Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Forskningen som beskrivs ovan stöddes av NIH TL1 TR002549-03 utbildningsbidrag. Vi tackar Drs. John C. Tilton och Zachary Troyer (Case Western Reserve University) för att underlätta tillgången till partikelstorleksanalysatorinstrumentet; Lew Brown (Spectradyne) för tekniskt bistånd med analys av data om partikelstorleksfördelning; Dr David Putnam vid Cornell University för att tillhandahålla pClyA-GFP plasmid14; och Dr. Mark Goulian vid University of Pennsylvania för att förse oss med E. coli MP113.

OBS: Se till att allt arbete som involverar bakterier och rekombinant DNA följer bästa praxis för biosäkerhetsinneslutning som är lämplig för biosäkerhetsrisknivån för varje stam. Arbetet bör utföras i enlighet med lokala, nationella och internationella biosäkerhetsbestämmelser.
1. Bakteriestammar och odlingsförhållanden
OBS: Bakteriestammar som används i denna studie var Escherichia coli MP113, Ak...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

I protokollet ovan beskrivs en metod som är skalbar och på ett tillförlitligt sätt isolerar elbilar från olika gramnegativa/positiva och aeroba/anaeroba bakterier. Det har flera potentiella stopppunkter under hela proceduren, även om det är bättre att undvika att ta längre tid än 48 timmar att isolera elbilar från konditionerade bakterieodlingsmedier.
För det första består det av att odla bakterier för att generera konditionerat bakterieodlingsmedium. Det visade sig att öka odl...

Extracellulära vesiklar (EV) är nanometerstora, liposomliknande strukturer som består av lipider, proteiner, glykaner och nukleinsyror, utsöndrade av både prokaryota och eukaryota celler1. Sedan de tidiga studierna som visualiserar frisättningen av elbilar från gramnegativa bakterier2 har antalet biologiska funktioner som tillskrivs bakteriella elbilar (20-300 nm i diameter) ständigt ökat under de senaste decennierna. Deras funktioner inkluderar överföring av antibiotikaresistens3, biofilmbildning4, kvorumavkänning5 och toxinleverans6. Det finns också ett växande intresse för användningen av bakteriella elbilar som terapier, särskilt inom vaccinologi7 och cancerterapi8.
Trots det växande intresset för EV-forskning finns det fortfarande tekniska utmaningar när det gäller metoder för isolering. Specifikt finns det ett behov av isoleringsmetoder som är reproducerbara, skalbara och kompatibla med olika EV-producerande organismer. För att skapa en enhetlig uppsättning principer för planering och rapportering av EV-isolering och forskningsmetoder publicerar och uppdaterar International Society for Extracellular Vesicles MISEV-positionsdokumentet9. Dessutom tillhandahåller EV-TRACK-konsortiet en öppen plattform för rapportering av detaljerade metoder för ev-isolering som används i publicerade manuskript för att förbättra transparensen10.
I detta protokoll anpassades tidigare metoder som användes för isolering av elbilar från däggdjurscellodling11,12 för att möjliggöra isolering av elbilar från bakteriell cellodling. Vi försökte använda metoder som möjliggör EV-isolering från en mängd olika mikrober, som kan vara skalbara, och balansera EV-renhet och utbyte (som diskuteras i MISEV-positionsdokumentet9). Efter avlägsnande av bakterieceller och skräp genom centrifugering och filtrering koncentreras odlingsmediet antingen genom centrifugalanordningens ultrafiltrering (för en volym på upp till ~ 100 ml) eller pumpdriven TFF (för större volymer). Elbilar isoleras sedan av SEC med hjälp av kolumner optimerade för rening av små elbilar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk översikt över arbetsflödet för bakteriell EV-isolering. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; TFF = tangentiell flödesfiltrering; SEC = storlek uteslutning kromatografi; MWCO = molekylviktsavgränsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
En muskommensal stam av Escherichia coli (dvs. E. coli MP113) användes som modellorganism och modifierades för att uttrycka EV-associerat nanoluciferas genom fusion till cytolysin A, som tidigare rapporterats14. Metoderna som används här kan bearbeta åtminstone upp till flera liter bakteriekulturer och effektivt separera EV-associerade från icke-EV-associerade proteiner. Slutligen kan denna metod också användas för andra grampositiva och gramnegativa bakteriearter. Alla relevanta data från de rapporterade experimenten skickades till EV-TRACK:s kunskapsbas (EV-TRACK ID: EV210211)10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Olika bakteriearter utsöndrar ~ 20-300 nm extracellulära vesiklar (EV), bestående av lipider, proteiner, nukleinsyror, glykaner och andra molekyler härledda från föräldracellerna. Elbilar fungerar som kommunikationsvektorer inom och mellan arter samtidigt som de bidrar till interaktionen mellan bakterier och värdorganismer i samband med infektion och kolonisering. Med tanke på de många funktioner som tillskrivs elbilar inom hälsa och sjukdom finns det ett växande intresse för att isolera elbilar för in vitro - och in vivo-studier . Det antogs att separationen av elbilar baserat på fysikaliska egenskaper, nämligen storlek, skulle underlätta isoleringen av vesiklar från olika bakteriekulturer. 
Isoleringsarbetsflödet består av centrifugering, filtrering, ultrafiltrering och storleksuteslutningskromatografi (SEC) för isolering av elbilar från bakteriekulturer. Ett pumpdrivet tangentiellt flödesfiltreringssteg (TFF) införlivades för att förbättra skalbarheten, vilket möjliggör isolering av material från liter startcellodling. Escherichia coli användes som ett modellsystem som uttrycker EV-associerat nanoluciferas och icke-EV-associerat mCherry som reporterproteiner. Nanoluciferaset riktades mot elbilarna genom att smälta samman dess N-ändstation med cytolysin A. Tidiga kromatografifraktioner innehållande 20-100 nm elbilar med associerat cytolysin A-nanoLuc skilde sig från de senare fraktionerna innehållande de fria proteinerna. Förekomsten av EV-associerat nanoluciferas bekräftades genom immunogoldmärkning och transmissionselektronmikroskopi. Detta EV-isoleringsarbetsflöde är tillämpligt på andra mänskliga tarmassocierade gramnegativa och grampositiva bakteriearter. Sammanfattningsvis, genom att kombinera centrifugering, filtrering, ultrafiltrering / TFF och SEC möjliggör skalbar isolering av elbilar från olika bakteriearter. Att använda ett standardiserat isoleringsarbetsflöde kommer att underlätta jämförande studier av mikrobiella elbilar över arter.

För att bedöma vilka SEC-kromatografifraktioner som anrikades för elbilar laddades SEC-kolonnen med 2 ml E. coli MP1-konditionerat odlingsmedium som hade koncentrerats 1 000 gånger av TFF och sekventiella fraktioner samlades in. Med hjälp av MRPS visade det sig att fraktionerna 1-6 innehöll flest elbilar (figur 2A). Efterföljande fraktioner innehöll mycket få elbilar, som i stället bestod av EV-fria proteiner (figur 2B). Elbilar var främst <1...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bakterier utsöndrar nanometerstora extracellulära vesiklar (EV) som bär bioaktiva biologiska molekyler. EV-forskning fokuserar på att förstå deras biogenes, roll i mikrob-mikrob- och värd-mikrobinteraktioner och sjukdomar, liksom deras potentiella terapeutiska tillämpningar. Ett arbetsflöde för skalbar isolering av elbilar från olika bakterier presenteras för att underlätta standardisering av EV-forskning.

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det ger ett sätt att isolera extracellulära vesiklar från en mängd olika bakterier på ett mycket reproducerbart sätt. Det fantastiska med denna teknik är att den kan användas för att isolera elbilar från ganska stora miljöer av bakteriekulturer, vilket möjliggör in vivo-studier. Även om de data vi visar återspeglar prekliniska tillämpningar, är det förutsägbart att detta protokoll kan anpassas för att tillverka bakteriella elbilar för terapier.Denna metod kan tillämpas på alla skalbara cellodlingssystem med mindre modifiering. På grund av protokollets skalbarhet är det viktigt att ha filter och SEC-kolumner av lämplig storlek för att hantera önskade startvolymer för bakteriecellodling. Demonstrerar procedurerna är Sadie Johnson, en biträdande tekniker i Dr.Justin Lathias laboratorium, Dionysius Watson, en onkologistipendiat i Dr.Justin Lathias laboratorium och Akeem Santos, en forskningsteknolog i mitt laboratorium.Börja med att ympa enstaka kolonier av Escherichia coli i 250 till 1000 ml Luria-Bertani, eller LB-buljong, med en steril slinga. Inkubera sedan kulturen aerobt i en skakande inkubator vid 300 rotationer per minut och 37 grader Celsius. Efter 48 timmars inkubation klargör bakterieodlingsmediet genom att överföra cellkulturerna för att rengöra 500-milliliter polypropencentrifugflaskor för att centrifugera i en rotor med stor kapacitet med fast vinkel vid fyra grader Celsius och 5 000 gånger G i 15 minuter.Överför supernatanten till rena centrifugflaskor genom att försiktigt hälla för att centrifugera vid 10 000 gånger G i 15 minuter. Överför sedan supernatanten till en 0,2 mikron polyetersulfon vakuumdriven filteranordning av lämplig storlek och anslut filtreringsanordningen till en vakuumväggförsörjning. Om filtreringshastigheten sjunker avsevärt, flytta det ofiltrerade materialet till en ny enhet.Det filtrerade mediet kan lagras vid fyra grader Celsius över natten eller kan bearbetas ytterligare omedelbart. För att kontrollera fullständigt avlägsnande av de livskraftiga cellerna, sprida en alikvot av den filtrerade supernatanten på lämpliga agarplattor och säkerställa frånvaron av kolonier efter inkubation vid optimala förhållanden för bakteriestammen. För att koncentrera det filtrerade mediet med en volym av 100 ml, ladda 90 ml filtrerat odlingsmedium på behållaren för centrifugal ultrafiltreringsanordning med en 100 kilodalton molekylviktsavskärning och centrifugera mediet i svängande skoprotor vid fyra grader Celsius och 2 000 gånger G i 15 till 30 minuters intervall tills volymen av den övre behållaren har koncentrerats till mindre än 0,5 ml.För att fylla på behållaren med eventuellt återstående filtrerat odlingsmedium, ta bort genomströmningen i botten av enheten för att balansera om. Om viskositeten hos det koncentrerade mediet i behållaren ökar synligt, späd mediet med PBS och koncentrera igen genom centrifugering för att minska eventuella icke-extracellulära vesikel- eller EV-proteiner, mindre än molekylviktsavgränsningen på 100 kilodalton. Överför sedan det koncentrerade mediet till ett lågproteinbindande rör för att lagra vid fyra grader Celsius över natten För att koncentrera det filtrerade mediet med en volym större än 100 ml, välj en tangentiell flödesfiltrering av lämplig storlek, eller TFF-enhet, med en molekylviktsavgränsning på 100 kilodalton.Efter montering av en filtreringskrets som förklaras i manuskriptet, pumpa 200 ml PBS i ett graderat kärl för att bestämma lämplig hastighet som motsvarar önskad flödeshastighet. När hastigheten är inställd, cirkulera det filtrerade konditionerade mediet vid cirka 200 ml per minut vid rumstemperatur och samla molekylerna mindre än 100 kilodalton, korsa ultrafiltreringsmembranet som avfall i ett separat kärl tills volymen av det konditionerade mediet har reducerats till 100 till 200 ml. Späd sekventiellt den filtrerade volymen tvåfaldigt med PBS och fortsätt cirkulera mediet med pumpen i mindre kärl för att koncentrera volymen till 75 till 100 ml och sedan till 25 ml och 10 ml.Lyft ut matningsslangen ur provbehållaren och pumpa för att rensa filtret för att återvinna den maximala mängden prov. Flytta det koncentrerade provet till en 15-milliliter centrifugal ultrafiltreringsanordning med molekylviktsavskärning på 100 kilodalton och centrifugera i en svängande hinkrotor vid fyra grader Celsius och 2 000 gånger G i 15 till 30 minuters intervall tills volymen av mediet i toppbehållaren är mindre än två milliliter. Överför det koncentrerade mediet till ett lågproteinbindande rör för att lagra vid fyra grader Celsius över natten.För isolering av elbilarna, utför storleksuteslutningskromatografi, eller SEC, med användning av en liten kolonn med en 10-milliliter bäddvolym för mindre än 100 ml utgångsmaterial och en större kolonn med en 47-milliliter bäddvolym för mer än 100 ml utgångsmaterial. Under flera timmar före experimentet, ta SEC-kolonnen och PBS till rumstemperatur, följt av att stabilisera kolonnen i vertikalt läge med hjälp av ett standardlaboratoriumstativ och hållare. Innan du ansluter till SEC-kolonnen, hydrera provbehållaren genom att låta fem milliliter PBS strömma genom friten i en avfallsbehållare.Skruva sedan loss inloppslocket på kolonnen för att lägga till två milliliter PBS i provbehållaren och anslut försiktigt behållaren till kolonnen när PBS droppar ut genom friten. För jämvikt i kolonnen, tillsätt 47 ml PBS till provbehållaren, följt av att ta bort botten av SEC-kolumnen. Låt sedan all laddad provbuffert flöda genom kolumnen och ignorera genomströmningen.Efter att ha laddat två milliliter av provet på provbehållaren, låt provet komma in i kolonnen helt och samla upp genomströmningen. Tillsätt omedelbart PBS till provbehållaren med en volym av 14,25 ml minus provvolymen så att lösningen kan strömma genom kolonnen, medan du kasserar den mängd som är lika med kolonnens tomrumsvolym. Placera sedan ett två-milliliter lågbindande mikrorör direkt under SEC-kolonnen för att samla in den första genomströmningen eller fraktionen efter att ha låtit två milliliter PBS rinna genom kolonnen.Fortsätt att tillsätta två milliliter PBS till provbehållaren för att samla upp varje efterföljande fraktion. Förvara de uppsamlade fraktionerna vid fyra grader Celsius för kortvarig lagring eller minus 80 grader Celsius för långvarig lagring. För sterilitetstestning av de uppsamlade fraktionerna av elbilar, inokulera tre milliliter av odlingsmediet med 100 mikroliter av fraktionerna som ska användas i analyser.Odla sedan mediet under optimala förhållanden medan du observerar grumlighet i minst tre dagar. Alternativt kan fraktionsproverna appliceras på agarplattor som innehåller mediet som används för att odla de producerande bakterierna och sedan kontrollera om det finns kolonibildning. Lagra sedan elbilarna genom att överföra 25 till 50% av de enskilda eller poolade fraktionerna till lågproteinbindande rör vid minus 80 grader Celsius för att undvika frys-tina cykler.Den representativa analysen visar elueringen av Escherichia coli MP1 elbilar i de tidiga kromatografifraktionerna. Fraktionerna ett till sex innehöll flest elbilar, med en medeldiameter lägre än 100 nanometer. Samtidigt innehöll de efterföljande fraktionerna EV-fria proteiner och mycket få elbilar.EV-anrikningen och storleken bekräftades genom transmissionselektronmikroskopi, särskilt i fraktionerna två till sex. Det observerades att EV-berikade fraktioner två till sju hade hög nanoluciferasaktivitet, men endast en mycket låg fluorescerande signal från icke-EV-associerad mCherry jämfört med den för de senare fraktionerna. Immunogold-märkningen bekräftade EV-föreningen av nanoluciferas i fraktionerna två till fem.Protokollets tillämplighet på de andra bakteriearterna bedömdes genom att isolera elbilar från kulturerna av olika anaeroba bakterier. Det observerades att de tidiga kromatografifraktionerna en till fyra berikades för elbilar, med en diameterstorlek lägre än 100 nanometer. Den komplexa hjärn-hjärtinfusionen, eller BHI, innehöll partiklar i EV-storlek på mindre än 25% av det totala EV-utbytet.Det är viktigt att använda TFF-enheter som kan hantera startvolymen för bakteriecellkulturen. Denna teknik gör att vi kan generera tillräckligt med elbilar för att ställa biologiska frågor om deras funktion i komplexa djurmodeller.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Hög throughput screening av svamp Endoglucanase aktivitet i Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolering och rening av kinesin från Drosophila Embryon

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifiering av proteinkomplex i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hjälp Sekventiell rening peptid affinitet i kombination med tandem masspektrometri

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Snabb Protokoll för Beredning av elektro<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Och<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Icke-kromatografisk rening av rekombinant Elastin liknande polypeptider och deras fusioner med peptider och proteiner från<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

En snabb, skalbar metod för isolering, Funktionella studie och analys av Cell-derived Extracellulär Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Isolering och karakterisering av cyanobakteriella extracellulära vesiklar

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolering av mikroRNA från Tick Ex Vivo spottkörtelkulturer och extracellulära vesiklar

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...