Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Pascal og Ilana Mantoux; Det Europæiske Forskningsråd (EFR-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) professorat, BSF, Helen og Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen og Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella og Leon Benoziyo Center for Neurologiske Sygdomme, David og Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til Animal Protection Guidelines fra Weizmann Institute of Science og godkendt af det relevante Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Raske gravide kvinder blev bedt om at give deres informerede samtykke til at indsamle blod fra navlestrengen, som godkendt af Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Raske voksne blev bedt om deres informerede samtykke til at få blod indsamlet i henhold til retningslinjerne fra Weizmann Institute of Science...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

Den kulturprotokol, der præsenteres heri, kan opretholde korrekt og kontinuerlig udvikling af museembryoer ex utero i op til seks dage, fra E5.5 til E11. Tidligere kunne embryoner på disse udviklingsstadier kun udvikle sig normalt i kultur i korte perioder (op til 48 timer)15. Koblingen af gasreguleringsmodulet til rullekulturinkubatoren for præcis kontrol af iltkoncentration og hyperbart gastryk er afgørende for den korrekte museembryokultur, der er beskrevet heri. Forøgelse af gast...

Intrauterin udvikling af pattedyrembryoet har begrænset undersøgelsen af de tidlige stadier af postimplantationsudvikling1,2. Utilgængeligheden af det udviklende embryo hæmmer forståelsen af vigtige udviklingsprocesser, der forekommer efter embryoimplantaterne i livmoderen, såsom etablering af dyrekropsplanen, specifikation af kimlagene eller dannelse af væv og organer. Desuden gør den meget lille størrelse af det tidlige postimplanterede embryo det vanskeligt at observere ved intravital billeddannelse i livmoderen før E103. Manglende evne til at observere og manipulere levende embryoner på disse stadier har begrænset undersøgelsen af tidlig postimplantationsembryogenese til øjebliksbilleder under udvikling.
Protokoller for in vitro-dyrkning af præimplantationsfottedyrs embryoner er veletablerede, pålidelige og anvendes regelmæssigt4. Ikke desto mindre havde forsøg på at etablere ex utero-dyrkningssystemer, der kunne understøtte korrekt embryonvækst efter pattedyrs postimplantation, begrænset succes5. En række forskellige dyrkningsteknikker er blevet foreslået i over et århundrede, hovedsagelig ved at dyrke embryonerne i konventionelle statiske plader6,7,8 eller roterende flasker (rullekulturer)5,9,10. Disse platforme viste sig nyttige til at udvide viden om pattedyrs udvikling efter implantation11,12, på trods af at de var yderst ineffektive for normal embryooverlevelse og begrænset til korte perioder. Embryonerne begyndte at vise udviklingshæmning og morfologiske anomalier allerede 24-48 timer efter kulturinitiering.
Denne undersøgelse giver en detaljeret beskrivelse af oprettelsen af ex utero embryokultursystemet, der muliggør kontinuerlig udvikling fra prægastrulation til avancerede organogenesestadier over op til seks dages postimplantationsudvikling13. Dette papir beskriver den forbedrede rullekulturprotokol, der understøtter væksten af E7,5-embryoner (neural plade og hovedfold-stadium) indtil bagbensdannelsestrinnet (~ E11) og den udvidede kultur fra E5.5 / E6.5 ved at kombinere kultur på statiske plader og rullekulturplatforme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

Metoder til dyrkning af pattedyr efterimplantation har generelt været ineffektive og begrænset til korte perioder efter dissektion ud af livmoderen. Platforme er for nylig blevet udviklet til meget robust og langvarig ex utero-kultur af museembryoner fra ægcylinderstadier til avanceret organogenese. Disse platforme muliggør en hensigtsmæssig og trofast udvikling af prægaststyrende embryoner (E5.5) indtil bagbensdannelsestrinnet (E11). Sengassende embryoner (E7.5) dyrkes i roterende flasker i disse indstillinger, mens udvidet kultur fra prægastrulationsstadier (E5.5 eller E6.5) kræver en kombination af statiske og roterende flaskekulturer. Derudover er følsom regulering af O2 - og CO2-koncentration , gastryk, glukoseniveauer og brugen af et specifikt ex utero-dyrkningsmedium afgørende for korrekt embryonudvikling. Her tilvejebringes en detaljeret trin-for-trin protokol for udvidet embryokultur med ex utero-mus . Evnen til at dyrke normale museembryoner ex utero fra gastrulation til organogenese repræsenterer et værdifuldt redskab til at karakterisere effekten af forskellige eksperimentelle forstyrrelser under embryonal udvikling.

De rullekulturbetingelser, der er beskrevet for E7,5-embryoner (sen gastrulationsfase), understøtter konstant og normal embryovækst med en gennemsnitlig effektivitet tæt på 75 % efter 4 dyrkningsdage (figur 2 og tabel 1). Effektiviteten af embryonudvikling kan variere på tværs af forskellige musegenetiske baggrunde, men er konsekvent robust (figur 2C). Tilskud med HBS i stedet for HCS giver en effektivitet på ~68% efter 4 dages ex ute...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

En forbedret platform for helembryokultur muliggør kontinuerlig og robust ex utero-udvikling af museembryoner efterimplantation i op til seks dage, fra prægastrulationsstadier til avanceret organogenese. I denne protokol beskriver vi standardproceduren for vellykket embryokultur ved hjælp af statiske plader og roterende flaskesystemer.

Ex Utero Kultur af museembryoner fra prægastrulation til avanceret organogenese

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Denne metode vil være grundlæggende for at forstå gastrulation langs en dannelse hos pattedyr. Ved at tillade eksperimenter i levende embryoner under embryonale stadier, der længe har været skjult inde i moderens livmoder. Det tillader, fortsætter effektiv og passende vækst af museembryoner uden for livmoderen i en længere periode på op til 6 dage.Hurtig og tilstrækkelig embryodissektion og prægastrulation af gaskoncentrationen og trykket er de mest kritiske trin for vellykket embryovækst. For at begynde at dyrke 7,5 dage gamle eller mere avancerede museembryoner skal du tænde rotatoren og varmeenheden i rullekulturinkubatorsystemet i mindst 1 time før embryodissektionerne. Tilsæt også autoklavevand til gasindløbsflasken og udløbsreagensglasset.Tænd derefter for gasregulatormodulet ved at trykke på hovedafbryderen, og brug derefter de respektive controllere til at indstille ilt- og kuldioxidværdierne til 5% Åbn gasregulatoren og flyt spændingsafbryderen i tryktransmitteren for at indstille gastrykket til ca. 6,5 til 7 pund pr. Kvadrattomme. Bekræft gastryksværdien ved hjælp af en digital manometer. Overvåg gasstrømmen ved at kontrollere hastigheden af bobler, der er skabt inde i det udløbsvandfyldte reagensglas, der er tildelt inde i præcisionsinkubatoren.Indstil den korrekte boblehastighed ved at lukke eller åbne gasstrømningsventilen på vandflaskens låg. Sørg for, at gasstrømmen tillader dannelse af bobler med en hastighed på 2 til 4 bobler i sekundet, eller indstil boblestrømmen på det første punkt, hvor boblende kommer ud til det vandfyldte udløbsrør. Fyld derefter kulturflaskerne med 2 ml kulturmedium.Brug de udhulede siliciumbungs til at forsegle flaskerne og sæt dem i den udhulede roterende tromle til forligevægt i 1 time. Hold de tomme mellemrum i den roterende tromle forseglet ved hjælp af de faste bungs. Dernæst dissekeres embryonerne fra en aflivet gravid kvindelig mus.Rengør maven med 70% ethanol og skær huden og bugvæggen ved hjælp af en saks. Find den ene ende af livmoderen og skær i krydset mellem æggestokken og livmoderen. Fortsæt med at skære langs livmoderen indtil den anden ende og overfør til en 100 millimeter petriskål fyldt med DPBS.Vask hurtigt konceptbrugerne i DPBS og skær dem parvis for at lette håndteringen af embryoner. Flyt alle par konceptbruger til præ-ligevægtet dissektionsmedium i en 60 millimeter petriskål, og skær derefter i de enkelte koncepter. Brug derefter et par grove tang til at fjerne livmodervæggen i konceptbrugerne ved at rive livmodervævet og derefter skære spidsen af den pæreformede decidua ved hjælp af fine, mikrokirurgiske tang.Indsæt tangen ved siden af embryoet parallelt med dets lange akse, og åbn tangen for at opdele decidua i halvdele. Endelig skal du ved hjælp af fine tang gribe embryoet fra decidua og skrælle parietal æggeblommesækken af embryoet og efterlade den intakte ektoplacentale kegle fastgjort til ægcylinderen. Vælg embryonerne i den neurale plade eller det tidlige hovedfoldstadium, der ikke viser nogen skade i epiblasten.Overfør 5 til 6 udvalgte embryoner pr. flaske til de præ-ligevægtede glaskulturflasker og anbring flaskerne i det roterende kultursystem ved 37 grader Celsius, i en atmosfære på 5% ilt og 5% kuldioxid. Til dyrkning af prægastrulation og tidlige gastrulationsembryoner og statiske plader tilsættes 250 mikroliter frisklavet ex-utero embryokulturmedium til hver brønd i en 8 brøndplade. Placer pladerne inde i en kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius til forligevægt.Efter dissekering af embryonerne ud af livmoderen som tidligere påvist, overføres de enkelte embryoner til hver brønd på 8 brøndpladen ved hjælp af en mikropipette og placeres pladen inde i inkubatoren med 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius. Forestil dig embryonerne under et stereomikroskop, og vælg kun dem med et velformet fosterhulrum uden tydelig skade og uden Reicherts membran. De rullekulturbetingelser, der er beskrevet i denne protokol for 7,5 dage gamle embryoner, understøtter konstant og normal embryovækst med en gennemsnitlig effektivitet tæt på 75% efter 4 dyrkningsdage.Effektiviteten af embryonudvikling varierer på tværs af forskellige musegenetiske baggrunde, men er konsekvent robust. Tilskud med HBS i stedet for HCS giver en effektivitet på ca. 68% efter 4 dages dyrkning. Udviklingen af 6,5 embryoner og statiske plader rekapituleres korrekt med en effektivitet på mere end 90% ved anvendelse af ex-utero embryokulturmedium med både HCS og HBS.Kulturer, der starter fra prægaststyrende embryoner, viser en 46% effektivitet af korrekt udvikling til det tidlige somitstadium, og næsten 17% af embryonerne fuldender korrekt udvikling efter 6 dages kultur. Morfogenesen og vævsudviklingen fortsætter korrekt indtil 42 somitter. Repræsentative udviklingsfejl observeret i embryoner for kulturer initieret fra embryonal dag 7.5, 6.5 og 5.5 er vist her.Embryoner med mindre skade på epiblasten eller embryoner, der bevarer Reicherts membran, skal kasseres. Tidlige embryoner vil ikke vokse ordentligt eller udvise alvorlige udviklingsforsinkelser, mens fastgørelse af den embryonale epiblast til overfladen af pladen vil medføre svigt i yderligere embryoudvikling. De vigtigste abnormiteter, der observeres i defekte embryoner, er udviklingen af den bageste region uden for æggeblommesækken eller defekter i væksten af de neurale folder.I kulturer udviklet fra 5,5 dage gamle embryoner observeres ofte udviklingsdefekt er tilstedeværelsen af en lille, underudviklet epiblast. Ved hjælp af denne metode er forskere i stand til at udføre en række fysiske eller kemiske manipulationer i udviklingen af postimplantaterede embryoner. For eksempel manipulation, cellulær transplantation eller slægtssporing.Denne metode baner ikke kun vejen for at studere musens postimplantation, der udvikler sig i detaljer, men også for at implementere lignende kulturmetoder i embryoner fra andre arter, såsom mennesker.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimeret<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Dyrkning af kyllingeembryoer til fremskredne stadier af udvikling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

I Utero intrakardielle Tomat-lectin injektioner på museembryoer at måle den renale blodgennemstrømning

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Brug<em&gt; Ex vivo</em&gt; Upright dråbedistribution Kulturer af Whole Fetal organer til at studere udviklingsprocesser under Mus Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primær endodermal epithelcellekultur fra blommesækken membran af japanske vagtelembryoner

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afledning af stamcellelinjer fra mus præimplantations embryoner

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolation, Kultur og adipogen induktion af neuralcrest original fedt-afledte stamceller fra periaortisk fedtvæv

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...