Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
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La investigación descrita anteriormente fue apoyada por la subvención de capacitación NIH TL1 TR002549-03. Agradecemos a los doctores John C. Tilton y Zachary Troyer (Case Western Reserve University) por facilitar el acceso al instrumento analizador de tamaño de partículas; Lew Brown (Spectradyne) por su asistencia técnica con el análisis de los datos de distribución del tamaño de partícula; el Dr. David Putnam de la Universidad de Cornell por proporcionar el plásmido14 pClyA-GFP; y el Dr. Mark Goulian de la Universidad de Pensilvania por proporcionarnos la E. coli MP113.

NOTA: Asegúrese de que todo el trabajo que involucre bacterias y ADN recombinante siga las mejores prácticas para la contención de bioseguridad apropiadas para el nivel de peligro de bioseguridad de cada cepa. El trabajo debe realizarse de acuerdo con las normas locales, nacionales e internacionales de seguridad de la biotecnología.
1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo
NOTA: Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio fueron Esch...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

En el protocolo anterior, se describe un método que es escalable y aísla de manera confiable los EV de varias bacterias gramnegativas / positivas y aeróbicas / anaeróbicas. Tiene varios puntos de parada potenciales a lo largo del procedimiento, aunque es mejor evitar tomar más de 48 h para aislar los EV de los medios de cultivo bacteriano condicionados.
En primer lugar, consiste en cultivar bacterias para generar un medio de cultivo bacteriano condicionado. Se encontró que aumentar el ti...

Las vesículas extracelulares (EV) son estructuras similares a liposomas de tamaño nanométrico compuestas de lípidos, proteínas, glicanos y ácidos nucleicos, secretados por células procariotas y eucariotas1. Desde los primeros estudios que visualizan la liberación de EV de bacterias gramnegativas2, el número de funciones biológicas atribuidas a las EV bacterianas (20-300 nm de diámetro) ha estado creciendo constantemente en las últimas décadas. Sus funciones incluyen la transferencia de resistencia a los antibióticos3, la formación de biopelículas4, la detección de quórum5 y la administración de toxinas6. También hay un creciente interés en el uso de EV bacterianas como terapéutica, especialmente en vacunología7 y terapia contra el cáncer8.
A pesar del creciente interés en la investigación de vehículos eléctricos, todavía existen desafíos técnicos con respecto a los métodos de aislamiento. Específicamente, existe la necesidad de métodos de aislamiento que sean reproducibles, escalables y compatibles con diversos organismos productores de EV. Para crear un conjunto unificado de principios para planificar y reportar el aislamiento de EV y los métodos de investigación, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares publica y actualiza el documento de posición MISEV9. Además, el consorcio EV-TRACK proporciona una plataforma abierta para informar metodologías detalladas para el aislamiento de EV utilizadas en manuscritos publicados para mejorar la transparencia10.
En este protocolo, se adaptaron metodologías previas utilizadas para el aislamiento de EVs a partir de cultivos celulares de mamíferos11,12 para permitir el aislamiento de EVs a partir de cultivo celular bacteriano. Buscamos emplear métodos que permitan el aislamiento de EV de una variedad de microbios, que pueden ser escalables, y equilibrar la pureza y el rendimiento de EV (como se discutió en el documento de posición9 de MISEV). Después de eliminar las células bacterianas y los desechos por centrifugación y filtración, el medio de cultivo se concentra mediante ultrafiltración del dispositivo centrífugo (para un volumen de hasta ~ 100 ml) o TFF accionado por bomba (para volúmenes más grandes). Los vehículos eléctricos son aislados por SEC utilizando columnas optimizadas para la purificación de pequeños vehículos eléctricos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del esquema del flujo de trabajo de aislamiento de EV bacteriano. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; TFF = filtración de flujo tangencial; SEC = cromatografía de exclusión de tamaño; MWCO = corte de peso molecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Una cepa comensal de ratón de Escherichia coli (es decir, E. coli MP113) fue utilizada como organismo modelo y modificada para expresar nanoluciferasa asociada a EV por fusión a citolisina A, como se informó anteriormente14. Los métodos utilizados aquí pueden procesar al menos hasta varios litros de cultivos bacterianos y separar eficazmente las proteínas asociadas a EV de las no asociadas a EV. Finalmente, este método también se puede utilizar para otras especies bacterianas grampositivas y gramnegativas. Todos los datos relevantes de los experimentos reportados se enviaron a la base de conocimiento EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Diversas especies bacterianas secretan ~20-300 nm vesículas extracelulares (EV), compuestas de lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, glicanos y otras moléculas derivadas de las células parentales. Los EV funcionan como vectores de comunicación dentro y entre especies, al tiempo que contribuyen a la interacción entre bacterias y organismos huéspedes en el contexto de la infección y la colonización. Dada la multitud de funciones atribuidas a los EV en la salud y la enfermedad, existe un creciente interés en aislar los EV para estudios in vitro e in vivo . Se planteó la hipótesis de que la separación de EV basada en propiedades físicas, es decir, tamaño, facilitaría el aislamiento de vesículas de diversos cultivos bacterianos. 
El flujo de trabajo de aislamiento consiste en centrifugación, filtración, ultrafiltración y cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para el aislamiento de EV de cultivos bacterianos. Se incorporó un paso de filtración de flujo tangencial (TFF) impulsado por bomba para mejorar la escalabilidad, lo que permite el aislamiento del material de los litros de cultivo celular inicial. Escherichia coli se utilizó como un sistema modelo que expresa nanoluciferasa asociada a EV y mCherry no asociada a EV como proteínas reporteras. La nanoluciferasa se dirigió a los EV fusionando su N-terminal con citolisina A. Las fracciones de cromatografía tempranas que contenían EV de 20-100 nm con citolisina A - nanoLuc asociadas eran distintas de las fracciones posteriores que contenían las proteínas libres. La presencia de nanoluciferasa asociada a EV se confirmó mediante etiquetado de inmunooro y microscopía electrónica de transmisión. Este flujo de trabajo de aislamiento EV es aplicable a otras especies bacterianas gramnegativas y grampositivas asociadas al intestino humano. En conclusión, la combinación de centrifugación, filtración, ultrafiltración / TFF y SEC permite el aislamiento escalable de EV de diversas especies bacterianas. El empleo de un flujo de trabajo de aislamiento estandarizado facilitará los estudios comparativos de EV microbianos entre especies.

Para evaluar qué fracciones de cromatografía SEC se enriquecieron para EV, la columna SEC se cargó con 2 ml de medio de cultivo acondicionado con E. coli MP1 que había sido concentrado 1.000 veces por TFF, y se recolectaron fracciones secuenciales. Usando MRPS, se encontró que las fracciones 1-6 contenían la mayor cantidad de EV (Figura 2A). Las fracciones posteriores contenían muy pocos EVs, que comprendían proteínas libres de EV en lugar de EV (Figura...

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Las bacterias secretan vesículas extracelulares (EV) de tamaño nanométrico que transportan moléculas biológicas bioactivas. La investigación EV se centra en comprender su biogénesis, su papel en las interacciones y enfermedades microbio-microbio y huésped-microbio, así como sus posibles aplicaciones terapéuticas. Se presenta un flujo de trabajo para el aislamiento escalable de vehículos eléctricos de varias bacterias para facilitar la estandarización de la investigación de vehículos eléctricos.

Aislamiento escalable y purificación de vesículas extracelulares de Escherichia coli y otras bacterias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Este protocolo es importante porque proporciona una forma de aislar vesículas extracelulares de una variedad de bacterias de una manera altamente reproducible. Lo mejor de esta técnica es que se puede utilizar para aislar EV de entornos bastante grandes de cultivos bacterianos, lo que permitirá estudios in vivo. Si bien los datos que mostramos reflejan aplicaciones preclínicas, es previsible que este protocolo pueda adaptarse a la fabricación de EV bacterianas para terapia.Este método se puede aplicar a cualquier sistema de cultivo celular escalable con modificaciones menores. Debido a la escalabilidad del protocolo, es importante tener filtros y columnas SEC de tamaño adecuado para manejar los volúmenes iniciales deseados de cultivo celular bacteriano. Demostrando los procedimientos están Sadie Johnson, tecnóloga asistente en el laboratorio del Dr. Justin Lathia, Dionysius Watson, becario de oncología en el laboratorio del Dr. Justin Lathia, y Akeem Santos, un tecnólogo de investigación en mi laboratorio.Comience por inocular colonias individuales de Escherichia coli en 250 a 1000 mililitros de Luria-Bertani, o caldo LB, utilizando un bucle estéril. Luego, incubar el cultivo aeróbicamente en una incubadora de agitación a 300 rotaciones por minuto y 37 grados centígrados. Después de 48 horas de incubación, aclarar el medio de cultivo bacteriano transfiriendo los cultivos celulares para limpiar botellas de centrífuga de polipropileno de 500 mililitros para centrifugar en un rotor de ángulo fijo de gran capacidad a cuatro grados Celsius y 5, 000 veces G durante 15 minutos.Transfiera el sobrenadante a las botellas de centrífuga limpias vertiendo cuidadosamente a la centrífuga a 10, 000 veces G durante 15 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a un dispositivo de filtro accionado por vacío de polietersulfona de 0,2 micras de un tamaño adecuado y conecte el dispositivo de filtración a un suministro de pared de vacío. Si la tasa de filtración disminuye significativamente, mueva el material sin filtrar a un nuevo dispositivo.El medio filtrado se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante la noche o se puede procesar de inmediato. Para comprobar la eliminación completa de las células viables, esparcir una alícuota del sobrenadante filtrado en placas de agar adecuadas y garantizar la ausencia de colonias después de la incubación en condiciones óptimas para la cepa bacteriana. Para concentrar el medio filtrado con un volumen de 100 mililitros, cargue 90 mililitros de medio de cultivo filtrado en el depósito del dispositivo de ultrafiltración centrífuga con un corte de peso molecular de 100 kilodaltons y centrifugue el medio en rotor de cangilón oscilante a cuatro grados Celsius y 2, 000 veces G durante intervalos de 15 a 30 minutos hasta que el volumen del depósito superior se haya concentrado a menos de 0.5 mililitros.Para rellenar el depósito con cualquier medio de cultivo filtrado restante, retire el flujo en la parte inferior del dispositivo para reequilibrarlo. Si la viscosidad del medio concentrado en el depósito aumenta visiblemente, diluya el medio con PBS y vuelva a concentrar por centrifugación para reducir cualquier vesícula no extracelular, o proteínas EV, más pequeñas que el límite de peso molecular de 100 kilodaltons. Luego, transfiera el medio concentrado a un tubo de unión de baja proteína para almacenar a cuatro grados centígrados durante la noche Para concentrar el medio filtrado con un volumen superior a 100 mililitros, seleccione un dispositivo de filtración de flujo tangencial del tamaño adecuado, o TFF, con un límite de peso molecular de 100 kilodaltons.Después de ensamblar un circuito de filtración como se explica en el manuscrito, bombee 200 mililitros de PBS en un recipiente graduado para determinar la velocidad apropiada correspondiente al caudal deseado. Cuando se ajuste la velocidad, hacer circular el medio acondicionado filtrado a aproximadamente 200 mililitros por minuto a temperatura ambiente y recoger las moléculas menores de 100 kilodaltons, cruzando la membrana de ultrafiltración como residuo en un recipiente separado hasta que el volumen del medio acondicionado se haya reducido a 100 a 200 mililitros. Diluya secuencialmente el volumen filtrado dos veces con PBS y continúe circulando el medio con la bomba en recipientes más pequeños para concentrar el volumen a 75 a 100 mililitros, y luego a 25 mililitros y 10 mililitros.Levante el tubo de alimentación del depósito de muestras y bombee para purgar el filtro y recuperar la cantidad máxima de la muestra. Mueva la muestra concentrada a un dispositivo de ultrafiltración centrífuga de 15 mililitros con un límite de peso molecular de 100 kilodaltons y centrifugar en un rotor de cangilón oscilante a cuatro grados Celsius y 2, 000 veces G durante intervalos de 15 a 30 minutos hasta que el volumen del medio en el depósito superior sea inferior a dos mililitros. Transfiera el medio concentrado a un tubo de unión bajo en proteínas para almacenarlo a cuatro grados centígrados durante la noche.Para el aislamiento de los EV, realice cromatografía de exclusión de tamaño, o SEC, utilizando una columna pequeña con un volumen de lecho de 10 mililitros para menos de 100 mililitros de material de partida y una columna más grande con un volumen de lecho de 47 mililitros para más de 100 mililitros de material de partida. Durante varias horas antes del experimento, lleve la columna SEC y el PBS a temperatura ambiente, seguido de estabilizar la columna en posición vertical utilizando un soporte y soporte de laboratorio estándar. Antes de conectarse a la columna SEC, hidrate el depósito de muestra permitiendo que cinco mililitros de PBS fluyan a través de la frita hacia un contenedor de desechos.Luego, desenrosque la tapa de entrada de la columna para agregar dos mililitros de PBS al depósito de muestra y conecte cuidadosamente el depósito a la columna a medida que el PBS gotea a través de la frita. Para equilibrar la columna, agregue 47 mililitros de PBS al depósito de muestra, seguido de destapar la parte inferior de la columna SEC. A continuación, permita que todo el búfer de muestra cargado fluya a través de la columna y deseche el flujo.Después de cargar dos mililitros de la muestra en el depósito de muestra, permita que la muestra ingrese completamente a la columna y recoja el flujo. Agregue inmediatamente PBS al depósito de muestra a un volumen de 14.25 mililitros menos el volumen de muestra para permitir que la solución fluya a través de la columna, mientras descarta la cantidad igual al volumen vacío de la columna. A continuación, coloque un microtubo de baja unión de dos mililitros directamente debajo de la columna SEC para recoger el primer flujo o fracción uno después de permitir que dos mililitros de PBS pasen a través de la columna.Continúe agregando dos mililitros de PBS al depósito de muestra para recolectar cada fracción subsiguiente. Almacene las fracciones recolectadas a cuatro grados centígrados para el almacenamiento a corto plazo o menos 80 grados centígrados para el almacenamiento a largo plazo. Para la prueba de esterilidad de las fracciones recolectadas de EV, inocular tres mililitros del medio de cultivo con 100 microlitros de las fracciones que se utilizarán en los ensayos.Luego, cultive el medio en condiciones óptimas mientras observa la turbidez durante al menos tres días. Alternativamente, las muestras de fracción se pueden aplicar a placas de agar que contienen el medio utilizado para cultivar las bacterias productoras, luego verificar la formación de colonias. A continuación, almacene los EV transfiriendo del 25 al 50% de las fracciones individuales o agrupadas a tubos de unión de baja proteína a menos 80 grados centígrados para evitar ciclos de congelación y descongelación.El análisis representativo muestra la elución de Escherichia coli MP1 EVs en las fracciones cromatográficas tempranas. Las fracciones uno a seis contenían la mayor cantidad de EV, con un diámetro promedio inferior a 100 nanómetros. Al mismo tiempo, las fracciones posteriores contenían proteínas libres de EV y muy pocas EV.El enriquecimiento y el tamaño de EV se confirmaron mediante microscopía electrónica de transmisión, particularmente en las fracciones dos a seis. Se observó que las fracciones enriquecidas con EV dos a siete tenían una alta actividad de nanoluciferasa, pero solo una señal fluorescente muy baja de mCherry no asociada a EV en comparación con la de las fracciones posteriores. El etiquetado de inmunooro confirmó la asociación EV de la nanoluciferasa en las fracciones dos a cinco.La aplicabilidad del protocolo a las otras especies bacterianas se evaluó mediante el aislamiento de EV de los cultivos de diversas bacterias anaeróbicas. Se observó que las primeras fracciones cromatográficas uno a cuatro estaban enriquecidas para EVs, con un diámetro inferior a 100 nanómetros. La compleja infusión cerebro-corazón, o BHI, contenía las partículas del tamaño de EV a menos del 25% del rendimiento total de EV.Es importante utilizar dispositivos TFF capaces de manejar el volumen inicial del cultivo celular bacteriano. Esta técnica nos permite generar suficientes EVs para hacer preguntas biológicas sobre su función en modelos animales complejos.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

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Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Investigación

Biología

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

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Aislamiento y purificación de Kinesin desde Drosophila Los embriones

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

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Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

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La purificación no cromatográfico de polipéptidos recombinantes Elastina-como y sus fusiones con Péptidos y Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

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A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

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Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

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Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

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Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...