Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
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Este trabajo fue financiado por Pascal e Ilana Mantoux; Consejo Europeo de Investigación (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Consejo de Investigación Médica de Auxiliares de Vuelo (FAMRI); Cátedra del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel (ICRF), BSF, Instituto Helen y Martin Kimmel para la Investigación de Células Madre, Premio Helen y Martin Kimmel a la Investigación Innovadora; Israel Science Foundation (ISF), Minerva, el Sherman Institute for Medicinal Chemistry, Nella and Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, David and Fela Shapell Family Center for Genetic Disorders Research, Kekst Family Institute for Medical Genetics, Dr. Beth Rom-Rymer Stem Cell Research Fund, Edmond de Rothschild Foundations, Zantker Charitable Foundation, Estate of Zvia Zeroni.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Protección Animal del Instituto Weizmann de Ciencia y fueron aprobados por el IACUC pertinente del Instituto Weizmann (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Se pidió a las mujeres embarazadas sanas que dieran su consentimiento informado para recolectar sangre de su cordón umbilical, según lo aprobado por el Comité del Centro Médico Rambam Helsinki (#RMB-0452-15). A los adultos sanos se les pidió su consentimiento informado para que...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. 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(90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

El protocolo de cultivo presentado aquí puede mantener un desarrollo embrionario de ratón adecuado y continuo ex utero durante un máximo de seis días, desde E5.5 hasta E11. Anteriormente, los embriones en estas etapas de desarrollo podían desarrollarse normalmente en cultivo solo por períodos cortos (hasta 48 h)15. El acoplamiento del módulo de regulación de gas a la incubadora de cultivo de rodillos para un control preciso de la concentración de oxígeno y la presión de gas hip...

El desarrollo intrauterino del embrión de mamífero ha limitado el estudio de las primeras etapas del desarrollo postimplantacional1,2. La inaccesibilidad del embrión en desarrollo dificulta la comprensión de los procesos clave de desarrollo que ocurren después de que el embrión se implanta en el útero, como el establecimiento del plan corporal animal, la especificación de las capas germinales o la formación de tejidos y órganos. Además, el tamaño muy pequeño del embrión postimplantado temprano dificulta la observación por imágenes intravitales en el útero antes de E103. La incapacidad de observar y manipular embriones vivos en estas etapas ha restringido el estudio de la embriogénesis postimplantacional temprana a instantáneas durante el desarrollo.
Los protocolos para el cultivo in vitro de embriones de mamíferos preimplantacionales están bien establecidos, son confiables y se utilizan regularmente4. Sin embargo, los intentos de establecer sistemas de cultivo ex utero capaces de soportar el crecimiento adecuado de embriones postimplantacionales de mamíferos tuvieron un éxito limitado5. Desde hace más de un siglo se han propuesto diversas técnicas de cultivo, principalmente mediante el cultivo de los embriones en placas estáticas convencionales6,7,8 o botellas giratorias (cultivos con rodillos)5,9,10. Estas plataformas demostraron ser útiles para ampliar el conocimiento sobre el desarrollo de los mamíferos después de la implantación11,12, a pesar de ser altamente ineficientes para la supervivencia embrionaria normal y limitadas a períodos cortos. Los embriones comenzaron a mostrar retraso en el desarrollo y anomalías morfológicas tan pronto como 24-48 h después del inicio del cultivo.
Este estudio proporciona una descripción detallada para configurar el sistema de cultivo embrionario ex utero que permite el desarrollo continuo desde la pregastrulación hasta las etapas avanzadas de organogénesis durante hasta seis días de desarrollo postimplantacional13. Este artículo describe el protocolo mejorado de cultivo de rodillos que apoya el crecimiento de embriones E7.5 (placa neural y etapa de pliegue de la cabeza) hasta la etapa de formación de la extremidad posterior (~ E11) y el cultivo extendido de E5.5 / E6.5 mediante la combinación de cultivo en placas estáticas y plataformas de cultivo de rodillos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

Los métodos de cultivo de embriones de mamíferos postimplantación han sido generalmente ineficientes y limitados a breves períodos después de la disección fuera del útero. Recientemente se han desarrollado plataformas para el cultivo ex utero altamente robusto y prolongado de embriones de ratón desde las etapas de cilindro de huevo hasta la organogénesis avanzada. Estas plataformas permiten un desarrollo adecuado y fiel de embriones pregastrulantes (E5.5) hasta la etapa de formación del miembro posterior (E11). Los embriones de gastrulación tardía (E7.5) se cultivan en botellas giratorias en estos entornos, mientras que el cultivo extendido de las etapas de pregastrulación (E5.5 o E6.5) requiere una combinación de cultivos de botellas estáticas y giratorias. Además, la regulación sensible de la concentración de O2 y CO2 , la presión del gas, los niveles de glucosa y el uso de un medio de cultivo ex utero específico son críticos para el desarrollo adecuado del embrión. Aquí, se proporciona un protocolo detallado paso a paso para el cultivo extendido de embriones de ratón ex útero. La capacidad de cultivar embriones de ratón normales ex utero desde la gastrulación hasta la organogénesis representa una herramienta valiosa para caracterizar el efecto de diferentes perturbaciones experimentales durante el desarrollo embrionario.

Las condiciones de cultivo con rodillos descritas para embriones E7.5 (etapa de gastrulación tardía) apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia promedio cercana al 75% después de 4 días de cultivo (Figura 2 y Tabla 1). La eficiencia del desarrollo embrionario puede variar entre diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta (Figura 2C). La suplementación con HBS en lugar de HCS prod...

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Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Una plataforma mejorada para el cultivo de embriones enteros permite el desarrollo continuo y robusto ex utero de embriones de ratón postimplantación durante un máximo de seis días, desde las etapas de pregastrulación hasta la organogénesis avanzada. En este protocolo, detallamos el procedimiento estándar para el cultivo exitoso de embriones utilizando placas estáticas y sistemas de botellas giratorias.

Ex Utero Cultivo de embriones de ratón desde la pregastrulación hasta la organogénesis avanzada

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Este método será fundamental para entender la gastrulación a lo largo de una formación en mamíferos. Al permitir la experimentación en embriones vivos durante etapas embrionarias que durante mucho tiempo han estado ocultos dentro del útero materno. Permite, continúa el crecimiento eficiente y apropiado de embriones de ratón fuera del útero durante un período prolongado de hasta 6 días.La disección embrionaria rápida y adecuada y la pregastrulación de la concentración y presión del gas son los pasos más críticos para el crecimiento exitoso del embrión. Para comenzar a cultivar embriones de ratón de 7,5 días de edad o más avanzados, encienda el rotador y la unidad de calentamiento del sistema de incubadora de cultivo con rodillos durante al menos 1 hora antes de las disecciones embrionarias. Además, agregue agua en autoclave a la botella de entrada de gas y al tubo de ensayo de salida.A continuación, encienda el módulo regulador de gas presionando el interruptor principal, luego use los controladores respectivos para establecer los valores de oxígeno y dióxido de carbono en 5% Abra el regulador de gas y mueva el interruptor de voltaje en el transmisor de presión para establecer la presión de gas a aproximadamente 6.5 a 7 libras por pulgada cuadrada. Confirme el valor de la presión del gas mediante un manómetro digital. Controle el flujo de gas comprobando la tasa de burbujas creadas dentro del tubo de ensayo lleno de agua de salida asignado dentro de la incubadora de precisión.Ajuste la velocidad de burbuja adecuada cerrando o abriendo la válvula de flujo de gas en la tapa de la botella de agua. Asegúrese de que el flujo de gas permita la formación de burbujas a una velocidad de 2 a 4 burbujas por segundo o establezca el flujo de burbujas en el primer punto donde el burbujeo sale al tubo de salida lleno de agua. A continuación, llene las botellas de cultivo con 2 mililitros de medio de cultivo.Use los tapones de silicio ahuecados para sellar las botellas y conéctelos al tambor giratorio hueco para un preequilibrio durante 1 hora. Mantenga los espacios vacíos en el tambor giratorio sellados con los bungs sólidos. A continuación, diseccionar los embriones de una ratón hembra embarazada sacrificada.Limpie el abdomen con etanol al 70% y corte la piel y la pared abdominal con tijeras. Localice un extremo del útero y corte en la intersección entre el ovario y el útero. Continúe cortando a lo largo del útero hasta el otro extremo y transfiéralo a una placa de Petri de 100 milímetros llena de DPBS.Lave rápidamente los conceptos en DPBS y córtelos en pares para facilitar el manejo de embriones. Mueva todos los pares de conceptuses a un medio de disección preequilibrado en una placa de Petri de 60 milímetros, luego corte en los conceptuses individuales. A continuación, usando un par de fórceps gruesos, retire la pared uterina de los conceptuses rasgando el tejido uterino, luego usando fórceps microquirúrgicos finos, corte la punta de la decidua en forma de pera.Inserte los fórceps junto al embrión paralelos a su eje largo y abra los fórceps para dividir la decidua en mitades. Finalmente, usando fórceps finos, agarre el embrión de la decidua y pele el saco de yema parietal del embrión, dejando el cono ectoplacentario intacto unido al cilindro del huevo. Seleccione los embriones en la placa neural, o etapa temprana del pliegue de la cabeza, que no muestran daño en el epiblasto.Transfiera de 5 a 6 embriones seleccionados por botella a las botellas de cultivo de vidrio preequilibradas y coloque las botellas en el sistema de cultivo rotativo a 37 grados centígrados, en una atmósfera de 5% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Para cultivar embriones y placas estáticas de pregastrulación y gastrulación temprana, agregue 250 microlitros de medio de cultivo de embriones exuterino recién preparado a cada pocillo de una placa de 8 pocillos. Coloque las placas dentro de una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados Celsius para el pre-equilibrio.Después de diseccionar los embriones fuera del útero como se demostró anteriormente, transfiera los embriones individuales a cada pozo de la placa de 8 pocillos usando una micro pipeta y coloque la placa dentro de la incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Tome una imagen de los embriones bajo un microscopio estereoscópico y seleccione para el cultivo solo aquellos con una cavidad amniótica bien formada sin daño evidente y sin la membrana de Reichert. Las condiciones de cultivo con rodillos descritas en este protocolo para embriones de 7,5 días de edad apoyan un crecimiento embrionario constante y normal con una eficiencia media cercana al 75% después de 4 días de cultivo.La eficiencia del desarrollo embrionario varía a través de diversos antecedentes genéticos de ratón, pero es consistentemente robusta. La suplementación con HBS en lugar de HCS produce una eficiencia de aproximadamente el 68% después de 4 días de cultivo. El desarrollo de 6,5 embriones y placas estáticas se recapitula correctamente con una eficiencia de más del 90% utilizando medio de cultivo embrionario ex-útero con HCS y HBS.Los cultivos a partir de embriones pregastrulantes muestran una eficiencia del 46% del desarrollo adecuado hasta la etapa temprana de somita y casi el 17% de los embriones completan el desarrollo adecuado después de 6 días de cultivo. La morfogénesis y el desarrollo tisular proceden adecuadamente hasta 42 somitas. Aquí se muestran los defectos de desarrollo representativos observados en embriones para cultivos iniciados a partir del día embrionario 7.5, 6.5 y 5.5.Los embriones con daños menores en el epiblasto o los embriones que retienen la membrana de Reichert deben descartarse. Los embriones tempranos no crecerán adecuadamente o mostrarán retrasos severos en el desarrollo, mientras que la unión del epiblasto embrionario a la superficie de la placa causará el fracaso de un mayor desarrollo embrionario. Las principales anomalías observadas en embriones defectuosos son el desarrollo de la región posterior fuera del saco vitelino o defectos en el crecimiento de los pliegues neurales.En cultivos desarrollados a partir de embriones de 5,5 días de edad se observan con frecuencia un defecto de desarrollo es la presencia de un epiblasto pequeño y subdesarrollado. Usando este método, los investigadores pueden realizar una variedad de manipulaciones físicas o químicas en el desarrollo de embriones postimplantados. Por ejemplo, manipulación, trasplante celular o rastreo de linaje.Este método no solo allana el camino para estudiar el desarrollo postimplantacional de ratón con gran detalle, sino también para implementar métodos de cultivo similares en embriones de otras especies, como el humano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimizado<em&gt; Ex-ovo</em&gt; El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Investigación

Biología del Desarrollo

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

En Utero Inyecciones intra-cardiaca-lectina de tomate en embriones de ratón para medir el flujo sanguíneo renal

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culturas Upright Gotita de enteros fetales Órganos para estudiar los procesos de desarrollo durante Ratón Organogénesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Endodérmico primario de células epiteliales Cultura de la membrana del saco vitelino de embriones de codorniz japonesa

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Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivación de líneas de células madre de embriones de preimplantación de ratón

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de células madre originales adiposas de raíz de la cresta neuronal del tejido adiposorio

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

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