градусами Цельсия. После 48 часов инкубации осветляют бактериальную питательную среду путем переноса клеточных культур в чистые 500-миллилитровые полипропиленовые центрифужные бутылки для центрифуги в роторе большой емкости с фиксированным углом при четырех градусах Цельсия и 5 000 раз G в течение 15 минут.Переложите супернатант в чистые бутылки центрифуги, тщательно вылив в центрифугу по 10 000 G в течение 15 минут. Затем перенесите супернатант на 0,2-микронный фильтрующий прибор с вакуумным приводом от полиэфирсульфона соответствующего размера и подключите фильтрующее устройство к вакуумной стенке питания. Если скорость фильтрации значительно падает, переместите нефильтрованный материал на новое устройство.Отфильтрованная среда может храниться при четырех градусах Цельсия в течение ночи или может быть немедленно обработана. Чтобы проверить полное удаление жизнеспособных клеток, распределите аликвоту фильтрованного супернатанта на подходящие агаровые пластины и обеспечьте отсутствие каких-либо колоний после инкубации в оптимальных условиях для бактериального штамма. Для концентрирования фильтрованной среды объемом 100 миллилитров загружают 90 миллилитров фильтрованной питательной среды в резервуар центробежного ультрафильтрационного устройства с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон и центрифугируют среду в качающемся роторе ковша при четырех градусах Цельсия и 2 000 раз G с интервалом от 15 до 30 минут до тех пор, пока объем в верхнем резервуаре не будет сконцентрирован менее чем на 0,5 миллилитра.Чтобы долить резервуар оставшейся фильтрованной питательной средой, удалите проточную в нижней части устройства для восстановления баланса. Если вязкость концентрированной среды в резервуаре заметно увеличена, разбавляют среду PBS и реконцентрируют центрифугированием, чтобы уменьшить любые неклетоклеточные пузырьки или белки EV, меньшие, чем отсечение молекулярной массы в 100 килодалтон. Затем перенесите концентрированную среду в трубку с низким содержанием белка для хранения при четырех градусах Цельсия в течение ночи Для концентрирования отфильтрованной среды с объемом более 100 миллилитров выберите тангенциальную фильтрацию соответствующего размера или устройство TFF с отсечкой молекулярной массы 100 килодальтон.После сборки контура фильтрации, как описано в рукописи, закачайте 200 миллилитров PBS в градуированный сосуд, чтобы определить соответствующую скорость, соответствующую желаемому расходу. Когда скорость установлена, циркулируйте отфильтрованную кондиционированную среду со скоростью приблизительно 200 миллилитров в минуту при комнатной температуре и собирайте молекулы размером менее 100 килодальтон, пересекая ультрафильтрационную мембрану в качестве отходов в отдельном сосуде до тех пор, пока объем кондиционированной среды не будет уменьшен до 100-200 миллилитров. Последовательно разбавляйте отфильтрованный объем в два раза PBS и продолжайте циркуляцию среды с насосом в меньших сосудах, чтобы сконцентрировать объем до 75-100 миллилитров, а затем до 25 миллилитров и 10 миллилитров.Поднимите питательную трубку из резервуара для проб и откачайте фильтр для очистки фильтра для извлечения максимального количества образца. Переместите концентрированный образец в 15-миллилитровое центробежное ультрафильтрационное устройство с отсечкой молекулярной массы 100 килодалтонов и центрифугу в качающемся роторе ковша при четырех градусах Цельсия и 2000 раз g с интервалом от 15 до 30 минут, пока объем среды в верхнем резервуаре не составит менее двух миллилитров. Перенесите концентрированную среду в трубку с низким содержанием белка, чтобы хранить при четырех градусах Цельсия в течение ночи.Для изоляции электромобилей выполняют эксклюзионную хроматографию размеров, или SEC, используя небольшую колонку с объемом слоя 10 миллилитров для менее 100 миллилитров исходного материала и большую колонну с объемом слоя 47 миллилитров для более чем 100 миллилитров исходного материала. За несколько часов до эксперимента доведите колонну SEC и PBS до комнатной температуры с последующей стабилизацией колонны в вертикальном положении с помощью стандартной лабораторной подставки и держателя. Перед подключением к колонне SEC гидратируйте резервуар для образцов, позволяя пяти миллилитрам PBS течь через фрит в контейнер для отходов.Затем открутите впускную крышку колонны, чтобы добавить два миллилитра PBS в резервуар для проб и осторожно подключите резервуар к колонне, когда PBS капает через фрит. Для уравновешивания колонны добавьте 47 миллилитров PBS в резервуар для проб с последующим снятием нижней части колонны SEC. Затем позвольте всему загруженному буферу образцов пройти через столбец и отбросьте сквозной поток.После загрузки двух миллилитров образца в резервуар для проб дайте образцу полностью войти в колонну и собрать проходной поток. Немедленно добавьте PBS в резервуар для образцов в объеме 14,25 миллилитра за вычетом объема образца, чтобы раствор протекал через колонну, отбрасывая при этом количество, равное объему пустоты колонны. Затем поместите двухмиллилитровую низкосвязанную микротрубку непосредственно под колонкой SEC, чтобы собрать первый сквозной или дробный, позволив двум миллилитрам PBS пройти через колонну.Продолжайте добавлять два миллилитра PBS в резервуар для отбора проб для сбора каждой последующей фракции. Храните собранные фракции при четырех градусах Цельсия для краткосрочного хранения или минус 80 градусов Цельсия для длительного хранения. Для проверки стерильности собранных фракций EV прививают три миллилитра питательной среды 100 микролитрами фракций, которые будут использоваться в анализах.Затем культивируют среду в оптимальных условиях, соблюдая мутность в течение не менее трех дней. Альтернативно, образцы фракций могут быть нанесены на агаровые пластины, содержащие среду, используемую для выращивания продуцирующих бактерий, а затем проверить образование колоний. Затем храните EV, передавая от 25 до 50% отдельных или объединенных фракций в трубки с низким содержанием белка при минус 80 градусах Цельсия, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания.Репрезентативный анализ показывает элюирование Escherichia coli MP1 EV в ранних фракциях хроматографии. Фракции от одного до шести содержали наибольшее количество электромобилей со средним диаметром ниже 100 нанометров. В то же время последующие фракции содержали белки без EV и очень мало EV.Обогащение и размер EV были подтверждены просвечивающей электронной микроскопией, особенно в фракциях от двух до шести. Было отмечено, что обогащенные EV фракции от двух до семи обладают высокой активностью нанолюциферазы, но только очень низким флуоресцентным сигналом от не-EV-ассоциированного mCherry по сравнению с более поздними фракциями. Маркировка иммунозолотого подтвердила EV-ассоциацию нанолюциферазы во фракциях от двух до пяти.Применимость протокола к другим видам бактерий оценивали путем выделения EV из культур различных анаэробных бактерий. Было отмечено, что ранние фракции хроматографии от одного до четырех были обогащены для электромобилей с размером диаметра менее 100 нанометров. Комплексная инфузия мозга и сердца, или BHI, содержала частицы ev-размера менее 25% от общего выхода EV.Важно использовать устройства TFF, способные обрабатывать начальный объем культуры бактериальных клеток. Этот метод позволяет нам генерировать достаточное количество электромобилей, чтобы задавать биологические вопросы об их функции в сложных животных моделях.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Высокопроизводительного скрининга грибной активность в эндоглюканазы Кишечной палочки</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Выделение и очистка от кинезин Drosophila Эмбрионы

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Определение белковых комплексов в<em&gt; Кишечной палочки</em&gt; С помощью последовательного аффинной очистки пептидов в сочетании с тандемной масс-спектрометрии

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Быстрое Протокол по подготовке Электрокомпетентные<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; И<em&gt; Холерный вибрион</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Номера хроматографической очистки рекомбинантного Эластин-подобных полипептидов и их слияний с пептидов и белков с<em&gt; Кишечная палочка</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Быстрой, масштабируемый способ выделения, функционального исследования и анализа клеточного происхождения внеклеточной матрицы

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Выделение микроРНК из клещей Ex vivo Культуры слюнных желез и внеклеточных везикул

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...