Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر LBH السابقين والحاليين الذين ساهموا في تطوير هذه التقنية. يتم دعم هذا المختبر من قبل NIH / NIDDK T32DK060445 (BEB) ، NIH / NIDDK F32DK121479 (BEB) ، NIH / NIGMS R01GM121389 (LBH). تم رسم الشكل 2 باستخدام برنامج Bionder.

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية في كلية بايلور للطب للتلاعب بالعينات البشرية. يتم التعامل مع عينات الدم باتباع إرشادات السلامة المؤسسية للعينات البشرية. يتم الحصول على عينات الدم في بنك دم إقليمي ، حيث يتم جمعها بمحلول سكر العنب فوسفات السترات (CPD). ومع...

<ol>
	<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer.">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).</li><li>Bol&#237;var, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspase+regulation:+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease.">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li><li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases:+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases.">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li><li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes.">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li><li>Vigan&#242;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes.">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761 (2015).</li><li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme.">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97 (1992).</li><li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome+activation+and+IL-1&#946;+and+IL-18+processing+during+infection.">Inflammasome activation and IL-1&#946; and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11.">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4.">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain:+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins.">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li><li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder.">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li><li>B&#252;rckst&#252;mmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome.">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling.">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS.">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li><li>Bol&#237;var, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1&#946;+Release+and+Cell+Death.">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1&#946; Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li><li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells.">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li><li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5.">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li><li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1&#946;+secretion+by+triggering+necrosis.">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1&#946; secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1813 (2015).</li><li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cells:+Isolation,+Freezing,+thawing,+and+culture.">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li><li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1+beta+maturation:+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin.">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li><li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mature+interleukin-1&#946;+(IL-1&#946;)+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1&#946;-converting+enzyme+processing.">Increased mature interleukin-1&#946; (IL-1&#946;) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1&#946;-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li><li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyroptosome:+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation.">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes.">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li><li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+Plasma+concentrations+of+hemopexin,+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases.">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1&#946;processing+in+monocytes.">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1&#946;processing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li><li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation.">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li><li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants:+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions.">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li><li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR/Cas9.">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).</li><li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+the+difference+between+CD80+and+CD86.">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li><li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+kinases+in+a+death+grip.">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول سير العمل للحصول على البلاعم من الخلايا الوحيدة المعزولة من عينات الدم البشرية وطريقة لإدخال مراسلي الكاسباز الالتهابي BiFC بكفاءة في MDM البشري دون المساس بصلاحية الخلايا وسلوكها.
يستفيد هذا البروتوكول من تقنية BiFC35 لوضع علامة على الكاسباس ال?...

ال caspases هي عائلة من بروتياز الأسبارتات السيستين التي يمكن تجميعها في كاسباس البادئ وكاسباس الجلاد. تتكون كاسباس الجلاد من كاسباز-3 و-6 و-7. توجد بشكل طبيعي في الخلايا على شكل دايمرات ويتم شقها بواسطة كاسباس البادئ لتنفيذ موت الخلايا المبرمج1. تشمل كاسباس المبادر كاسباز الإنسان -1 و -2 و -4 و -5 و -8 و -9 و -10 و -12. تم العثور عليها على أنها zymogens غير نشطة (pro-caspases) التي يتم تنشيطها عن طريق dimerization الناجم عن القرب وتثبيتها بواسطة الانقسام الذاتي للتحلل البروتيني 2,3. الكاسباس الالتهابي هو مجموعة فرعية من كاسباس البادئ 2 ويشمل كاسباز-1 و -4 و-5 و -12 في البشر ، و كاسباز-1 و -11 و -12 في الفأر 4,5. بدلا من دور الاستماتة ، فإنها تلعب دورا مركزيا في الالتهاب. إنها تتوسط في المعالجة البروتينية وإفراز pro-interleukin (IL)-1β و pro-IL-18 6,7 ، والتي تعد أول سيتوكينات يتم إطلاقها استجابة للغزاة المسببين للأمراض 8,9. يتم تنشيط Caspase-1 عند التوظيف في منصة التنشيط الخاصة به ؛ مركب بروتيني كبير الوزن الجزيئي يسمى الالتهاب (الشكل 1A)10. يحدث تعتيم كاسباز-4 و-5 و-11 بشكل مستقل عن هذه المنصات من خلال مسار التهابي غير قانوني11,12.
الالتهابات القانونية هي مجمعات بروتين متعددة الكريات الخلوية تتكون من بروتين استشعار ملتهب ، وبروتين محول ASC (بروتين يشبه البقع المرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD) ، والبروتين المستجيب caspase-110. أكثر الالتهابات القانونية دراسة جيدة هي عائلة المستقبلات الشبيهة ب NOD التي تحتوي على مجال البيرين (NLRP) و NLRP1 و NLRP3 ، وعائلة NLR التي تحتوي على CARD (NLRC) ، NLRC4 ، والغائبة في سرطان الجلد 2 (AIM2). يحتوي كل منها على مجال pyrin أو CARD أو كلا المجالين. يتوسط نطاق CARD التفاعل بين caspases المحتوية على CARD ومنشطات المنبع الخاصة بها. لذلك ، فإن جزيء السقالة ASC ، الذي يتكون من مجال pyrin N-terminal (PYD) وزخارف C-terminal CARD 13,14 ، مطلوب لتوظيف caspase-1 إلى NLRP110 و NLRP315 و AIM216 الالتهابات.
سمي كل ملتهب على اسم بروتين الاستشعار الفريد الذي يتعرف على المحفزات المؤيدة للالتهابات المتميزة (الشكل 1B). يطلق على منشطات هذا المسار المحفزات الأساسية. تعمل الالتهابات كأجهزة استشعار للمكونات الميكروبية وإجهاد الأنسجة ، وتتجمع لتحفيز استجابة التهابية قوية من خلال تنشيط الشذرات الالتهابية17. يبدأ تجميع Inflammasome تنشيط caspase-1 للتوسط في نضج وإفراز ركائزه الرئيسية المؤيدة ل IL-1β و pro-IL-18. تحدث هذه العملية عبر آلية من خطوتين. أولا ، ينظم الحافز التحضيري التعبير عن بعض البروتينات الالتهابية و pro-IL-1β من خلال تنشيط مسار NF-κB. ثانيا ، يحفز الحافز داخل الخلايا (الأساسي) على تجميع الالتهابات وتجنيد procaspase-1 6,7.
Caspase-4 و caspase-5 هي تقويم العظام البشري ل murine caspase-1111. يتم تنشيطها بطريقة مستقلة عن الالتهابات بواسطة عديد السكاريد الشحمي داخل الخلايا (LPS) ، وهو جزيء موجود في الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام18،19،20 ، وبواسطة الهيم خارج الخلية ، وهو نتاج انحلال الدم في خلايا الدم الحمراء 21. وقد اقترح أن LPS يرتبط مباشرة بفكرة CARD لهذه البروتينات ويحفز قلة القلة20. تنشيط caspase-4 أو caspase-5 يعزز إطلاق IL-1β عن طريق تحفيز شكل التهابي من موت الخلايا يسمى pyroptosis من خلال انقسام البروتين المكون للمسام gasdermin D (GSDMD) 18,19. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تدفق أيونات البوتاسيوم الناتجة عن كاسباز-4 والموت الحراري بوساطة GSDMD يحفز تنشيط الالتهاب NLRP3 والتنشيط اللاحق ل caspase-122,23. لذلك ، تعتبر caspase-4 و -5 و -11 أجهزة استشعار داخل الخلايا ل LPS قادرة على تحفيز pyroptosis وتنشيط caspase-1 استجابة لمحفزات محددة11,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> الشكل 1: كاسباس التهابي واختبار تكملة التألق ثنائي الجزيئية (BiFC) (A) رسم بياني يوضح نظام caspase-BiFC ، حيث يتم تجنيد اثنين من prodomains caspase-1 (C1-pro) مرتبطين بكل جزء غير فلورسنت من Venus (Venus-C أو Venus-N) إلى منصة تنشيط NLRP3 ، مما يجبر كوكب الزهرة على الارتداد والفلوريس. يظهر هذا المركب كبقعة خضراء تحت المجهر ويعمل كقراءة للقرب الناجم عن كاسباز الالتهابي ، وهي الخطوة الأولى في تنشيط كاسباز البادئ. (ب) مخطط يوضح تنظيم المجال للمكونات الالتهابية والكباسات الالتهابية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
من الصعب قياس تنشيط كاسباس البادئ المحدد ، ولا توجد العديد من الطرق المتاحة للقيام بذلك عن طريق أساليب التصوير. يمكن استخدام تكملة التألق ثنائي الجزيئية Caspase (BiFC) لتصور تنشيط كاسباز الالتهابي مباشرة في الخلايا الحية (الشكل 1A)25. وقد تم تكييف هذه التقنية مؤخرا لاستخدامها في البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM)21. يقيس Caspase BiFC الخطوة الأولى في تنشيط كاسباز الالتهابي ، القرب الناجم عن تسهيل التعتيم. يتم استخدام التعبير عن البلازميدات التي تشفر المجال الكاسبازي المحتوي على بطاقة والذي يندمج في شظايا غير فلورسنتية من البروتين الفلوري الأصفر القابل للتصوير Venus (Venus-C [VC]) و Venus-N [VN]). عندما يتم تجنيد اثنين من prodomains caspase إلى منصة التنشيط الخاصة بهم أو الخضوع للقرب المستحث ، يتم جلب نصفي كوكب الزهرة على مقربة وإجبارهم على الارتداد والفلوريس (انظر الشكل 1A ، B). هذا يوفر قراءة في الوقت الحقيقي لتنشيط كاسباز التهابي محدد.
يعبر MDM البشري بكثرة عن الجينات الالتهابية ومستقبلات التعرف على الأنماط التي تحدد إشارات الخطر ومنتجات مسببات الأمراض. وهذا يوفر نوعا مثاليا من الخلايا لاستجواب مسارات كاسباز الالتهابية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن اشتقاقها من الدم المحيطي وحتى من عينات المرضى لتقييم تنشيط كاسباز الالتهابي في حالة مرضية معينة. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال مراسلي كاسباز BiFC إلى MDM باستخدام nucleofection ، وهي طريقة نقل قائمة على الكهربية ، وكيفية علاج الخلايا للحث على تنشيط كاسباز التهابي ، وكيفية تصور مجمعات كاسباز النشطة باستخدام أساليب الفحص المجهري. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذه المنهجية لتحديد التركيب الجزيئي لهذه المجمعات ، والتوطين تحت الخلوي ، والحركيات ، وحجم هذه الهياكل عالية الترتيب25،26،27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

تشمل الكاسباس الالتهابية كاسباز-1 و-4 و-5 و-11 و-12 وتنتمي إلى المجموعة الفرعية من كاسباس البادئ. مطلوب Caspase-1 لضمان التنظيم الصحيح للإشارات الالتهابية ويتم تنشيطه عن طريق التثبيط الناجم عن القرب بعد التجنيد للالتهابات. Caspase-1 وفير في سلالة الخلايا الأحادية ويحفز نضج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات interleukin (IL)-1β و IL-18 إلى جزيئات إفرازية نشطة. الكاسباس الالتهابي الآخر ، caspase-4 و -5 (و caspase-11 المتجانسة الفئران) تعزز إطلاق IL-1β عن طريق تحفيز pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) هي أداة تستخدم لقياس القرب الناجم عن كاسباز الالتهابي كقراءة لتنشيط كاسباز. يندمج المجال الكاسبازي-1 أو -4 أو -5 ، الذي يحتوي على المنطقة التي ترتبط بالالتهاب ، مع شظايا غير فلورية من بروتين الفلورسنت الأصفر فينوس (Venus-N [VN] أو Venus-C [VC]) التي ترتبط بإصلاح مجمع الزهرة الفلوري عندما تخضع الكاسباس للقرب المستحث. يصف هذا البروتوكول كيفية إدخال هؤلاء المراسلين في البلاعم الأولية المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM) البشرية باستخدام النيوكليوفيكتيون ، وعلاج الخلايا للحث على تنشيط كاسباز الالتهابي ، وقياس تنشيط كاسباز باستخدام التألق والمجهر البؤري. ميزة هذا النهج هي أنه يمكن استخدامه لتحديد المكونات والمتطلبات وتوطين مجمع تنشيط كاسباز الالتهابي في الخلايا الحية. ومع ذلك ، يجب النظر في ضوابط دقيقة لتجنب المساس ببقاء الخلايا وسلوكها. هذه التقنية هي أداة قوية لتحليل تفاعلات كاسباز الديناميكية على مستوى الالتهاب وكذلك لاستجواب شلالات الإشارات الالتهابية في MDM الحية والخلايا الوحيدة المشتقة من عينات الدم البشرية.

يعطي المخطط الموضح في الشكل 2 نظرة عامة على كيفية الحصول على MDM البشري ونقله وتصويره. بعد حضانة الخلايا الوحيدة CD14 + المختارة مع GM-CSF لمدة 7 أيام ، يتغير مورفولوجيا الخلية على مدار فترة التمايز (الشكل 3A) ، والانتقال من خلايا التعليق الكروية إلى المغزل والمرتبط?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

يصف هذا البروتوكول سير العمل للحصول على البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية (MDM) من عينات الدم البشرية ، وهي طريقة بسيطة لإدخال مراسلي تكملة الفلور ثنائي الجزيئية (BiFC) بكفاءة إلى MDM البشري دون المساس بصلاحية الخلايا وسلوكها ، ونهج قائم على التصوير لقياس تنشيط كاسباز الالتهابي في الخلايا الحية.

تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لتصور واستجواب مسار كاسباز الالتهابي على المستوى الجزيئي في الخلايا الحية في حالة مرضية معينة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لتحديد المكونات والمتطلبات وتوطين مجمعات تنشيط كاسباز الالتهابية في الخلايا المناعية الأولية. مع التحسينات الطفيفة ، يمكن تكييف هذه الطريقة مع الخلايا الأولية الأخرى ومجموعة من البروتينات التي يتم تنشيطها عن طريق قلة القلة ، ولا يقتصر تطبيقها على المنهجيات المجهرية.أولا ، قم بشفط الوسائط من البلاعم المتمايزة تماما على أطباق 10 سم واغسل الطبقة الأحادية للخلية بوسط RPMI-1640 الدافئ الخالي من المصل ، وإزالة جميع الوسائط تماما. حصاد الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من محلول التربسين-EDTA الدافئ بنسبة 0.25٪ لكل طبق 10 سم. قم بسحب التربسين-EDTA بلطف لأعلى ولأسفل على الطبق بأكمله باستخدام ماصة دقيقة P-1000 ، ثم انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من وسط الثقافة الكاملة الدافئة.تحقق من انفصال الخلايا تحت مجهر حقل ساطع وافصلها مرة أخرى إذا لزم الأمر. شفط الوسط وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من 1X PBS معقمة قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية. ثم خذ 20 ميكرولتر أليكوت لتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الدم.خذ مرة إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل عملية نقل وضعها في أنبوب 15 ملليلتر. أحضر إلى الحجم النهائي من 15 ملليلتر مع PBS المعقم 1X المسخن مسبقا. قم بشفط PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة عند 250 × جم.قم بإزالة أي PBS متبقية من حبيبة الخلية باستخدام ماصة دقيقة P-200. خذ أنبوب ميكروبوبي معقم سعة 1.5 ملليلتر لكل عملية نقل وأضف بلازميدات المراسل وبلازميدات BiFC المناسبة في غطاء المحرك. ضع محطة الماصة والجهاز والنصائح وأنابيب الكهربية والماصة في غطاء تدفق صفائحي معقم.قم بتوصيل وتشغيل جهاز nucleofection. أدخل معلمات التحويل في شاشة بدء التشغيل المعروضة. اضغط على الجهد ، وأدخل 1000 ، واضغط على تم لضبطه على 1000 فولت.اضغط على العرض، وأدخل 40، واضغط على تم لضبط النبض على 40 مللي ثانية. أخيرا ، اضغط على Pulses ، وأدخل 2 ، واضغط على Done لتعيين عدد النبضات الكهربائية إلى 2. خذ أحد أنابيب الكهربية واملأه بثلاثة ملليلتر من العازل الكهربائي E في درجة حرارة الغرفة.أدخل أنبوب الكهربية في حامل الماصة في محطة الماصة، مما يضمن أن القطب الكهربائي الموجود على جانب الأنبوب مواجه للداخل ويسمع صوت نقرة عند إدخال الأنبوب. خذ حبيبة الخلية وأضف 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت R لإعادة التعليق المسخن مسبقا لكل واحد إلى مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة ، واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل أنبوب نقل واخلطها بلطف مع ماصة دقيقة P-20.أدخل طرفا في الماصة عن طريق الضغط على زر الضغط على المحطة الثانية ، مما يضمن أن المشبك يلتقط تماما جذع المكبس المتصاعد في الطرف. بعد ذلك ، اضغط على زر الضغط الموجود على الماصة إلى المحطة الأولى واغمس في الأنبوب الأول الذي يحتوي على خليط الحمض النووي للخلية أو البلازميد لشفط العينة. أدخل الماصة مع العينة بعناية فائقة في حامل الماصة، مما يضمن نقر الماصة ووضعها بشكل مناسب.اضغط على زر البدء على الشاشة التي تعمل باللمس وانتظر حتى يتم تسليم النبضات الكهربائية. قم بإزالة الماصة ببطء من المحطة وأضف على الفور تعليق الخلية المنقول إلى البئر المقابل مع الوسط الخالي من المضادات الحيوية الذي تم تسخينه مسبقا عن طريق الضغط ببطء على زر الضغط على المحطة الأولى. هز الصفيحة بلطف بخلايا معبرة واحتضنها لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة ، ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى كل بئر.ضع الطبق في الحاضنة واسمح ب 24 ساعة على الأقل للتعبير الجيني. في اليوم التالي ، افحص صلاحية الخلية وكفاءة النقل باستخدام مجهر epifluorescence. قم بإزالة الوسائط من الخلايا بعناية باستخدام ماصة دقيقة P-1000 وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحفيز أسفل جانب البئر.لتشغيل آبار التحكم غير المعالجة ، أضف وسيطا للتصوير بدون الحافز. لتصور الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، قم بتشغيل المجهر ومصدر الضوء الفلوري باتباع التعليمات. حدد الهدف 10 مرات أو 20 مرة وضع طبق الثقافة على مسرح المجهر.ابحث عن الخلايا الموجودة تحت مرشح 568 نانومتر باستخدام قطعة العين. والتركيز على الخلايا المعبرة عن الخلايا الحمراء للمراسل. عد جميع الخلايا الحمراء في المجال البصري.أثناء وجودك في نفس المجال المرئي ، قم بالتغيير إلى مرشحات 488 أو 512 ، قم بحساب عدد الخلايا الحمراء الخضراء أيضا. احسب ما لا يقل عن 100 خلية حمراء من ثلاثة حقول على الأقل. احسب النسبة المئوية للخلايا المنقولة إيجابية الزهرة لكل مجال بصري ومتوسط النسب المئوية الناتجة لكل علاج بشكل جيد للحصول على الانحراف المعياري.لتصوير الخلايا باستخدام مجهر epifluorescence أو مجهر بؤري ، تصور الصورة الحية للخلايا على شاشة الكمبيوتر كما حصلت عليها الكاميرا. قم بضبط التركيز البؤري وموضع الخلايا باستخدام عجلة التحكم في عصا التحكم والتركيز. اضبط النسبة المئوية لطاقة الليزر ووقت التعرض لليزر 512 نانومتر أو 488 نانومتر و568 نانومتر ، بحيث تبدو الإشارة في الصورة جيدة دون تشبع.قم بتشغيل الالتقاط المباشر وفحص الصورة الناتجة، مما يضمن رؤية ذروة مميزة لكل طابق في الرسم البياني للشاشة لكلتا القناتين. أثناء تصور الصورة الحية للخلايا، التقط صورا تمثيلية متعددة لحقل يحتوي على خلية واحدة أو أكثر تعبر عن مراسل mCherry أو dsRedmito لكل بئر من اللوحة. أظهرت الخلايا الوحيدة الإيجابية المختارة CD-14 المحتضنة مع GM-CSF لمدة سبعة أيام تغيرات في مورفولوجيا الخلية على مدار فترة التمايز ، حيث انتقلت من خلايا التعليق الكروية إلى المغزل والمرتبطة بالكامل ، وأخيرا ، إلى خلايا أكثر انتشارا عند تمييزها بالكامل.تم نقل الخلايا المتمايزة بالكامل مع أزواج كاسباز BiFC VC و VN جنبا إلى جنب مع المراسل البلازميد dsRedmito ، والذي تم استخدامه لتسمية الخلايا العابرة. لم تظهر الخلايا غير المعالجة أي تألق فينوس. وفي الخلايا المعالجة بالنيجريسين ، ظهر caspase-1 BiFC كثقب واحد مع الشكل النموذجي لبقع ASC.أظهر القياس الكمي ل MDM الإيجابي لكوكب الزهرة أن أعلى نسبة مئوية من caspase-1 BiFC شوهدت في مجموعة علاج LPS بالإضافة إلى nigericin. في المعايرة بالتحليل الحجمي للكاسباز-1 و 4 و 5 أزواج مؤيدة ل BiFC ، نتجت أعلى نسبة من الخلايا الإيجابية لكوكب الزهرة عن 400 و 500 و 1000 نانوغرام من البلازميد العابر ، على التوالي. أظهرت الصور البؤرية التي تم الحصول عليها بهدف 20 مرة لحقل من الخلايا بعد 24 ساعة من التحويل أن الخلايا العابرة غير المعالجة قابلة للحياة لأن الميتوكوندريا سليمة.بعد العلاج بالهيم ، يظهر مركب caspase-1 كثقب أخضر واحد مشابه لتلك التي يسببها nigericin. تذكر تجنب الظروف القاسية والتلاعب المفرط بالخلايا أثناء التمايز والنقل والعلاج لأنه يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تلقائي ومستويات خلفية عالية من تنشيط كاسباز.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

ثقافة الضامة الوحيدات المستمدة-بلعم مستعمرة تحفيز عامل متباينة الإنسان

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

تحديد كمية النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الجسم الحي وتوصيف الضامة المشتقة من خلايا الدم

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

العلاج المناعي بالتبني من خلايا iNKT في الجلوكوز-6-الفوسفات Isomerase (G6PI) الناجمة عن الفئران RA

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من وحيدات الأبقار

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...