Name: ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis
Uploaded: 2021-10-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Bu çalışma Pascal ve Ilana Mantoux tarafından finanse edildi; Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-CoG-2016 726497-Cellnaivety); Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Konseyi (FAMRI); İsrail Kanser Araştırma Fonu (ICRF) profesörlüğü, BSF, Helen ve Martin Kimmel Kök Hücre Araştırmaları Enstitüsü, Helen ve Martin Kimmel Yenilikçi Araştırma Ödülü; İsrail Bilim Vakfı (ISF), Minerva, Sherman Tıbbi Kimya Enstitüsü, Nella ve Leon Benoziyo Nörolojik Hastalıklar Merkezi, David ve Fela Shapell Genetik Bozukluklar Araştırma Merkezi, Kekst Aile Tıbbi Genetik Enstitüsü, Dr. Beth Rom-Rymer Kök Hücre Araştırma Fonu, Edmond de Rothschild Vakıfları, Zantker Hayır Kurumu, Zvia Zeroni Mülkü.

Tüm hayvan deneyleri Weizmann Bilim Enstitüsü Hayvan Koruma Yönergelerine göre gerçeklendi ve ilgili Weizmann Enstitüsü IACUC tarafından onaylandı (#01390120-1, 01330120-2, 33520117-2). Sağlıklı hamile kadınlardan, Rambam Tıp Merkezi Helsinki Komitesi (#RMB-0452-15) tarafından onaylandığı gibi göbek kordonlarından kan toplamak için bilgilendirilmiş onay vermeleri istendi. Sağlıklı yetişkinlerden, Weizmann Bilim Enstitüsü Helsinki Komitesi'nin (#1566-3) yönergelerine göre kan toplanması iç...

<ol>
	<li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-embryo+culture+and+the+study+of+mammalian+embryos+during+organogenesis.">Whole-embryo culture and the study of mammalian embryos during organogenesis.</a> Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 53 (1), 81-122 (1978).</li><li>Tam, P. P., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+gastrulation:+the+formation+of+a+mammalian+body+plan.">Mouse gastrulation: the formation of a mammalian body plan.</a> Mechanisms of Development. 68 (1-2), 3-25 (1997).</li><li>Huang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+mouse+embryos.">Intravital imaging of mouse embryos.</a> Science. 368 (6487), 181-186 (2020).</li><li>White, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+binding+of+Sox2+to+DNA+predicts+cell+fate+in+the+four-cell+mouse+embryo.">Long-lived binding of Sox2 to DNA predicts cell fate in the four-cell mouse embryo.</a> Cell. 165 (1), 75-87 (2016).</li><li>Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postimplantation+mouse+development:+whole+embryo+culture+and+micro-manipulation.">Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).</li><li>Nicholas, J. S., Rudnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+rat+embryos+in+tissue+culture.">The development of rat embryos in tissue culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 20 (12), 656-658 (1934).</li><li>New, D. A., Stein, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+of+mouse+embryos+in+vitro.">Cultivation of mouse embryos in vitro.</a> Nature. 199, 297-299 (1963).</li><li>Rivera-P&#233;rez, J. A., Jones, V., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+whole+mouse+embryos+at+early+postimplantation+to+organogenesis+stages:+developmental+staging+and+methods.">Culture of whole mouse embryos at early postimplantation to organogenesis stages: developmental staging and methods.</a> Methods in Enzymology. 476, 185-203 (2010).</li><li>New, D. A. T., Coppola, P. T., Terry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+explanted+rat+embryos+in+rotating+tubes.">Culture of explanted rat embryos in rotating tubes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 35 (1), 135-138 (1973).</li><li>Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+and+historical+review+of+culture+methods+for+vertebrates.">A comparative and historical review of culture methods for vertebrates.</a> International Journal of Developmental Biology. 41 (12), 127-137 (1997).</li><li>Parameswaran, M., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regionalisation+of+cell+fate+and+morphogenetic+movement+of+the+mesoderm+during+mouse+gastrulation.">Regionalisation of cell fate and morphogenetic movement of the mesoderm during mouse gastrulation.</a> Developmental Genetics. 17 (1), 16-28 (1995).</li><li>Beddington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+second+neural+axis+by+the+mouse+node.">Induction of a second neural axis by the mouse node.</a> Development. 120 (3), 613-620 (1994).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+suitable+for+mammalian+whole+embryo+culture.">Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51969 (2014).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+manipulation+of+postimplantation+embryos.">Isolation, culture and manipulation of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual. , 149-193 (2014).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Development, Growth and Differentiation. 50 (6), 485-497 (2008).</li><li>Mathieu, J., Ruohola-Baker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+remodeling+during+the+loss+and+acquisition+of+pluripotency.">Metabolic remodeling during the loss and acquisition of pluripotency.</a> Development. 144 (4), 541-551 (2017).</li><li>Sturm, K., Tam, P. P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+whole+postimplantation+embryos+and+germ+layer+derivatives.">Isolation and culture of whole postimplantation embryos and germ layer derivatives.</a> Methods in Enzymology. 225, 164-190 (1993).</li></ol>

Burada sunulan kültür protokolü, E5.5'ten E11'e kadar altı güne kadar uygun ve sürekli fare embriyosu geliştirme ex uterosunu sürdürebilir. Daha önce, bu gelişim aşamalarında embriyolar kültürde sadece kısa süreler için (48 saate kadar) normal olarak gelişebilirdi 15. Gaz regülasyon modülünün oksijen konsantrasyonunun ve hiperbarik gaz basıncının hassas kontrolü için silindir kültürü inkübatörüne kaplanması, burada açıklanan uygun fare embriyo kültür...

Memeli embriyosunun intrauterin gelişimi postimplantasyon gelişiminin erken evrelerinin incelenmesini sınırlamıştır1,2. Gelişmekte olan embriyonun erişilemezliği, embriyo uterusa implante ettikten sonra meydana gelen hayvan vücut planının oluşturulması, mikrop katmanlarının belirtimi veya doku ve organların oluşumu gibi temel gelişimsel süreçlerin anlaşılmasını engeller. Ayrıca erken postimplane embriyonun çok küçük olması E103 öncesi rahim içi görüntüleme ile gözlem yapmayı zorlaştırır. Bu aşamalarda canlı embriyoların gözlemlenememesi ve manipüle edilmesi, erken postimplantasyon embriyogenezinin çalışmasını gelişim sırasında anlık görüntülerle kısıtlamıştır.
Preimplantasyon memeli embriyolarının in vitro kültürü için protokoller iyi kurulmuş, güvenilir ve düzenli olarak kullanılmaktadır4. Bununla birlikte, uygun memeli postimplantasyon embriyo büyümesini destekleyebilen ex utero kültür sistemleri kurma girişimleri sınırlı başarıya sahipti5. Bir asırdan fazla bir süredir, embriyoların geleneksel statik plakalarda 6,7,8 veya dönen şişelerde (silindir kültürleri)5,9,10 kült haline getirildiği için çeşitli kültür teknikleri önerilmiştir. Bu platformlar, normal embriyo sağkalımında oldukça verimsiz olmasına ve kısa sürelerle sınırlı olmasına rağmen, implantasyondan sonra memeli gelişimi hakkındaki bilginin genişletilmesinde yardımcı olduğunu kanıtladı11,12. Embriyolar kültüre başladıktan sonra 24-48 saat gibi erken bir sürede gelişim geriliği ve morfolojik anomaliler göstermeye başladı.
Bu çalışma, pregastrülasyondan ileri organogenez evrelerine kadar altı güne kadar postimplantasyon gelişimine kadar sürekli gelişime izin veren ex utero embriyo kültür sistemini kurmak için ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır13. Bu makalede, E7.5 embriyolarının (sinir plakası ve baş kat aşaması) arka ekskülasyon aşamasına (~E11) kadar büyümesini destekleyen geliştirilmiş silindir kültürü protokolü ve kültürü statik plakalar ve silindir kültürü platformlarında birleştirerek E5.5/E6.5'ten genişletilmiş kültür açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size filter (250 mL)</td>
			<td>JetBiofil</td>
			<td>FCA-206-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m pore size syringe PVDF filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well &#181;-plates glass bottom/ibiTreat</td>
			<td>iBidi</td>
			<td>80827/80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle with adaptor cap for gas inlet</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Hole)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 06</td>
			<td>Used to seal the bottles to the drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bungs (Solid)</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 07</td>
			<td>Used to seal the rotating drum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture bottles</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC 03/BTC 04</td>
			<td>Either Glass Bottles (Small) BTC 03 or Glass Bottles (Large) BTC 04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-glucose Monohydrate</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10100-30/45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>Shanghai Benxu Electronics Technology co. Ltd</td>
			<td>BX-DPG80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>02-020-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>04-013-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas regulation module</td>
			<td>Arad Technologies</td>
			<td>HannaLab1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>35050061</td>
			<td>glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15630056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgical forceps (Dumont #5, #55)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (glass)</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (plastic)</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>SO P12201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes (60 mm and 100 mm)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007/351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision incubator system</td>
			<td>B.T.C. Engineering, Cullum Starr Precision Engineering</td>
			<td>BTC01</td>
			<td>BTC01 model with gas bubbler kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-coagulant sterile test tubes (5 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>#456005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat whole embryo culture serum</td>
			<td>ENVIGO Bioproducts</td>
			<td>B-4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope equipped with heating plate</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes (5, 10 ml) for sera filtration</td>
			<td>Pic Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero culture of mouse embryos from pregastrulation to advanced organogenesis

Postimplantasyon memeli embriyo kültürü yöntemleri genellikle verimsiz ve rahim dışı diseksiyon sonrası kısa sürelerle sınırlı olmuştur. Platformlar son zamanlarda yumurta silindir aşamalarından ileri organogenez kadar fare embriyolarının son derece sağlam ve uzun süreli ex utero kültürü için geliştirilmiştir. Bu platformlar, öngaztasyon embriyolarının (E5.5) arka ekstremite oluşum aşamasına (E11) kadar uygun ve sadık gelişimini sağlar. Geç gastrulating embriyoları (E7.5) bu ortamlarda dönen şişelerde yetiştirilirken, pregastrülasyon aşamalarından (E5.5 veya E6.5) genişletilmiş kültür statik ve dönen şişe kültürlerinin bir kombinasyonunu gerektirir. Ek olarak, O2 ve CO2 konsantrasyonunun hassas düzenlenmesi, gaz basıncı, glikoz seviyeleri ve belirli bir ex utero kültür ortamının kullanımı uygun embriyo gelişimi için kritik öneme sahiptir. Burada, genişletilmiş ex utero fare embriyo kültürü için ayrıntılı bir adım adım protokol sağlanmaktadır. Normal fare embriyolarının gastrülasyondan organogeneze kadar ekstresini yetiştirme yeteneği, embriyonik gelişim sırasında farklı deneysel pertürbasyonların etkisini karakterize etmek için değerli bir aracı temsil eder.

E7.5 embriyoları için tanımlanan silindir kültürü koşulları (geç gastrülasyon evresi) 4 kültür gününden sonra ortalama %75'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini destekler (Şekil 2 ve Tablo 1). Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişebilir, ancak sürekli olarak sağlamdır (Şekil 2C). HCS yerine HBS ile takviye, farelerin genetik arka planına bağlı olarak 4 günlük...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis at JoVE.com

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Tam embriyo kültürü için geliştirilmiş bir platform, pregastrülasyon aşamalarından ileri organogenezine kadar altı güne kadar postimplantasyon fare embriyolarının sürekli ve sağlam ekstre gelişimini sağlar. Bu protokolde statik plakalar ve dönen şişe sistemleri kullanılarak başarılı embriyo kültürü için standart prosedürü detaylandırıyoruz.

Ex Utero Pregastrülasyondan İleri Organogenez'e Fare Embriyolarının Kültürü

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

Bu yöntem, memelilerde bir oluşum boyunca gastrülasyonu anlamak için temel olacaktır. Uzun zamandır anne rahminin içine gizlenmiş embriyonik aşamalarda canlı embriyolarda deneylere izin vererek. Fare embriyolarının rahim dışında 6 güne kadar uzun bir süre boyunca verimli ve uygun bir şekilde büyümesine izin verir, devam eder.Gaz konsantrasyonu ve basıncının hızlı ve yeterli embriyo diseksiyonu ve pregastrülasyonu başarılı embriyo büyümesi için en kritik adımlardır. 7,5 günlük veya daha gelişmiş fare embriyolarını kültlüğe başlatmak için, embriyo diseksiyonlarından önce en az 1 saat boyunca roller kültür inkübatör sisteminin rotator ve ısıtma ünitesini açın. Ayrıca, gaz giriş şişesine ve çıkış test tüpüne otoklav suyu ekleyin.Ardından, ana anahtara basarak gaz regülatör modülünü açın, ardından oksijen ve karbondioksit değerlerini% 5'e ayarlamak için ilgili kontrolörleri kullanın Gaz regülatörünü açın ve gaz basıncını inç kare başına yaklaşık 6,5 ila 7 pounda ayarlamak için basınç vericislerindeki voltaj anahtarını hareket ettinin. Dijital basınç göstergesi kullanarak gaz basıncı değerini onaylayın. Hassas inkübatörün içine tahsis edilen çıkış suyu dolu test tüpünün içinde oluşturulan kabarcıkların oranını kontrol ederek gaz akışını izleyin.Su şişesinin kapağındaki gaz akış vanasını kapatarak veya açarak uygun kabarcık oranını ayarlayın. Gaz akışının saniyede 2 ila 4 kabarcık hızında kabarcık oluşumuna izin verdiğinden emin olun veya kabarcık akışını kabarcıklanmanın su dolu çıkış tüpüne çıktığı ilk noktada ayarlayın. Daha sonra, kültür şişelerini 2 mililitre kültür ortamı ile doldurun.Şişeleri kapatmak için oyulmuş silikon bung'ları kullanın ve 1 saat boyunca ön denge için oyulmuş dönen tambura takın. Dönen tamburdaki boş alanları katı maşalar kullanılarak kapalı tutun. Daha sonra, embriyoları ötenazili hamile bir kadın fareden parçalara ayrıştırın.Karnı % 70 etanol ile temizleyin ve makas kullanarak cildi ve karın duvarını kesin. Uterusun bir ucunun yerini bulun ve yumurtalık ile rahim arasındaki kavşakta kesin. Diğer uca kadar uterus boyunca kesmeye devam edin ve DPBS ile dolu 100 milimetre petri kabına aktarın.Kavramları DPBS'de hızlı bir şekilde yıkayın ve embriyo kullanımını kolaylaştırmak için çiftler halinde kesin. Tüm kavramsal çiftleri 60 milimetrelik bir Petri kabında önceden dengelenmiş diseksiyon ortamına taşıyın, ardından bireysel kavramsalları kesin. Daha sonra, bir çift brüt kümes gücü kullanarak, uterus dokusunu yırtarak kavramüslerin uterus duvarını çıkarın, ardından ince, mikrocerrahi tokmaklar kullanarak armut şeklindeki yaprak dökenin ucunu kesin.Uzun eksenine paralel olarak embriyonun yanına tokaları yerleştirin ve yaprak dökenleri yarıya bölmek için tokaları açın. Son olarak, ince tokalar kullanarak, embriyoyu yaprak dökenden kavrayın ve parietal yumurta sarısı çuvalını embriyodan soyun ve yumurta silindirine bağlı bozulmamış ektoplacental koniyi bırakın. Epiblastta hasar göstermeyen sinir plakasındaki veya erken kafa katlama aşamasındaki embriyoları seçin.Şişe başına seçilen 5 ila 6 embriyoyu önceden dengelenmiş cam kültür şişelerine aktarın ve şişeleri 37 santigrat derecede, % 5 oksijen ve% 5 karbondioksit atmosferinde dönen kültür sistemine yerleştirin. Pregastrülasyon ve erken gastrülasyon embriyolarını ve statik plakaları kültüre etmek için, 8 kuyu plakasının her kuyusuna 250 mikrolitre taze hazırlanmış ex-utero embriyo kültürü ortamı ekleyin. Plakaları ön denge için 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatörünün içine yerleştirin.Embriyoları daha önce gösterildiği gibi uterustan çıkardıktan sonra, bireysel embriyoları bir mikro pipet kullanarak 8 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübatörün içine yerleştirin. Embriyoları stereo mikroskop altında görüntüleyin ve kültür için sadece belirgin bir hasarı olmayan ve Reichert'in zarı olmadan iyi biçimlendirilmiş amniyotik boşluğa sahip olanları seçin. 7,5 günlük embriyolar için bu protokolde açıklanan silindir kültürü koşulları, 4 kültür gününden sonra ortalama %75'e yakın verimle sabit ve normal embriyo büyümesini desteklememektedir.Embriyo gelişiminin verimliliği çeşitli fare genetik geçmişlerine göre değişir, ancak sürekli olarak sağlamdır. HCS yerine HBS ile takviye, 4 günlük kültürden sonra yaklaşık% 68 verimlilik sağlar. 6.5 embriyo ve statik plaka gelişimi, hem HCS hem de HBS ile ex-utero embriyo kültürü ortamı kullanılarak% 90'dan fazla bir verimlilikle doğru bir şekilde yeniden özetlenmektedir.Pregastrulating embriyolardan başlayan kültürler, erken somit evresine doğru gelişimin% 46 verimliliğini gösterir ve embriyoların yaklaşık% 17'si 6 günlük kültürden sonra uygun gelişimi tamamlar. Morfogenez ve doku gelişimi 42 somite kadar düzgün ilerler. Embriyonik gün 7.5, 6.5 ve 5.5'ten itibaren başlatılan kültürler için embriyolarda gözlenen temsili gelişimsel kusurlar burada gösterilmiştir.Epiblastta küçük hasar olan embriyolar veya Reichert'in zarını tutan embriyolar atılmalıdır. Embriyonik epiblastın plaka yüzeyine bağlanması daha fazla embriyo gelişiminin başarısızlığa neden olurken, erken embriyolar düzgün büyümez veya ciddi gelişimsel gecikmeler göstermez. Kusurlu embriyolarda gözlenen başlıca anormallikler, yumurta sarısı çuvalı dışındaki arka bölgenin gelişmesi veya sinir kıvrımlarının büyümesindeki kusurlardır.5,5 günlük embriyolardan geliştirilen kültürlerde sıklıkla gözlenen gelişimsel kusur, küçük, az gelişmiş bir epiblast varlığıdır. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar implante sonrası embriyoların geliştirilmesinde çeşitli fiziksel veya kimyasal manipülasyonlar gerçekleştirebilmektedir. Örneğin, manipülasyon, hücresel transplantasyon veya soy izleme.Bu yöntem sadece çok ayrıntılı olarak gelişen fare post-implantasyonunun incelenmesinin değil, aynı zamanda insan gibi diğer türlerden embriyolarda benzer kültür yöntemlerinin uygulanmasının da önünü açmaktadır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Fare Embryolarının üzerinde Utero içi kardiyak Domates-lektin Enjeksiyonlar Renal Kan Akışı Ölçer için

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos

Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü

We established an endodermal epithelial cell culture model (EEC) for studying the function of certain enzymes and proteins in mediating nutrient ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Periaortik Yağ Dokusundan Nöral Adipoz-Türetilmiş Kök Hücrelerin İzolasyon, Kültür ve Adipojenik İndüksiyonu

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...