Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
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이 작품은 파스칼과 일라나 만투에 의해 지원되었다; 유럽 연구 위원회 (ERC-CoG-2016 726497-셀나디티); 승무원 의학 연구 위원회 (FAMRI); 이스라엘 암 연구 기금 (ICRF) 교수, BSF, 헬렌과 마틴 킴멜 줄기 세포 연구를위한 연구소, 헬렌과 혁신적인 조사에 대한 마틴 킴멜 상; 이스라엘 과학 재단 (ISF), 미네르바, 약용 화학에 대한 셔먼 연구소, 넬라와 레온 베노지요 신경 질환에 대한 센터, 유전 질환 연구를위한 데이비드와 펠라 셰이벨 가족 센터, 의학 유전학에 대한 케이스트 가족 연구소, 박사 베스 롬 - 라이머 줄기 세포 연구 기금, 에드먼드 드 로스 차일드 재단, 잔트 커 자선 재단, Zvia 제로니의 부동산.

모든 동물 실험은 바이즈만 과학 연구소의 동물 보호 지침에 따라 수행되었으며 관련 Weizmann Institute IACUC (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2)에 의해 승인되었습니다. 건강한 임산부는 람밤 의료 센터 헬싱키 위원회 (#RMB-0452-15)의 승인을 받아 탯줄에서 혈액을 수집하는 데 정보에 입각한 동의를 요청받았습니다. 건강한 성인은 과학 헬싱키 위원회의 Weizmann 연구소의 지침에 따라 혈액을 수집하기 위해 자?...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

본 명세서에 제시된 배양 프로토콜은 E5.5에서 E11까지 최대 6일 동안 적절하고 지속적인 마우스 배아 발달 ex utero를 유지할 수 있다. 이전에는 이러한 발달 단계에 있는 배아가 짧은 기간 동안만 배양에서 정상적으로 개발할 수 있었습니다(최대 48h)15. 산소 농도 및 고압 가스 압력의 정밀한 제어를 위한 롤러 배양 인큐베이터에 가스 조절 모듈을 결합하는 것은 본 원에 기재?...

포유류 배아의 자궁 내 발달은 이식 후 발달의 초기 단계의 연구를 제한했다1,2. 개발 배아의 접근성은 동물 체형 계획의 수립, 세균 층의 사양 또는 조직 및 장기의 형성과 같은 자궁으로 배아 임플란트 후 발생하는 주요 발달 과정의 이해를 방해합니다. 더욱이, 초기 이식 후 배아의 아주 작은 크기는 E103 의 앞에 자궁에 있는 본질적인 화상 진찰에 의해 관찰하기 어렵게 만듭니다. 이 단계에서 살아있는 태아를 관찰하고 조작하는 무능력은 발달 도중 스냅샷에 초기 이식 후 배아 발생의 연구 연구를 제한했습니다.
전 이식 포유류 배아의 체외 배양을 위한 프로토콜은 잘 확립되고, 믿을 수 있고, 정기적으로 이용됩니다4. 그럼에도 불구하고, 적절한 포유류 이식 후 배아 성장을 지원할 수 있는 자궁 배양 시스템을 확립하려는 시도는 성공을 제한했다5. 종래의 정적 판에서 배아를 배양함으로써 100년 이상 다양한 배양 기술이 제안되어 왔으며, 주로 종래의 정적 플레이트6,7,8 또는 회전병(롤러 배양)5,9,10에서 배아를 배양함으로써 제안되었다. 이 플랫폼은 이식 후 포유류 개발에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 입증11,12, 정상적인 배아 생존을 위해 매우 비효율적이고 짧은 기간에 제한에도 불구하고. 배아는 문화 개시 후 24-48 h로 발달 지체 및 형태 학적 이상을 표시하기 시작했다.
본 연구는 사전 접종에서 최대 6일간의 고급 유기발생 단계로의 지속적인 발달을 허용하는 전 자궁 배아 배양 시스템을 설정하기 위한 상세한 설명을 제공한다13. 이 논문은 정전기 판및 롤러 배양 플랫폼에 문화를 결합하여 뒷다리 형성 단계(~E11)와 E5.5/E6.5로부터의 확장배양까지 E7.5 배아(신경판 및 헤드폴드 스테이지)의 성장을 지원하는 개선된 롤러 배양 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

이식 후 포유류 배아 배양 방법은 일반적으로 비효율적이고 자궁에서 해부 후 짧은 기간으로 제한되었습니다. 플랫폼은 최근에 향상된 유기발생까지 계란 실린더 단계에서 마우스 배아의 매우 강력하고 장기간 전 자궁 배양을 위해 개발되었습니다. 이러한 플랫폼은 뒷두개 형성 단계(E11)까지 배아(E5.5)를 예식하는 적절하고 충실한 개발을 가능하게 한다. 늦은 가스루 배아(E7.5)는 이러한 설정에서 회전병에서 재배되는 반면, 예기 단계(E5.5 또는 E6.5)에서 확장된 배양은 정적 및 회전 병 배양의 조합을 필요로 한다. 또한, O2 및 CO2 농도, 가스 압력, 포도당 수준 및 특정 전 자궁 배양 배지의 사용에 대한 민감한 조절은 적절한 배아 발달에 매우 중요하다. 여기서, 확장된 전자궁 마우스 배아 배양을 위한 상세한 단계별 프로토콜이 제공된다. 기체에서 유기발생에 이르는 정상 마우스 배아 전 자궁 을 성장시키는 능력은 배아 발달 중 다른 실험적 동요의 효과를 특성화하기 위한 귀중한 도구를 나타낸다.

E7.5 배아(후기 위화 단계)에 대해 설명된 롤러 배양 조건은 4배양일 후 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다(그림 2 및 표 1). 배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다를 수 있지만 일관되게 견고합니다(그림 2C). HCS 대신 HBS를 사용하면 마우스의 유전적 배경에 따라 4일간의 자궁 배양 ?...

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Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

전체 배아 배양을 위한 향상된 플랫폼은 사전 배기 단계부터 고급 유기발생까지 최대 6일 동안 이식 후 마우스 배아의 연속적이고 강력한 전자궁 개발을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 정적 플레이트와 회전 병 시스템을 사용하여 성공적인 배아 배양을 위한 표준 절차를 자세히 설명합니다.

엑스 우테로 사전 배후에서 고급 유기발생에 이르는 마우스 배아의 배양

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

이 방법은 포유류의 형성을 따라 가스를 이해하는 데 기본이 될 것입니다. 모성 자궁 안쪽에 오랫동안 숨겨져 있던 배아 단계 도중 살아있는 태아에 있는 실험을 허용해서. 그것은 최대 6 일의 연장된 기간 동안 자궁 외부 마우스 태아의 효율적이고 적당한 성장을 계속합니다.가스 농도 와 압력의 신속하고 적절한 배아 해부 및 선기량은 성공적인 배아 성장을위한 가장 중요한 단계입니다. 7.5일 이상 진행된 마우스 배아를 배양하기 시작하려면 배아 해부 전에 최소 1시간 동안 롤러 배양 인큐베이터 시스템의 회전기 및 가열 장치를 켭니다. 또한 가스 입구 병과 출구 테스트 튜브에 오토클레이브 물을 추가합니다.다음으로, 메인 스위치를 눌러 가스 레귤레이터 모듈을 켜고, 각 컨트롤러를 사용하여 산소 및 이산화탄소 값을 5%로 설정하고 압력 송신기의 전압 스위치를 이동하여 가스 압력을 평방 인치당 약 6.5~7파운드로 설정합니다. 디지털 압력 게이지를 사용하여 가스 압력 값을 확인합니다. 정밀 인큐베이터 내부에 할당된 출구 수충전 테스트 튜브 내부에서 생성된 기포의 속도를 확인하여 가스 흐름을 모니터링합니다.물병 뚜껑에 가스 흐름 밸브를 닫거나 열어 적절한 거품 속도를 설정합니다. 가스 흐름이 초당 2~4개의 거품 속도로 기포를 형성할 수 있도록 하거나 거품이 가득 찬 출구 튜브에 나오는 첫 번째 지점에서 거품 흐름을 설정할 수 있는지 확인합니다. 다음으로, 배양 배지의 2 밀리리터로 배양 병을 채웁니다.속이 빈 실리콘 번그를 사용하여 병을 밀봉하고 1 시간 동안 미리 평형하기 위해 속이 빈 회전 드럼에 연결합니다. 솔리드 번그를 사용하여 회전 드럼의 빈 공간을 밀봉상태로 유지합니다. 다음으로, 안락사 된 임신 한 여성 마우스에서 배아를 해부.70%에탄올로 복부를 청소하고 가위를 사용하여 피부와 복부를 잘라냅니다. 자궁의 한쪽 끝을 찾아 난소와 자궁 사이의 교차점에 잘라. 다른 쪽 끝까지 자궁을 따라 절단을 계속하고 DPBS로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시로 전송합니다.DPBS의 개념을 신속하게 세척하고 쌍으로 잘라 배아 처리를 용이하게합니다. 모든 개념 쌍을 60mm 페트리 접시에서 미리 평형된 해부 배지로 이동한 다음 개별 개념으로 잘라냅니다. 다음으로, 한 쌍의 총 집게를 사용하여 자궁 조직을 찢어 개념의 자궁 벽을 제거한 다음 미세한 미세 수술 용 집게를 사용하여 배 모양데시두아의 끝을 자른다.긴 축에 평행배 옆에 있는 집게를 삽입하고 집게를 열어 데시두아를 반으로 나눕다. 마지막으로, 미세 한 집게를 사용 하 여, 데시두아에서 배아를 잡고 태아에서 정수리 노른자 자루를 껍질, 계란 실린더에 부착 된 그대로 ectoplacental 콘을 떠나. 에피블라스트에 손상을 보이지 않는 신경판 또는 초기 헤드 폴드 스테이지에서 배아를 선택합니다.병당 5~6개의 선택된 배아를 미리 평형유리 배양병으로 옮기고 회전 배양 시스템에 병을 섭씨 37도, 산소 5%와 이산화탄소 5%의 대기로 배치한다. 배양 배양 소회 및 조기 위질 배아 및 정적 플레이트에, 8 웰 플레이트의 각 우물에 갓 준비 된 전 자궁 배아 배양 배지의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 이산화탄소 인큐베이터 내부에 플레이트를 37도의 섭씨로 배치하여 사전 평형을 제공합니다.이전에 입증된 바와 같이 자궁에서 배아를 해부한 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 8웰 플레이트의 각 우물로 개별 배아를 옮기고 37°C에서 5%의 이산화탄소로 인큐베이터 내부에 플레이트를 배치한다. 스테레오 현미경으로 배아를 이미지하고 명백한 손상없이 라이처트의 멤브레인없이 잘 형성 된 양수 공동을 가진 사람들만 배양을 선택합니다. 7.5일 전배아에 대한 이 프로토콜에 기재된 롤러 배양 조건은 4배양일 후에 평균 효율이 75%에 가까운 일정하고 정상적인 배아 성장을 지원합니다.배아 발달의 효율성은 다양한 마우스 유전 배경에 따라 다르지만 일관되게 견고합니다. HCS 대신 HBS를 사용하면 4일간의 문화가 발생한 후 약 68%의 효율을 얻을 수 있습니다. 6.5 배아와 정적 플레이트의 발달은 HCS와 HBS를 모두 가진 전 자궁 배아 배양 배지를 사용하여 90% 이상의 효율로 올바르게 재구성됩니다.배아를 예식하는 것에서 시작하여 배아의 46%의 효율을 초기 소미트 단계에 표시하고 배아의 거의 17%는 문화의 6 일 후에 적당한 발달을 완료합니다. 형태 발생 및 조직 개발은 42 개의 소미트까지 제대로 진행됩니다. 배아일 7.5, 6.5 및 5.5로부터 시작된 배아배에서 관찰된 대표적인 발달 결함이 여기에 나와 있다.에피블라스트 또는 라이허트의 막을 유지하는 배아에 경미한 손상을 입은 배아는 버려야 합니다. 초기 배아는 제대로 성장하지 않거나 심한 발달 지연을 표시하지 않을 것이며, 플레이트 표면에 배아 에피블라스트를 부착하면 추가 배아 발달의 실패가 발생할 수 있습니다. 결함이 있는 태아에서 관찰되는 주요 이상은 신경 주름의 성장에 있는 노른자 자루 또는 결점 외부의 후방 영역의 발달입니다.5.5일 령 배아로부터 개발된 배양에서 발달 결함은 작고 저개발 된 에피블라스트의 존재가 빈번히 관찰된다. 이 방법을 사용하여, 연구원은 이식 한 후 배아를 개발하는 물리적 또는 화학 적 조작의 다양한 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 조작, 세포 이식 또는 혈통 추적.이 방법은 이식 후 마우스를 연구하는 방법을 매우 자세하게 개발할 뿐만 아니라 인간과 같은 다른 종의 배아에서 유사한 배양 방법을 구현할 수 있는 길을 열어줍니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

최적화<em&gt; 전 비켜</em&gt; 개발의 고급 단계에 병아리 배아의 배양

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

연구

발생학

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

인두 아치 전의 VIVO 문화는 심장과 근육 전구 세포와 그 틈새를 연구

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

마우스 Preimplantation 배아에서 줄기 세포 라인의

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...