Name: scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Yukarıda açıklanan araştırma NIH TL1 TR002549-03 eğitim desteği ile desteklenmiştir. Dr. John C. Tilton ve Zachary Troyer'e (Case Western Reserve University) partikül boyutu analizörü cihazına erişimi kolaylaştırdıkları için teşekkür ederiz; Lew Brown (Spectradyne), partikül boyutu dağılım verilerinin analizinde teknik yardım için; Cornell Üniversitesi'nden Dr. David Putnam, pClyA-GFP plazmid14'ü sağladığı için; ve bize E. coli MP113'ü sağladığı için Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. Mark Goulian.

NOT: Bakteri ve rekombinant DNA içeren tüm çalışmaların, her suşun biyogüvenlik tehlike seviyesine uygun biyogüvenlik muhafazası için en iyi uygulamaları takip ettiğinden emin olun. Çalışmalar yerel, ulusal ve uluslararası biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yapılmalıdır.
1. Bakteri suşları ve kültürleme koşulları
NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları Escherichia coli MP113</sup...

<ol>
	<li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae.">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li><li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa.">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li><li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation.">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197 (2009).</li><li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote.">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li><li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin.">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li><li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand:+a+retrospective+case-control+study.">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li><li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response.">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles.">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li><li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable,+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15/lactadherin+complexes.">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).</li><li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts.">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li><li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li><li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content.">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).</li></ol>

Yukarıdaki protokolde, ölçeklenebilir ve EV'leri çeşitli gram-negatif / pozitif ve aerobik / anaerobik bakterilerden güvenilir bir şekilde izole eden bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür boyunca birkaç potansiyel durma noktasına sahiptir, ancak EV'leri şartlandırılmış bakteri kültürü ortamından izole etmek için 48 saatten daha uzun sürmekten kaçınmak daha iyidir.
İlk olarak, şartlandırılmış bakteri kültürü ortamı oluşturmak için bakteri kültürlemesinden...

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler tarafından salgılanan lipitler, proteinler, glikanlar ve nükleik asitlerden oluşan nanometre boyutunda, lipozom benzeri yapılardır1. EV'lerin gram-negatif bakterilerden salınımını görselleştiren ilk çalışmalardan bu yana, bakteriyel EV'lere (çapı 20-300 nm) atfedilen biyolojik fonksiyonların sayısı son yıllarda sürekli artmaktadır. İşlevleri arasında antibiyotik direncinin aktarılması3, biyofilm oluşumu4, çekirdek algılama5 ve toksin dağıtımı6 bulunur. Bakteriyel EV'lerin terapötik olarak kullanılmasına, özellikle aşıbilimi 7 ve kanser tedavisi8'de artan bir ilgi vardır.
EV araştırmalarına artan ilgiye rağmen, izolasyon yöntemleriyle ilgili hala teknik zorluklar var. Spesifik olarak, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve çeşitli EV üreten organizmalarla uyumlu izolasyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. EV izolasyonu ve araştırma yöntemlerini planlamak ve raporlamak için birleşik bir ilkeler kümesi oluşturmak için, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği, MISEV pozisyon makalesi9'u yayınlar ve günceller. Ayrıca, EV-TRACK konsorsiyumu, şeffaflığı artırmak için yayınlanan makalelerde kullanılan EV izolasyonu için ayrıntılı metodolojileri raporlamak için açık bir platform sağlar10.
Bu protokolde, EV'lerin memeli hücre kültüründen izolasyonu için kullanılan önceki metodolojiler, EV'lerin bakteriyel hücre kültüründen izole edilmesini sağlamak için 11,12 uyarlanmıştır. Ölçeklenebilir olabilen çeşitli mikroplardan EV izolasyonunu sağlayan ve EV saflığını ve verimini dengeleyen yöntemler kullanmaya çalıştık (MISEV pozisyon kağıdı9'da tartışıldığı gibi). Santrifüjleme ve filtreleme yoluyla bakteri hücrelerini ve kalıntıları temizledikten sonra, kültür ortamı ya santrifüj cihazı ultrafiltrasyonu (~ 100 mL'ye kadar bir hacim için) veya pompa tahrikli TFF (daha büyük hacimler için) ile konsantre edilir. EV'ler daha sonra küçük EV'lerin saflaştırılması için optimize edilmiş sütunlar kullanılarak SEC tarafından izole edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Şekil 1: Bakteriyel EV izolasyonu iş akışı şemasına genel bakış. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; TFF = teğetsel akış filtrasyonu; SEC = boyut dışlama kromatografisi; MWCO = moleküler ağırlık kesme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Escherichiacoli'nin bir fare-kommensal suşu (yani, E. coli MP113) model bir organizma olarak kullanılmış ve daha önce bildirildiği gibi sitolisin A'ya füzyon yoluyla EV-ilişkili nanolusiferazı eksprese etmek için modifiye edilmiştir14. Burada kullanılan yöntemler, en az birkaç litreye kadar bakteri kültürünü işleyebilir ve EV ile ilişkili olmayan proteinleri etkili bir şekilde ayırabilir. Son olarak, bu yöntem diğer gram-pozitif ve gram-negatif bakteri türleri için de kullanılabilir. Bildirilen deneylerin ilgili tüm verileri EV-TRACK bilgi tabanına (EV-TRACK ID: EV210211)10 sunulmuştur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3430</td>
			<td>it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>15700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>392077</td>
			<td>Allows Vivacell to fit in rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akkermansia mucinophila</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>BAA-835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-20 XPI centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>29148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium breve</td>
			<td>NCIMB</td>
			<td>B8807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bifidobacterium dentium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>27678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart infusion (BHI) broth</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>M2101</td>
			<td>After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 &#181;g/L), hematin (1.2 &#181;g/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-300 microfluidics cartridge</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>ICN19032105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)</td>
			<td>Takara</td>
			<td>636763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli MP1</td>
			<td>Dr. Mark Goulian (gift)</td>
			<td></td>
			<td>commensal bacteria derived from mouse gut</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>010-0151-05</td>
			<td>used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>F12-6x500-LEX</td>
			<td>fits 6 x 500 mL bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>FCF-400-CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematin</td>
			<td>ChemCruz</td>
			<td>207729B</td>
			<td>Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as&#160; 1.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M Nano+ Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>This equibment was used to measure the mCherry fluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion&#160; HD Cloning Plus</td>
			<td>Takara</td>
			<td>638909</td>
			<td>For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>368690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauria Bertani (LB) broth, Miller</td>
			<td>Difco</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>2071-05</td>
			<td>It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-08</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8&#34; ID; 25/PK</td>
			<td>cole-parmer - special</td>
			<td>HV-30800-24</td>
			<td>connection adapters for filtration tubing circuit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-07555-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>EW-07514-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td>
			<td>Cole Palmer</td>
			<td>EW-06435-16</td>
			<td>low-binding/low-leaching tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione (Vitamin K3)</td>
			<td>MP</td>
			<td>102259</td>
			<td>Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td>
			<td>Repligen</td>
			<td>D04-E100-05-N</td>
			<td>TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Glo Luciferase Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1110</td>
			<td>This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nCS1 Viewer</td>
			<td>Spectradyne</td>
			<td></td>
			<td>Analysis software for particle size distribution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0482</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0492</td>
			<td>DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV original, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV rack</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>for use with the qEV-original SEC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qEV-2, 35 nm</td>
			<td>Izon</td>
			<td></td>
			<td>maximal loading volume of 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit protein assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Lynx 4000 centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75006580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S2GPU01RE 
			S2GPU02RE 
			S2GPU05RE</td>
			<td>One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivacell 100, 100,000 MWCO PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VC1042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>WHA68093002</td>
			<td>to filter MRPS diluent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable isolation and purification of extracellular vesicles from escherichia coli and other bacteria

Çeşitli bakteri türleri, lipitler, proteinler, nükleik asitler, glikanlar ve ebeveyn hücrelerden türetilen diğer moleküllerden oluşan ~ 20-300 nm hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılar. EV'ler, türler arası ve türler arası iletişim vektörleri olarak işlev görürken, aynı zamanda enfeksiyon ve kolonizasyon bağlamında bakteri ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşime katkıda bulunur. Sağlık ve hastalıkta EV'lere atfedilen çok sayıda fonksiyon göz önüne alındığında, EV'leri in vitro ve in vivo çalışmalar için izole etmeye yönelik artan bir ilgi vardır. EV'lerin fiziksel özelliklere, yani boyuta göre ayrılmasının, veziküllerin çeşitli bakteri kültürlerinden izolasyonunu kolaylaştıracağı varsayılmıştır. 
İzolasyon iş akışı, EV'lerin bakteri kültürlerinden izolasyonu için santrifüjleme, filtreleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisinden (SEC) oluşur. Ölçeklenebilirliği artırmak için pompa tahrikli teğetsel akış filtrasyonu (TFF) adımı dahil edildi ve malzemenin litre başlangıç hücresi kültüründen izole edilmesini sağladı. Escherichia coli , EV ile ilişkili nanolusiferaz ve EV ile ilişkili olmayan mCherry'yi muhabir proteinler olarak ifade eden bir model sistem olarak kullanılmıştır. Nanolusiferaz, N-terminusunu sitolisin A ile kaynaştırarak EV'lere hedeflendi. İlişkili sitolisin A - nanoLuc ile ilişkili 20-100 nm EV'ler içeren erken kromatografi fraksiyonları, serbest proteinleri içeren daha sonraki fraksiyonlardan farklıydı. EV ile ilişkili nanolusiferazın varlığı, immünogold etiketleme ve transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulandı. Bu EV izolasyon iş akışı, diğer insan bağırsağı ile ilişkili gram-negatif ve gram-pozitif bakteri türlerine uygulanabilir. Sonuç olarak, santrifüjleme, filtrasyon, ultrafiltrasyon / TFF ve SEC'nin birleştirilmesi, EV'lerin çeşitli bakteri türlerinden ölçeklenebilir izolasyonunu sağlar. Standartlaştırılmış bir izolasyon iş akışının kullanılması, türler arasında mikrobiyal EV'lerin karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştıracaktır.

EV'ler için hangi SEC kromatografi fraksiyonlarının zenginleştirildiğini değerlendirmek için, SEC kolonuna TFF tarafından 1.000 kat konsantre edilmiş 2 mL E. coli MP1 şartlandırılmış kültür ortamı yüklendi ve sıralı fraksiyonlar toplandı. MRPS kullanılarak, Fraksiyonlar 1-6'nın en fazla EV'yi içerdiği bulunmuştur (Şekil 2A). Sonraki fraksiyonlar, EV-içermeyen proteinler yerine çok az sayıda EV içeriyordu (Şekil 2B). EV'le...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria at JoVE.com

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Bu protokol önemlidir, çünkü hücre dışı vezikülleri çeşitli bakterilerden yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde izole etmenin bir yolunu sağlar. Bu teknikle ilgili en güzel şey, EV'leri in vivo çalışmalara olanak sağlayacak oldukça geniş bakteri kültürü ortamlarından izole etmek için kullanılabilmesidir. Gösterdiğimiz veriler klinik öncesi uygulamaları yansıtırken, bu protokolün terapötikler için bakteriyel EV'lerin üretimine uyarlanabileceği öngörülebilir.Bu yöntem, küçük değişikliklerle herhangi bir ölçeklenebilir hücre kültürü sistemine uygulanabilir. Protokol ölçeklenebilirliği nedeniyle, bakteri hücre kültürünün istenen başlangıç hacimlerini işlemek için uygun boyutta filtrelere ve SEC sütunlarına sahip olmak önemlidir. Prosedürleri gösterenler, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında yardımcı teknoloji uzmanı olan Sadie Johnson, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında onkoloji araştırmacısı olan Dionysius Watson ve laboratuvarımda bir araştırma teknolojisi uzmanı olan Akeem Santos.Tek bir Escherichia coli kolonisini, steril bir döngü kullanarak 250 ila 1000 mililitre Luria-Bertani veya LB suyuna aşılayarak başlayın. Daha sonra, kültürü dakikada 300 rotasyonda ve 37 santigrat derecede titreyen bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, 500 mililitrelik polipropilen santrifüj şişelerini temizlemek için hücre kültürlerini 15 dakika boyunca dört santigrat derece ve 5.000 kez G'de büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüje aktararak bakteri kültürü ortamını netleştirin.Süpernatantı temiz santrifüj şişelerine 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de dikkatlice dökerek aktarın. Daha sonra, süpernatantı uygun boyutta 0,2 mikronluk bir polietersülfon vakum tahrikli filtre cihazına aktarın ve filtreleme cihazını bir vakum duvarı beslemesine bağlayın. Filtreleme hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş malzemeyi yeni bir cihaza taşıyın.Filtrelenmiş ortam gece boyunca dört santigrat derecede saklanabilir veya hemen işlenebilir. Canlı hücrelerin tamamen çıkarılmasını kontrol etmek için, filtrelenmiş süpernatantın bir alikotunu uygun agar plakalarına yayın ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmamasını sağlayın. Filtrelenmiş ortamı 100 mililitre hacimle yoğunlaştırmak için, 90 mililitre filtrelenmiş kültür ortamını santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 100 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesimle yükleyin ve üst rezervuardaki hacim 0,5 mililitreden daha az yoğunlaşana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla sallanan kova rotorunda ortamı dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de santrifüj edin.Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurmak için, yeniden dengelemek üzere cihazın altındaki akışı kaldırın. Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa, ortamı PBS ile seyreltin ve 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesiminden daha küçük olan hücre dışı vezikülleri veya EV proteinlerini azaltmak için santrifüjleme yoluyla yeniden konsantre edin. Daha sonra, konsantre ortamı gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlama tüpüne aktarın Filtrelenmiş ortamı 100 mililitreden daha büyük bir hacimle yoğunlaştırmak için, 100 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimine sahip uygun boyutta bir teğetsel akış filtrasyonu veya TFF cihazı seçin.Makalede açıklandığı gibi bir filtreleme devresini monte ettikten sonra, istenen akış hızına karşılık gelen uygun hızı belirlemek için 200 mililitre PBS'yi dereceli bir kaba pompalayın. Hız ayarlandığında, filtrelenmiş şartlandırılmış ortamı oda sıcaklığında dakikada yaklaşık 200 mililitrede dolaştırın ve 100 kilodaltondan küçük molekülleri toplayın, ultrafiltrasyon membranını ayrı bir kapta atık olarak geçerek şartlandırılmış ortamın hacmi 100 ila 200 mililitreye düşürülene kadar. Filtrelenmiş hacmi PBS ile sırayla iki kat seyreltin ve hacmi 75 ila 100 mililitreye ve daha sonra 25 mililitre ve 10 mililitreye konsantre etmek için ortamı pompayla daha küçük kaplarda dolaştırmaya devam edin.Besleme borusunu numune haznesinden çıkarın ve maksimum numune miktarını geri kazanmak üzere filtreyi boşaltmak için pompalayın. Konsantre numuneyi, 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesimine sahip 15 mililitrelik bir santrifüj ultrafiltrasyon cihazına taşıyın ve üst rezervuardaki ortamın hacmi iki mililitreden az olana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj yapın. Konsantre ortamı, gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlayıcı tüpe aktarın.EV'lerin izolasyonu için, 100 mililitreden az başlangıç malzemesi için 10 mililitrelik yatak hacmine sahip küçük bir sütun ve 100 mililitreden fazla başlangıç malzemesi için 47 mililitrelik yatak hacmine sahip daha büyük bir sütun kullanarak boyut hariç tutma kromatografisi veya SEC gerçekleştirin. Deneyden birkaç saat önce, SEC kolonunu ve PBS'yi oda sıcaklığına getirin, ardından standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak sütunu dikey konumda stabilize edin. SEC kolonuna bağlanmadan önce, beş mililitre PBS'nin fritten bir atık kabına akmasına izin vererek numune haznesini nemlendirin.Ardından, numune haznesine iki mililitre PBS eklemek için kolonun giriş kapağını sökün ve PBS fritten damlarken rezervuarı dikkatlice kolona bağlayın. Kolonun dengelenmesi için, numune haznesine 47 mililitre PBS ekleyin, ardından SEC sütununun alt kısmını açın. Ardından, yüklenen tüm numune arabelleğinin sütundan akmasına izin verin ve akışı atın.Numunenin iki mililitresini numune rezervuarına yükledikten sonra, numunenin kolona tamamen girmesine izin verin ve akışı toplayın. PBS'yi derhal numune rezervuarına 14,25 mililitre eksi numune hacminde ekleyin, böylece çözeltinin kolondan akmasına izin verirken, kolon boşluk hacmine eşit miktarı atın. Daha sonra, iki mililitre PBS'nin sütundan geçmesine izin verdikten sonra ilk akışı veya fraksiyonu toplamak için iki mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrotüpü doğrudan SEC sütununun altına yerleştirin.Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına iki mililitre PBS eklemeye devam edin. Toplanan fraksiyonları kısa süreli depolama için dört santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede saklayın. EV'lerin toplanan fraksiyonlarının sterilite testi için, kültür ortamının üç mililitresini, tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 mikrolitresi ile aşılayın.Daha sonra, en az üç gün boyunca bulanıklığı gözlemlerken ortamı en uygun koşullar altında kültürleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örnekleri, üreten bakterileri büyütmek için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulanabilir, daha sonra koloni oluşumunu kontrol edebilir. Daha sonra, donma-çözülme döngülerini önlemek için bireysel veya havuzlanmış fraksiyonların% 25 ila% 50'sini eksi 80 santigrat derecede düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktararak EV'leri saklayın.Temsili analiz, erken kromatografi fraksiyonlarında Escherichia coli MP1 EV'lerin elüsyonunu göstermektedir. Bir ila altı fraksiyon, ortalama çapı 100 nanometreden düşük olan en fazla EV'yi içeriyordu. Aynı zamanda, sonraki fraksiyonlar EV-içermeyen proteinler ve çok az sayıda EV içeriyordu.EV zenginleştirmesi ve boyutu, özellikle iki ila altı fraksiyonda, iletim elektron mikroskobu ile doğrulandı. İki ila yedi EV-ile zenginleştirilmiş fraksiyonların yüksek nanolusiferaz aktivitesine sahip olduğu, ancak daha sonraki fraksiyonlarınkine kıyasla EV ile ilişkili olmayan mCherry'den sadece çok düşük bir floresan sinyaline sahip olduğu gözlenmiştir. İmmünogold etiketleme, nanolusiferazın EV ilişkisini iki ila beş fraksiyonda doğruladı.Protokolün diğer bakteri türlerine uygulanabilirliği, EV'lerin çeşitli anaerobik bakteri kültürlerinden izole edilmesiyle değerlendirildi. Bir ila dört arasındaki erken kromatografi fraksiyonlarının, çap boyutu 100 nanometreden daha düşük olan EV'ler için zenginleştirildiği gözlendi. Kompleks beyin-kalp infüzyonu veya BHI, toplam EV veriminin% 25'inden daha azında EV boyutlu parçacıkları içeriyordu.Bakteriyel hücre kültürünün başlangıç hacmini işleyebilen TFF cihazlarının kullanılması önemlidir. Bu teknik, karmaşık hayvan modellerindeki işlevleri hakkında biyolojik sorular sormak için yeterli EV üretmemizi sağlar.

Research

JoVE Journal

Biology

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Elektrokompetan Hazırlanması için hızlı Protokolü<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Ve<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

Hücre kaynaklı Ekstrasellüler Matrix A Hızlı, İzolasyon, Fonksiyonel Çalışmaları Ölçeklenebilir Yöntem ve Analiz

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

MikroRNA'ların Kene Ex Vivo Tükürük Bezi Kültürlerinden ve Hücre Dışı Veziküllerden İzolasyonu

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...