Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי פסקל ואילנה מנטוקס; מועצת המחקר האירופית (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); דיילת המועצה למחקר רפואי (FAMRI); הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF), BSF, מכון הלן ומרטין קימל לחקר תאי גזע, פרס הלן ומרטין קימל לחקירה חדשנית; הקרן הישראלית למדע (ISF), מינרבה, מכון שרמן לכימיה רפואית, מרכז נלה וליאון בנוזיו למחלות נוירולוגיות, מרכז משפחת דוד ופלה שפל לחקר הפרעות גנטיות, מכון משפחת קססט לגנטיקה רפואית, קרן המחקר לתאי גזע של ד"ר בית רום-רמר, קרנות אדמונד דה רוטשילד, קרן הצדקה זנטקר, אחוזת צביה זרוני.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות ההגנה על בעלי חיים של מכון ויצמן למדע ואושרו על ידי מכון ויצמן הרלוונטי IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). נשים הרות ובריאות התבקשו לתת את הסכמתן מדעת לאיסוף דם מחבל הטבור שלהן, כפי שאושר על ידי ועדת הלסינקי של המרכז הרפואי רמב"ם (#RMB-0452-15). מבוגרים בריאים התבקש...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

פרוטוקול התרבות המוצג כאן יכול לקיים רחם עובר עכבר תקין ומתמשך למשך עד שישה ימים, מ- E5.5 עד E11. בעבר, עוברים בשלבים התפתחותיים אלה יכולים להתפתח כרגיל בתרבות רק לתקופות קצרות (עד 48 שעות)15. הזיווג של מודול ויסות הגז לחממת תרבות הרולר לשליטה מדויקת בריכוז החמצן ולחץ הגז ההיפרב?...

ההתפתחות התוך רחמית של העובר היונקים הגבילה את המחקר של השלבים המוקדמים של התפתחות לאחר ההשתלה1,2. חוסר הנגישות של העובר המתפתח מעכב את ההבנה של תהליכים התפתחותיים מרכזיים המתרחשים לאחר השתלות העובר לרחם, כגון הקמת תוכנית גוף בעלי החיים, מפרט שכבות הנבט, או היווצרות רקמות ואיברים. יתר על כן, הגודל הקטן מאוד של העובר שלאחר ההשתלה המוקדמת מקשה על התבוננות על ידי הדמיה תוך-ויטמית ברחם לפני E103. חוסר היכולת להתבונן ולתפעל עוברים חיים בשלבים אלה הגבילה את המחקר של עוברי לאחר ההשתלה המוקדמים לתמונות במהלך ההתפתחות.
פרוטוקולים לתרבות הפריה חוץ גופית של עוברים יונקים טרום ההשתלה מבוססים היטב, אמינים, ומנוצלים באופן קבוע4. אף על פי כן, הניסיונות להקים מערכות תרבות הרחם לשעבר המסוגלות לתמוך בצמיחה נכונה של העובר לאחר ההשתלה היונקים נחלו הצלחה מוגבלת5. מגוון טכניקות תרבות הוצעו במשך למעלה ממאה שנה, בעיקר על ידי פולחן העוברים בלוחות סטטיים קונבנציונליים6,7,8 או בקבוקים מסתובבים (תרביות רולר)5,9,10. פלטפורמות אלה הוכיחו את עצמן כמועילות בהרחבת הידע על התפתחות היונקים לאחר ההשתלה 11,12, למרות היותן מאוד לא יעילות להישרדות העובר הרגילה ומוגבלות לתקופות קצרות. העוברים החלו להציג פיגור התפתחותי וחריגות מורפולוגיות כבר 24-48 שעות לאחר חניכת התרבות.
מחקר זה מספק תיאור מפורט להקמת מערכת תרבות העובר ברחם לשעבר המאפשרת התפתחות רציפה משלב טרום-אסטרולציה לשלבי אורגנוגנזה מתקדמים במשך עד שישה ימים של התפתחות לאחר ההשתלה13. מאמר זה מתאר את פרוטוקול תרבות הרולר המשופר התומך בצמיחה של עוברים E7.5 (לוח עצבי ושלב כיסוי הראש) עד שלב היווצרות הגפיים האחוריות (~ E11) ואת התרבות המורחבת מ- E5.5/ E6.5 על ידי שילוב תרבות על לוחות סטטיים ופלטפורמות תרבות רולר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

שיטות התרבות של היונקים לאחר ההשתלה היו בדרך כלל לא יעילות ומוגבלות לתקופות קצרות לאחר ניתוח הרחם. פלטפורמות פותחו לאחרונה עבור תרבות רחם לשעבר חזקה וממושכת מאוד של עוברי עכבר משלבי גליל ביצה עד organogenesis מתקדם. פלטפורמות אלה מאפשרות פיתוח מתאים ונאמן של עוברים טרום-כבידה (E5.5) עד לשלב היווצרות הגפיים האחוריות (E11). עוברים גסטריים מאוחרים (E7.5) גדלים בבקבוקים מסתובבים בהגדרות אלה, בעוד שתרבות מורחבת משלבי טרום-סטרולציה (E5.5 או E6.5) דורשת שילוב של תרביות בקבוקים סטטיות ומסתובבות. בנוסף, רגולציה רגישה של ריכוז O2 ופחמן דו חמצני, לחץ גז, רמות גלוקוז, ושימוש במדיום תרבית הרחם לשעבר ספציפי הם קריטיים להתפתחות העובר הנכון. כאן, פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד עבור תרבות עובר עכבר הרחם לשעבר מורחב מסופק. היכולת לגדל עוברי עכבר רגילים לשעבר הרחם מן gastrulation כדי organogenesis מייצג כלי בעל ערך לאפיון ההשפעה של הפרעות ניסיוניות שונות במהלך התפתחות עוברית.

תנאי תרות הרולר המתוארים עבור עוברים E7.5 (שלב גסטרולציה מאוחרת) תומכים בצמיחה קבועה ונורמלית של עוברים ביעילות ממוצעת של קרוב ל-75% לאחר 4 ימי תרבות (איור 2 ולוח 1). היעילות של התפתחות העובר עשויה להשתנות על-פני רקעים גנטיים מגוונים של עכברים, אך היא איתנה באופן עקבי (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

פלטפורמה משופרת לתרבות העוברים המלאים מאפשרת פיתוח רחם אקס רציף וחזק של עוברי עכבר לאחר ההשתלה עד שישה ימים, משלבי טרום ההדבקה ועד לאורגנוגנזה מתקדמת. בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את ההליך הסטנדרטי לתרבות עוברית מוצלחת באמצעות לוחות סטטיים ומערכות בקבוק מסתובבות.

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

שיטה זו תהיה בסיסית להבנת גסטרולציה לאורך היווצרות ביונקים. על ידי מתן אפשרות לניסויים בעוברים חיים בשלבים עובריים שהוסתרו זה מכבר בתוך הרחם האימהי. זה מאפשר, ממשיך צמיחה יעילה ומתאימה של עוברי עכבר מחוץ לרחם לתקופה ממושכת של עד 6 ימים.ניתוח עובר מהיר והולם ו pregastrulation של ריכוז הגז ולחץ הם הצעדים הקריטיים ביותר לצמיחה מוצלחת של העובר. כדי להתחיל פולחן 7.5 יום או עוברי עכבר מתקדמים יותר, להפעיל את המסובב ואת יחידת החימום של מערכת החממה תרבות רולר לפחות 1 שעה לפני הניתוחים העובר. כמו כן, מוסיפים מי autoclave לבקבוק כניסת הגז ואת המבחנה שקע.לאחר מכן, הפעל את מודול וסת הגז על ידי לחיצה על המתג הראשי, ולאחר מכן השתמש בבקרים המתאימים כדי להגדיר את ערכי החמצן והפחמן הדו חמצני ל -5% פתח את וסת הגז והזז את מתג המתח במשדר הלחץ כדי להגדיר את לחץ הגז לכ -6.5 עד 7 פאונד לאינץ 'מרובע. אשר את ערך לחץ הגז באמצעות מד לחץ דיגיטלי. נטר את זרימת הגז על ידי בדיקת קצב הבועות שנוצרו בתוך מבחנה מלאה במי מוצא שהוקצתה בתוך האינקובטור המדויק.הגדר את קצב הבועה הנכון על ידי סגירה או פתיחה של שסתום זרימת הגז על מכסה בקבוק המים. ודא כי זרימת הגז מאפשרת היווצרות של בועות בקצב של 2 עד 4 בועות לשנייה או להגדיר את זרימת הבועה בנקודה הראשונה שבה מבעבע יוצא צינור שקע מלא מים. לאחר מכן, מלא את בקבוקי התרבות עם 2 מיליליטר של מדיום תרבות.השתמש ב bungs סיליקון חלול כדי לאטום את הבקבוקים ולחבר אותם לתוך התוף מסתובב חלול עבור שיווי משקל מראש במשך 1 שעה. שמור את החללים הריקים בתוף המסתובב אטום באמצעות bungs מוצק. לאחר מכן, לנתח את העוברים מעכבר בהריון מורדם.נקו את הבטן עם 70% אתנול וחתכו את העור ואת דופן הבטן באמצעות מספריים. אתר קצה אחד של הרחם וחתוך בצומת בין השחלה לרחם. ממשיכים לחתוך לאורך הרחם עד לקצה השני ומעבירים לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב- DPBS.לשטוף במהירות את המושגים ב- DPBS ולחתוך בזוגות כדי להקל על טיפול בעוברים. העבירו את כל זוגות המושגים למדיום ביתור מתואם מראש בצלחת פטרי בגודל 60 מ"מ, ואז חתכו לתפיסות הבודדות. לאחר מכן, באמצעות זוג מלקחיים ברוטו, להסיר את דופן הרחם של המושגים על ידי קריעת רקמת הרחם, ולאחר מכן באמצעות מלקחיים עדינים, מיקרוכירורגיים, לחתוך את הקצה של decidua בצורת אגס.הכנס את המלקחיים ליד העובר במקביל לציר הארוך שלו ופתח את המלקחיים כדי לפצל את ההחלטה לחצי. לבסוף, באמצעות מלקחיים עדינים, לתפוס את העובר מן decidua ולקלף את שק החלמון הקודקודי את העובר, משאיר את חרוט אקטופלנטל שלם מחובר גליל הביצה. בחר את העוברים בלוח העצבי, או בשלב קיפול הראש המוקדם, שאינם מראים נזק באפילסט.מעבירים 5 עד 6 עוברים נבחרים לבקבוק לבקבוקי תרבית הזכוכית המשתווים מראש ומניחים את הבקבוקים במערכת התרבות המסתובבת ב-37 מעלות צלזיוס, באטמוספירה של 5% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי לתרבות טרום-סטרציה ועוברי גסטרולציה מוקדמים ולוחות סטטיים, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של מדיום תרבות עוברי הרחם לשעבר שהוכנו טריים לכל באר של צלחת 8 בארות. מניחים את הלוחות בתוך אינקובטור פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס עבור שיווי משקל מראש.לאחר ניתוח העוברים מתוך הרחם כפי שהוכח בעבר, להעביר את העוברים בודדים לתוך כל באר של צלחת 8 היטב באמצעות פיפטה מיקרו ומניחים את הצלחת בתוך האינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. דמיינו את העוברים מתחת למיקרוסקופ סטריאו ובחרו לתרבות רק את אלה עם חלל מי השפיר שנוצר היטב ללא נזק ניכר וללא קרום הרייכרט. תנאי תרבות הרולר המתוארים בפרוטוקול זה עבור עוברים בני 7.5 יום תומכים בצמיחת עוברים קבועה ונורמלית עם יעילות ממוצעת של קרוב ל -75% לאחר 4 ימי תרבות.היעילות של התפתחות העובר משתנה על פני רקעים גנטיים שונים של העכבר, אך היא חזקה באופן עקבי. תוספי עם HBS במקום HCS מניב יעילות של כ 68% לאחר 4 ימים של תרבות. הפיתוח של 6.5 עוברים ולוחות סטטיים הוא recapitulated כראוי עם יעילות של יותר מ 90% באמצעות מדיום תרבות עוברי הרחם לשעבר עם HCS ו- HBS.תרבויות החל מעוברים מוקדמים מראות יעילות של 46% של התפתחות נכונה לשלב הסומיט המוקדם וכמעט 17% מהעוברים משלימים התפתחות נכונה לאחר 6 ימים של תרבות. מורפוגנזה ופיתוח רקמות להמשיך כראוי עד 42 somites. פגמים התפתחותיים מייצגים שנצפו בעוברים לתרבויות שיזמה מהיום העוברי 7.5, 6.5 ו-5.5 מוצגים כאן.יש להשליך עוברים עם נזק קל לאפיבלסט או לעוברים השומרים על קרום הרייכרט. עוברים מוקדמים לא יגדלו כראוי או יציגו עיכובים התפתחותיים חמורים בעוד חיבור של האפיבלסט העוברי לפני השטח של הלוח יגרום לכישלון של התפתחות עוברית נוספת. החריגות העיקריות שנצפו בעוברים פגומים הן התפתחות האזור האחורי מחוץ לשק החלמון או פגמים בצמיחת הקפלים העצביים.בתרבויות שפותחו מעוברים בני 5.5 יום נצפו לעתים קרובות פגם התפתחותי הוא נוכחות של אפיבלסט קטן ולא מפותח. באמצעות שיטה זו, החוקרים מסוגלים לבצע מגוון של מניפולציות פיזיות או כימיות בפיתוח עוברים לאחר מושתלים. לדוגמה, מניפולציה, השתלה תאית או מעקב שושלת.שיטה זו לא רק סוללת את הדרך לחקר העכבר לאחר ההשתלה המתפתח בפירוט רב, אלא גם ליישום שיטות תרבות דומות בעוברים ממינים אחרים, כגון בני אדם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

בזריקות עגבניות-לקטינים הרחם Intra-לב בעוברי עכבר כדי לאמוד את זרימת דם בכליות

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

שימוש<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות הזקופה טיפה של איברים העובר שלמים לחקר תהליכים התפתחותיים בעכבר organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

הראשי Endodermal אפיתל תרבית תאים מן קרום צק החלמון של עוברים יפניים שליו

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

בידוד, תרבות, והשראה של הרכס העצבי המקורי אדיפוז-תאי גזע שמקורם ברקמת אדיפוז

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...