Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل باسكال وإيلانا مانتو. مجلس البحوث الأوروبي (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety) ؛ مجلس البحوث الطبية لمضيفات الطيران (FAMRI) ؛ أستاذية الصندوق الإسرائيلي لأبحاث السرطان (ICRF) ، BSF ، معهد هيلين ومارتن كيميل لأبحاث الخلايا الجذعية ، جائزة هيلين ومارتن كيميل للتحقيق المبتكر ؛ مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF)، مينيرفا، معهد شيرمان للكيمياء الطبية، مركز نيلا وليون بينوزيو للأمراض العصبية، مركز عائلة ديفيد وفيلا شيبيل لأبحاث الاضطرابات الوراثية، معهد كيكست العائلي لعلم الوراثة الطبية، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية للدكتور بيث روم-رايمر، مؤسسات إدموند دي روتشيلد، مؤسسة زانتكر الخيرية، مزرعة زفيا زيروني.

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لإرشادات حماية الحيوان الصادرة عن معهد وايزمان للعلوم والمعتمدة من قبل معهد وايزمان ذي الصلة IACUC (# 01390120-1 ، 01330120-2 ، 33520117-2). طلب من النساء الحوامل الأصحاء إعطاء موافقتهن المستنيرة على جمع الدم من الحبل السري، على النحو الذي وافقت عليه لجنة هلسنكي في م...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

يمكن لبروتوكول الاستزراع المقدم هنا الحفاظ على التطور السليم والمستمر لجنين الفئران خارج الرحم لمدة تصل إلى ستة أيام ، من E5.5 إلى E11. في السابق، كانت الأجنة في مراحل النمو هذه تتطور بشكل طبيعي في الثقافة فقط لفترات قصيرة (تصل إلى 48 ساعة)15. يعد اقتران وحدة تنظيم الغاز بحاضنة ...

وقد حد التطور داخل الرحم لجنين الثدييات من دراسة المراحل المبكرة من تطور ما بعد الزرع1,2. إن عدم إمكانية الوصول إلى الجنين النامي يعيق فهم العمليات التنموية الرئيسية التي تحدث بعد زرع الجنين في الرحم ، مثل إنشاء خطة جسم الحيوان ، أو مواصفات الطبقات الجرثومية ، أو تكوين الأنسجة والأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن الحجم الصغير جدا للجنين المبكر بعد الزرع يجعل من الصعب ملاحظته عن طريق التصوير داخل الجسم في الرحم قبل E103. إن عدم القدرة على مراقبة الأجنة الحية ومعالجتها في هذه المراحل قد حد من دراسة التكوين المبكر للأجنة بعد الزرع إلى لقطات أثناء النمو.
بروتوكولات الاستزراع المختبري لأجنة الثدييات قبل الزرع راسخة وموثوقة وتستخدم بانتظام4. ومع ذلك، فإن محاولات إنشاء أنظمة استزراع خارج الرحم قادرة على دعم نمو جنين الثدييات السليم بعد الزرع حققت نجاحا محدودا5. تم اقتراح مجموعة متنوعة من تقنيات الاستزراع لأكثر من قرن من الزمان ، وذلك أساسا عن طريق زراعة الأجنة في لوحات ثابتة تقليدية 6،7،8 أو زجاجات دوارة (مزارع الأسطوانة) 5،9،10. أثبتت هذه المنصات فائدتها في توسيع المعرفة حول تطور الثدييات بعد الزرع11،12 ، على الرغم من كونها غير فعالة للغاية لبقاء الجنين الطبيعي وتقتصر على فترات قصيرة. بدأت الأجنة في إظهار التخلف التنموي والشذوذ المورفولوجي في وقت مبكر من 24-48 ساعة بعد بدء الثقافة.
تقدم هذه الدراسة وصفا مفصلا لإعداد نظام زراعة الأجنة خارج الرحم الذي يسمح بالتطور المستمر من مرحلة ما قبل المعدة إلى مراحل التكوين العضوي المتقدمة على مدى ما يصل إلى ستة أيام من تطور ما بعد الزرع13. تصف هذه الورقة بروتوكول زراعة الأسطوانة المحسن الذي يدعم نمو أجنة E7.5 (الصفيحة العصبية ومرحلة طي الرأس) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (~ E11) والثقافة الموسعة من E5.5 / E6.5 من خلال الجمع بين الثقافة على لوحات ثابتة ومنصات زراعة الأسطوانة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

كانت طرق زراعة أجنة الثدييات بعد الزرع غير فعالة بشكل عام وتقتصر على فترات قصيرة بعد تشريح الرحم. تم تطوير منصات مؤخرا لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم القوية والمطولة للغاية من مراحل أسطوانة البيض حتى التكوين العضوي المتقدم. تتيح هذه المنصات التطور المناسب والأمين للأجنة قبل المعدة (E5.5) حتى مرحلة تكوين الأطراف الخلفية (E11). تزرع الأجنة المتأخرة في المعدة (E7.5) في زجاجات دوارة في هذه الإعدادات ، في حين أن الثقافة الموسعة من مراحل ما قبل المعدة (E5.5 أو E6.5) تتطلب مزيجا من مزارع الزجاجات الثابتة والدوارة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم الحساس لتركيز O2 و CO2 ، وضغط الغاز ، ومستويات الجلوكوز ، واستخدام وسط معين خارج الرحم أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين السليم. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لزراعة أجنة الفئران خارج الرحم الموسعة. تمثل القدرة على نمو أجنة الفئران الطبيعية خارج الرحم من المعدة إلى التكوين العضوي أداة قيمة لتوصيف تأثير الاضطرابات التجريبية المختلفة أثناء التطور الجنيني.

تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة للأجنة E7.5 (مرحلة أواخر المعدة) نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزراعة (الشكل 2 والجدول 1). قد تختلف كفاءة نمو الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار (الشكل...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

تسمح المنصة المحسنة لزراعة الأجنة بأكملها بالتطور المستمر والقوي خارج الرحم لأجنة الفئران بعد الزرع لمدة تصل إلى ستة أيام ، من مراحل ما قبل المعدة حتى التكوين العضوي المتقدم. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل الإجراء القياسي لزراعة الأجنة الناجحة باستخدام لوحات ثابتة وأنظمة زجاجات دوارة.

خارج الرحم زراعة أجنة الفئران من ما قبل المعدة إلى التكوين العضوي المتقدم

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

ستكون هذه الطريقة أساسية لفهم المعدة على طول التكوين في الثدييات. من خلال السماح بإجراء التجارب على الأجنة الحية خلال المراحل الجنينية التي كانت مخبأة منذ فترة طويلة داخل رحم الأم. يسمح ، ويستمر في النمو الفعال والمناسب لأجنة الفئران خارج الرحم لفترة طويلة تصل إلى 6 أيام.يعد تشريح الجنين السريع والكافي والمعالجة الأولية لتركيز الغاز وضغطه من أهم الخطوات لنمو الجنين بنجاح. لبدء زراعة أجنة الفئران التي يبلغ عمرها 7.5 يوم أو أكثر تقدما ، قم بتشغيل الدوار ووحدة التسخين لنظام حاضنة زراعة الأسطوانة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل تشريح الجنين. أيضا ، أضف ماء الأوتوكلاف إلى زجاجة مدخل الغاز وأنبوب اختبار المخرج.بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة تنظيم الغاز عن طريق الضغط على المفتاح الرئيسي ، ثم استخدم وحدات التحكم المعنية لضبط قيم الأكسجين وثاني أكسيد الكربون على 5٪ افتح منظم الغاز وحرك مفتاح الجهد في جهاز إرسال الضغط لضبط ضغط الغاز على حوالي 6.5 إلى 7 أرطال لكل بوصة مربعة. تأكد من قيمة ضغط الغاز باستخدام مقياس ضغط رقمي. راقب تدفق الغاز عن طريق التحقق من معدل الفقاعات التي تم إنشاؤها داخل أنبوب الاختبار المملوء بالماء المخصص داخل الحاضنة الدقيقة.اضبط معدل الفقاعة المناسب عن طريق إغلاق أو فتح صمام تدفق الغاز على غطاء زجاجة المياه. تأكد من أن تدفق الغاز يسمح بتكوين فقاعات بمعدل 2 إلى 4 فقاعات في الثانية أو اضبط تدفق الفقاعة عند النقطة الأولى حيث تخرج الفقاعات إلى أنبوب المخرج المملوء بالماء. بعد ذلك ، املأ زجاجات الثقافة ب 2 ملليلتر من وسط الثقافة.استخدم بنجات السيليكون المجوفة لإغلاق الزجاجات وتوصيلها بالأسطوانة الدوارة المجوفة للتوازن المسبق لمدة 1 ساعة. حافظ على المساحات الفارغة في الأسطوانة الدوارة مغلقة باستخدام الكتل الصلبة. بعد ذلك ، تشريح الأجنة من أنثى أنثى قاتلة تم قتلها.نظف البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول وقطع الجلد وجدار البطن باستخدام المقص. حدد أحد طرفي الرحم وقطعه عند التقاطع بين المبيض والرحم. استمر في القطع على طول الرحم حتى الطرف الآخر وانقله إلى طبق بتري 100 ملم مملوء ب DPBS.اغسل المفاهيم بسرعة في DPBS وقطعها إلى أزواج لتسهيل التعامل مع الأجنة. انقل جميع أزواج المفاهيم إلى وسط تشريح متوازن مسبقا في طبق بتري 60 ملم ، ثم قطعه إلى المفاهيم الفرديةالاستخدامات. بعد ذلك ، باستخدام زوج من الملقط الإجمالي ، قم بإزالة جدار الرحم من المفهوميستخدم عن طريق تمزيق أنسجة الرحم ، ثم باستخدام ملقط دقيق ، مجهري ، قطع طرف decidua على شكل كمثرى.أدخل الملقط بجوار الجنين موازيا لمحوره الطويل وافتح الملقط لتقسيم الديسيدوا إلى نصفين. أخيرا ، باستخدام ملقط ناعم ، أمسك الجنين من الديسيدوا وقشر كيس الصفار الجداري من الجنين ، تاركا المخروط الخارجي المشيمي السليم متصلا بأسطوانة البيض. حدد الأجنة في الصفيحة العصبية، أو مرحلة طي الرأس المبكرة، التي لا تظهر أي ضرر في الأرومة العصبية.انقل 5 إلى 6 أجنة مختارة لكل زجاجة إلى زجاجات الاستزراع الزجاجية المتوازنة مسبقا وضع الزجاجات في نظام الاستزراع الدوار عند 37 درجة مئوية ، في جو من 5٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. لزراعة أجنة ما قبل المعدة والمعدة المبكرة والصفائح الثابتة، أضف 250 ميكرولتر من وسط زراعة الأجنة خارج الرحم المعد حديثا إلى كل بئر من 8 صفيحات بئر. ضع الألواح داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية للتوازن المسبق.بعد تشريح الأجنة خارج الرحم كما هو موضح سابقا ، قم بنقل الأجنة الفردية إلى كل بئر من صفيحة البئر 8 باستخدام ماصة صغيرة ووضع الصفيحة داخل الحاضنة مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. صور الأجنة تحت مجهر ستيريو واختر للزراعة فقط تلك التي لديها تجويف أمنيوسي جيد التكوين دون أي ضرر واضح وبدون غشاء رايشرت. تدعم ظروف زراعة الأسطوانة الموصوفة في هذا البروتوكول للأجنة البالغة من العمر 7.5 يوم نمو الجنين المستمر والطبيعي بمتوسط كفاءة يقترب من 75٪ بعد 4 أيام من الزرع.تختلف كفاءة تطور الجنين عبر الخلفيات الوراثية المتنوعة للفئران ولكنها قوية باستمرار. المكملات الغذائية مع HBS بدلا من HCS تعطي كفاءة تبلغ حوالي 68٪ بعد 4 أيام من الثقافة. يتم تلخيص تطور 6.5 أجنة وألواح ثابتة بشكل صحيح بكفاءة تزيد عن 90٪ باستخدام وسط زراعة الأجنة خارج الرحم مع كل من HCS و HBS.تظهر الثقافات التي تبدأ من الأجنة قبل المعدة كفاءة بنسبة 46٪ من التطور السليم إلى مرحلة السوميت المبكرة وما يقرب من 17٪ من الأجنة تكمل التطور السليم بعد 6 أيام من الزرع. يستمر التشكل وتطور الأنسجة بشكل صحيح حتى 42 سوميت. تظهر هنا العيوب التنموية التمثيلية التي لوحظت في الأجنة للمزارع التي بدأت من اليوم الجنيني 7.5 و 6.5 و 5.5.يجب التخلص من الأجنة ذات الأضرار الطفيفة في الأرومة أو الأجنة التي تحتفظ بغشاء رايشرت. لن تنمو الأجنة المبكرة بشكل صحيح أو تظهر تأخيرات شديدة في النمو في حين أن ربط الأرومة الجنينية بسطح الصفيحة سيؤدي إلى فشل المزيد من تطور الجنين. التشوهات الرئيسية التي لوحظت في الأجنة المعيبة هي تطور المنطقة الخلفية خارج كيس الصفار أو عيوب في نمو الطيات العصبية.في الثقافات المطورة من الأجنة البالغة من العمر 5.5 يوم ، غالبا ما يلاحظ عيب النمو هو وجود أبلوبلاست صغير متخلف. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للباحثين إجراء مجموعة متنوعة من التلاعب الفيزيائي أو الكيميائي في تطوير الأجنة بعد الزرع. على سبيل المثال ، التلاعب أو زرع الخلايا أو تتبع الأنساب.هذه الطريقة لا تمهد الطريق فقط لدراسة الفئران بعد الزرع النامية بتفصيل كبير ، ولكن أيضا لتنفيذ طرق استزراع مماثلة في الأجنة من الأنواع الأخرى ، مثل الإنسان.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

في حقن الرحم البينية القلب الطماطم كتين على أجنة الفئران لقياس تدفق الدم الكلوي

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

فيفو السابقين الثقافة من بلعومي الأقواس لدراسة القلب والعضلات الأسلاف ومكانها المناسب

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

باستخدام<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

زراعة الخلايا الأولية الأديم الباطن طلائي من الكيس المحي غشاء اليابانية السمان الأجنة

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

العزلة والثقافة وتحريض Adipogenic من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الدهنية المشتقة من الخلايا الدهنية العصبية من الأنسجة الدهنية

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...