Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door Pascal en Ilana Mantoux; Europese Onderzoeksraad (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Flight Attendant Medical Research Council (FAMRI); Israel Cancer Research Fund (ICRF) hoogleraarschap, BSF, Helen en Martin Kimmel Institute for Stem Cell Research, Helen en Martin Kimmel Award for Innovative Investigation; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, het Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella en Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de Animal Protection Guidelines van weizmann Institute of Science en goedgekeurd door het relevante Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Gezonde zwangere vrouwen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming te geven om bloed uit hun navelstreng te verzamelen, zoals goedgekeurd door het Rambam Medical Center Helsinki Committee (#RMB-0452-15). Gezonde volwassenen werd gevraagd om hun geïnformeerde toestemming om bloed te laten verzamelen volgens de r...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

Het hierin gepresenteerde kweekprotocol kan een goede en continue ontwikkeling van muizenembryo ex utero gedurende maximaal zes dagen ondersteunen, van E5.5 tot E11. Voorheen konden embryo's in deze ontwikkelingsstadia zich normaal in cultuur slechts gedurende korte perioden (tot 48 uur) ontwikkelen15. De koppeling van de gasregelmodule aan de rolkweekincubator voor nauwkeurige controle van de zuurstofconcentratie en hyperbare gasdruk is van cruciaal belang voor de juiste muizenembryocult...

Intra-uteriene ontwikkeling van het zoogdierembryo heeft de studie van de vroege stadia van postimplantatieontwikkeling beperkt1,2. De ontoegankelijkheid van het zich ontwikkelende embryo belemmert het begrip van belangrijke ontwikkelingsprocessen die plaatsvinden nadat het embryo zich in de baarmoeder heeft geïmplanteerd, zoals de vaststelling van het dierlijke lichaamsplan, specificatie van de kiemlagen of de vorming van weefsels en organen. Bovendien maakt de zeer kleine omvang van het vroege postimplanteerde embryo het moeilijk om te observeren door intravitale beeldvorming in utero vóór E103. Het onvermogen om levende embryo's in deze stadia te observeren en te manipuleren heeft de studie van vroege postimplantatie-embryogenese beperkt tot momentopnamen tijdens de ontwikkeling.
Protocollen voor in vitro kweek van pre-implantatie zoogdierembryo's zijn goed ingeburgerd, betrouwbaar en worden regelmatig gebruikt4. Niettemin hadden pogingen om ex utero-kweeksystemen op te zetten die in staat zijn een goede postimplantatie-embryogroei bij zoogdieren te ondersteunen, beperkt succes5. Al meer dan een eeuw wordt een verscheidenheid aan kweektechnieken voorgesteld, voornamelijk door het kweken van de embryo's in conventionele statische platen6,7,8 of roterende flessen (rolculturen)5,9,10. Deze platforms bleken nuttig bij het uitbreiden van de kennis over de ontwikkeling van zoogdieren na implantatie11,12, ondanks het feit dat ze zeer inefficiënt waren voor normale embryooverleving en beperkt waren tot korte perioden. De embryo's begonnen al 24-48 uur na kweekinitiatie ontwikkelingsachterstand en morfologische anomalieën te vertonen.
Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving voor het opzetten van het ex utero embryokweeksysteem dat een continue ontwikkeling mogelijk maakt van pregastrulatie tot gevorderde organogenesestadia gedurende maximaal zes dagen postimplantatieontwikkeling13. Dit artikel beschrijft het verbeterde rollerkweekprotocol dat de groei van E7.5-embryo's (neurale plaat en headfold-stage) ondersteunt tot het vormingsstadium van de achterpoten (~ E11) en de uitgebreide kweek van E5.5 / E6.5 door cultuur te combineren op statische platen en rolkweekplatforms.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

Postimplantatie embryokweekmethoden van zoogdieren zijn over het algemeen inefficiënt en beperkt tot korte perioden na dissectie uit de baarmoeder. Er zijn onlangs platforms ontwikkeld voor zeer robuuste en langdurige ex utero-kweek van muizenembryo's vanaf ei-cilinderstadia tot gevorderde organogenese. Deze platforms maken een geschikte en getrouwe ontwikkeling van pregastruerende embryo's (E5.5) mogelijk tot het stadium van de vorming van de achterpoten (E11). Late gastrulatende embryo's (E7.5) worden in deze omgevingen gekweekt in roterende flessen, terwijl uitgebreide kweek uit pregastrulatiestadia (E5.5 of E6.5) een combinatie van statische en roterende flesculturen vereist. Bovendien zijn gevoelige regulatie van O2 - en CO2-concentratie , gasdruk, glucosespiegels en het gebruik van een specifiek ex utero kweekmedium van cruciaal belang voor een goede embryo-ontwikkeling. Hier wordt een gedetailleerd stap-voor-stap protocol voor uitgebreide ex utero muis embryokweek gegeven. Het vermogen om normale muizenembryo's ex utero te laten groeien van gastrulatie tot organogenese is een waardevol hulpmiddel voor het karakteriseren van het effect van verschillende experimentele verstoringen tijdens de embryonale ontwikkeling.

De beschreven rolkweekomstandigheden voor E7,5-embryo's (late gastrulatiefase) ondersteunen een constante en normale embryogroei met een gemiddelde efficiëntie van bijna 75% na 4 kweekdagen (figuur 2 en tabel 1). De efficiëntie van de embryo-ontwikkeling kan variëren tussen verschillende genetische achtergronden van muizen, maar is consistent robuust (figuur 2C). Suppletie met HBS in plaats van HCS levert een efficiëntie op van ~68% na 4 dag...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Een verbeterd platform voor de kweek van hele embryo's maakt een continue en robuuste ex utero-ontwikkeling van postimplantatiemuismyo's gedurende maximaal zes dagen mogelijk, van pregastrulatiestadia tot gevorderde organogenese. In dit protocol beschrijven we de standaardprocedure voor succesvolle embryokweek met behulp van statische platen en roterende flessystemen.

Ex Utero Kweek van muizenembryo's van pregastrulatie tot geavanceerde organogenese

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Deze methode zal fundamenteel zijn voor het begrijpen van gastrulatie langs een formatie bij zoogdieren. Door experimenten met levende embryo's mogelijk te maken tijdens embryonale stadia die lang verborgen zijn geweest in de baarmoeder van de moeder. Het maakt een efficiënte en geschikte groei van muizenembryo's buiten de baarmoeder mogelijk voor een langere periode van maximaal 6 dagen.Snelle en adequate embryodissectie en pregastrulatie van de gasconcentratie en -druk zijn de meest kritieke stappen voor een succesvolle embryogroei. Om te beginnen met het kweken van 7,5 dagen oude of meer geavanceerde muizenembryo's, schakelt u de rotator en de verwarmingseenheid van het rollerkweekincubatorsysteem gedurende ten minste 1 uur vóór de dissecties van het embryo in. Voeg ook autoclaafwater toe aan de gasinlaatfles en de uitlaattestbuis.Schakel vervolgens de gasregelaarmodule in door op de hoofdschakelaar te drukken en gebruik vervolgens de respectieve controllers om de zuurstof- en koolstofdioxidewaarden in te stellen op 5% Open de gasregelaar en verplaats de spanningsschakelaar in de druktransmitter om de gasdruk in te stellen op ongeveer 6,5 tot 7 pond per vierkante inch. Bevestig de gasdrukwaarde met behulp van een digitale manometer. Controleer de gasstroom door de snelheid te controleren van de bellen die zijn gemaakt in de met water gevulde reageerbuis die is toegewezen in de precisie-incubator.Stel de juiste bellensnelheid in door de gasstroomklep op het deksel van de waterfles te sluiten of te openen. Zorg ervoor dat de gasstroom de vorming van bellen met een snelheid van 2 tot 4 bellen per seconde mogelijk maakt of stel de bellenstroom in op het eerste punt waar borrelen uitkomt op de met water gevulde uitlaatbuis. Vul vervolgens de kweekflessen met 2 milliliter kweekmedium.Gebruik de uitgeholde siliconen bungs om de flessen af te sluiten en sluit ze aan op de uitgeholde roterende trommel voor pre-equilibratie gedurende 1 uur. Houd de lege ruimtes in de roterende trommel afgesloten met behulp van de massieve bungs. Ontleed vervolgens de embryo's van een geëuthanaseerde zwangere vrouwelijke muis.Reinig de buik met 70% ethanol en knip de huid en buikwand met een schaar. Lokaliseer het ene uiteinde van de baarmoeder en snijd op de kruising tussen de eierstok en de baarmoeder. Blijf langs de baarmoeder snijden tot het andere uiteinde en breng over naar een petrischaaltje van 100 millimeter gevuld met DPBS.Was de conceptussen snel in DPBS en snijd ze in paren om de behandeling van embryo's te vergemakkelijken. Verplaats alle paar conceptussen naar een vooraf gebalanceerd dissectiemedium in een petrischaaltje van 60 millimeter en snijd vervolgens in de afzonderlijke conceptussen. Verwijder vervolgens met behulp van een grove tang de baarmoederwand van de conceptussen door het baarmoederweefsel te scheuren en snijd vervolgens met een fijne, microchirurgische tang de punt van de peervormige decidua.Steek de tang naast het embryo parallel aan zijn lange as en open de tang om de decidua in tweeën te splitsen. Pak ten slotte met behulp van een fijne tang het embryo van de decidua en pel de pariëtale dooierzak van het embryo, waardoor de intacte ectoplacentale kegel aan de eicilinder blijft vastzitten. Selecteer de embryo's in de neurale plaat, of vroege hoofdplooifase, die geen schade in de epiblast vertonen.Breng 5 tot 6 geselecteerde embryo's per fles over naar de vooraf gebalanceerde glazen kweekflessen en plaats de flessen in het roterende kweeksysteem bij 37 graden Celsius, in een atmosfeer van 5% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Om pregastrulatie en vroege gastrulatie-embryo's en statische platen te kweken, voegt u 250 microliter vers bereid ex-utero embryo kweekmedium toe aan elke put van een 8-putplaat. Plaats de platen in een kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius voor pre-equilibratie.Na het ontleden van de embryo's uit de baarmoeder zoals eerder aangetoond, breng de individuele embryo's over in elke put van de 8 putplaat met behulp van een micropipet en plaats de plaat in de couveuse met 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius. Stel de embryo's onder een stereomicroscoop voor en selecteer voor kweek alleen die met een goed gevormde vruchtwaterholte zonder duidelijke schade en zonder het membraan van de Reichert. De rolkweekomstandigheden die in dit protocol worden beschreven voor embryo's van 7,5 dagen oud ondersteunen een constante en normale embryogroei met een gemiddelde efficiëntie van bijna 75% na 4 kweekdagen.De efficiëntie van de embryo-ontwikkeling varieert tussen verschillende genetische achtergronden van muizen, maar is consistent robuust. Suppletie met HBS in plaats van HCS levert een efficiëntie op van ongeveer 68% na 4 dagen cultuur. De ontwikkeling van 6,5 embryo's en statische platen wordt correct samengevat met een efficiëntie van meer dan 90% met behulp van ex-utero embryo kweekmedium met zowel HCS als HBS.Culturen die beginnen met pregastruerende embryo's vertonen een efficiëntie van 46% van de juiste ontwikkeling tot het vroege somite stadium en bijna 17% van de embryo's voltooit de juiste ontwikkeling na 6 dagen kweek. De morfogenese en weefselontwikkeling verlopen goed tot 42 somites. Representatieve ontwikkelingsstoornissen waargenomen in embryo's voor culturen geïnitieerd vanaf embryonale dag 7,5, 6,5 en 5,5 worden hier weergegeven.Embryo's met lichte schade aan de epiblast of embryo's die het membraan van reichert behouden, moeten worden weggegooid. Vroege embryo's zullen niet goed groeien of ernstige ontwikkelingsachterstanden vertonen, terwijl aanhechting van de embryonale epiblast aan het oppervlak van de plaat het falen van verdere embryo-ontwikkeling zal veroorzaken. De belangrijkste afwijkingen die worden waargenomen bij defecte embryo's zijn de ontwikkeling van het achterste gebied buiten de dooierzak of defecten in de groei van de neurale plooien.In culturen ontwikkeld uit 5,5 dagen oude embryo's worden vaak waargenomen ontwikkelingsdefect is de aanwezigheid van een kleine, onderontwikkelde epiblast. Met behulp van deze methode kunnen onderzoekers een verscheidenheid aan fysische of chemische manipulaties uitvoeren bij het ontwikkelen van post-geïmplanteerde embryo's. Bijvoorbeeld manipulatie, celtransplantatie of afstammingstracering.Deze methode maakt niet alleen de weg vrij voor het bestuderen van de post-implantatie van muizen die zich in detail ontwikkelen, maar ook voor het implementeren van vergelijkbare kweekmethoden in embryo's van andere soorten, zoals de mens.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Geoptimaliseerd<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Het kweken van kippenembryo&#39;s tot geavanceerde stadia van ontwikkeling

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero van intracardiale Tomaat-lectine Injecties op muis embryo&#39;s in te schatten nierdoorbloeding

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Gebruik<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Upright Droplet Culturen van Whole Foetale organen Developmental processen te bestuderen tijdens Mouse Organogenese

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Primaire endodermale epitheelcellen Cultuur van de dooierzak membraan van de Japanse kwartel embryo

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Afleiding van stamcellijnen uit muis voor inplanting embryo 's

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...