Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af LBH's laboratorium før og nu, som har bidraget til udviklingen af denne teknik. Dette laboratorium understøttes af NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figur 2 blev tegnet ved hjælp af Biorender-software.

Denne protokol følger retningslinjerne fra Baylor College of Medicine's humane forskningsetiske komité for manipulation af humane prøver. Blodprøver håndteres efter de institutionelle sikkerhedsretningslinjer for humane prøver. Blodprøver opnås i en regional blodbank, hvor de opsamles med citratphosphatdextrose (CPD) opløsning. Imidlertid kan blod indsamlet med andre antikoagulantia som natriumheparin, lithiumheparin eller EDTA også bruges til denne protokol28,29<sup class="xr...

<ol>
	<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer.">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).</li><li>Bol&#237;var, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspase+regulation:+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease.">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li><li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases:+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases.">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li><li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes.">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li><li>Vigan&#242;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes.">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761 (2015).</li><li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme.">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97 (1992).</li><li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome+activation+and+IL-1&#946;+and+IL-18+processing+during+infection.">Inflammasome activation and IL-1&#946; and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11.">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4.">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain:+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins.">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li><li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder.">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li><li>B&#252;rckst&#252;mmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome.">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling.">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS.">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li><li>Bol&#237;var, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1&#946;+Release+and+Cell+Death.">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1&#946; Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li><li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells.">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li><li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5.">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li><li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1&#946;+secretion+by+triggering+necrosis.">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1&#946; secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1813 (2015).</li><li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cells:+Isolation,+Freezing,+thawing,+and+culture.">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li><li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1+beta+maturation:+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin.">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li><li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mature+interleukin-1&#946;+(IL-1&#946;)+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1&#946;-converting+enzyme+processing.">Increased mature interleukin-1&#946; (IL-1&#946;) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1&#946;-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li><li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyroptosome:+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation.">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes.">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li><li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+Plasma+concentrations+of+hemopexin,+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases.">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1&#946;processing+in+monocytes.">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1&#946;processing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li><li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation.">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li><li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants:+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions.">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li><li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR/Cas9.">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).</li><li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+the+difference+between+CD80+and+CD86.">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li><li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+kinases+in+a+death+grip.">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li></ol>

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for at opnå makrofager fra monocytter isoleret fra humane blodprøver og en metode til effektivt at introducere de inflammatoriske caspase BiFC-reportere i human MDM uden at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd.
Denne protokol udnytter BiFC-teknikken35 til at mærke de inflammatoriske caspaser på caspaserekrutteringsdomænet (CARD) med ikke-fluorescerende fragmenter af det splittede fluorescerende protein Venus. In...

Caspaserne er en familie af cysteinaspartatproteastaser, der kan grupperes i initiator caspaser og bøddel caspaser. Bøddel caspaser omfatter caspase-3, -6 og -7. De findes naturligt i celler som dimerer og spaltes af initiatoren caspases for at udføre apoptose1. Initiator caspaser omfatter human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 og -12. De findes som inaktive zymogener (pro-caspaser), der aktiveres ved nærhedsinduceret dimerisering og stabiliseres ved autoproteolytisk spaltning 2,3. De inflammatoriske caspaser er en delmængde af initiatoren caspases2 og omfatter caspase-1, -4, -5 og -12 hos mennesker og caspase-1, -11 og -12 hos mus 4,5. I stedet for en apoptotisk rolle spiller de en central rolle i inflammation. De medierer proteolytisk behandling og sekretion af pro-interleukin (IL)-1β og pro-IL-18 6,7, som er de første cytokiner, der frigives som reaktion på patogene angribere 8,9. Caspase-1 aktiveres ved rekruttering til sin aktiveringsplatform; et proteinkompleks med stor molekylvægt betegnet inflammasomet (figur 1A)10. Dimerisering af caspase-4, -5 og -11 sker uafhængigt af disse platforme gennem en ikke-kanonisk inflammasomvej11,12.
Kanoniske inflammasomer er cytosoliske multimere proteinkomplekser, der består af et inflammasomsensorprotein, adaptorproteinet ASC (apoptose-associeret speck-lignende protein indeholdende et CARD) og effektorproteinet caspase-110. De mest velundersøgte kanoniske inflammasomer er den NOD-lignende receptorfamilie, der indeholder et pyrindomæne (NLRP), NLRP1 og NLRP3, NLR-familien, der indeholder et CARD (NLRC), NLRC4, og det fraværende i melanom 2 (AIM2). De indeholder hver især et pyrindomæne, et CARD eller begge domæner. CARD-domænet formidler interaktionen mellem CARD-holdige caspaser og deres opstrømsaktivatorer. Derfor kræves stilladsmolekylet ASC, der består af et N-terminal pyrindomæne (PYD) og et C-terminal CARD-motiv 13,14, til rekruttering af caspase-1 til NLRP110, NLRP315 og AIM216 inflammasomer.
Hvert inflammasom er opkaldt efter dets unikke sensorprotein, der genkender forskellige proinflammatoriske stimuli (figur 1B). Aktivatorer af denne vej kaldes kanoniske stimuli. Inflammasomer tjener som sensorer til mikrobielle komponenter og vævsstress og samles for at udløse et robust inflammatorisk respons gennem aktivering af de inflammatoriske caspaser17. Inflammasomsamling initierer caspase-1-aktivering for at formidle modning og sekretion af dets vigtigste substrater pro-IL-1β og pro-IL-18. Denne proces sker via en totrinsmekanisme. For det første opregulerer en priming stimulus ekspressionen af visse inflammasomproteiner og pro-IL-1β gennem aktivering af NF-κB-vejen. For det andet inducerer en intracellulær (kanonisk) stimulus inflammasom samling og rekruttering af procaspase-1 6,7.
Caspase-4 og caspase-5 er de menneskelige ortologer af murine caspase-1111. De aktiveres på en inflammasom-uafhængig måde af intracellulær lipopolysaccharid (LPS), et molekyle, der findes i den ydre membran af gramnegative bakterier 18,19,20, og ved ekstracellulær hæm, et produkt af røde blodlegemer hæmolyse 21. Det er blevet foreslået, at LPS binder direkte til CARD-motivet af disse proteiner og inducerer deres oligomerisering20. Aktivering af caspase-4 eller caspase-5 fremmer IL-1β-frigivelse ved at inducere en inflammatorisk form for celledød kaldet pyroptose gennem spaltning af det poredannende protein gasdermin D (GSDMD) 18,19. Desuden inducerer udstrømningen af kaliumioner som følge af caspase-4 og GSDMD-medieret pyroptotisk død aktivering af NLRP3-inflammasomet og efterfølgende aktivering af caspase-122,23. Derfor betragtes caspase-4, -5 og -11 som intracellulære sensorer til LPS, der er i stand til at inducere pyroptose og caspase-1-aktivering som reaktion på specifikke stimuli11,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Figur 1: Inflammatoriske caspaser og caspase-bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC) assay. (A) Diagram, der viser caspase-BiFC-systemet, hvor to caspase-1 prodomainer (C1-pro) forbundet med hvert ikke-fluorescerende fragment af Venus (Venus-C eller Venus-N) rekrutteres til NLRP3-aktiveringsplatformen, hvilket tvinger Venus til at folde sig om og fluorescere. Dette kompleks fremstår som en grøn plet under mikroskopet og tjener som en udlæsning for inflammatorisk caspase-induceret nærhed, hvilket er det første skridt i initiator caspase aktivering. (B) Skematisk visning af domæneorganisationen af inflammasomkomponenter og inflammatoriske caspaser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Det er vanskeligt at måle specifik initiator caspases aktivering, og der er ikke mange metoder til rådighed til at gøre det ved billeddannelsesmetoder. Caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) kan bruges til at visualisere inflammatorisk caspaseaktivering direkte i levende celler (figur 1A)25. Denne teknik er for nylig blevet tilpasset til brug i humane monocytafledte makrofager (MDM)21. Caspase BiFC måler det første trin i inflammatorisk caspaseaktivering, induceret nærhed for at lette dimerisering. Ekspression af plasmider, der koder for det CARD-holdige caspaseprodomæne smeltet sammen med ikke-fluorescerende fragmenter af det fotostable gule fluorescerende protein Venus (Venus-C [VC]) og Venus-N [VN]) anvendes. Når de to caspase prodomainer rekrutteres til deres aktiveringsplatform eller gennemgår induceret nærhed, bringes de to halvdele af Venus i umiddelbar nærhed og tvinges til at folde sig sammen og fluorescere (se figur 1A,B). Dette giver en realtidsaflæsning af specifik inflammatorisk caspaseaktivering.
Human MDM udtrykker rigeligt inflammasomgener og mønstergenkendelsesreceptorer, der identificerer faresignaler og patogenprodukter. Dette giver en ideel celletype til forhør af inflammatoriske caspaseveje. Derudover kan de stamme fra perifert blod og endda fra patientprøver for at vurdere inflammatorisk caspaseaktivering i en bestemt sygdomstilstand. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer BiFC caspase-reportere i MDM ved hjælp af nukleofektion, en elektroporationsbaseret transfektionsmetode, hvordan man behandler cellerne for at inducere inflammatorisk caspaseaktivering, og hvordan man visualiserer de aktive caspasekomplekser ved hjælp af mikroskopi-tilgange. Derudover kan denne metode tilpasses til at bestemme den molekylære sammensætning af disse komplekser, subcellulær lokalisering, kinetik og størrelse af disse højt ordnede strukturer 25,26,27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

Inflammatoriske caspaser indbefatter caspase-1, -4, -5, -11 og -12 og tilhører undergruppen af initiator caspases. Caspase-1 er påkrævet for at sikre korrekt regulering af inflammatorisk signalering og aktiveres ved nærhedsinduceret dimerisering efter rekruttering til inflammasomer. Caspase-1 er rigelig i den monocytiske celleafstamning og inducerer modning af de proinflammatoriske cytokiner interleukin (IL)-1β og IL-18 til aktive udskillede molekyler. De andre inflammatoriske caspaser, caspase-4 og -5 (og deres murinhomolog caspase-11) fremmer IL-1β-frigivelse ved at inducere pyroptose. Caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) er et værktøj, der bruges til at måle inflammatorisk caspaseinduceret nærhed som en aflæsning af caspaseaktivering. Caspase-1, -4 eller -5 prodomænet, som indeholder det område, der binder til inflammasomet, smeltes sammen med ikke-fluorescerende fragmenter af det gule fluorescerende protein Venus (Venus-N [VN] eller Venus-C [VC]), der associerer til at reformere det fluorescerende Venus-kompleks, når caspaserne gennemgår induceret nærhed. Denne protokol beskriver, hvordan man introducerer disse reportere i primære humane monocytafledte makrofager (MDM) ved hjælp af nukleofektion, behandler cellerne for at inducere inflammatorisk caspaseaktivering og måler caspaseaktivering ved hjælp af fluorescens og konfokal mikroskopi. Fordelen ved denne tilgang er, at den kan bruges til at identificere komponenter, krav og lokalisering af det inflammatoriske caspaseaktiveringskompleks i levende celler. Imidlertid skal omhyggelig kontrol overvejes for at undgå at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd. Denne teknik er et kraftfuldt værktøj til analyse af dynamiske caspaseinteraktioner på inflammasomniveau samt til forhør af de inflammatoriske signalkaskader i levende MDM og monocytter afledt af humane blodprøver.

Skemaet vist i figur 2 giver et overblik over, hvordan man opnår, transfekterer og afbilder human MDM. Efter inkubation af de valgte CD14+ monocytter med GM-CSF i 7 dage ændres cellemorfologien i løbet af differentieringsperioden (figur 3A), der går fra sfæriske suspensionsceller til spindly og fuldt fastgjort (dag 3 og 4), og endelig til mere spredte celler, når de er fuldt differentierede (dag 7). Fuldt differentierede celler løsnes derefter fra pladen...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for at opnå monocytterafledte makrofager (MDM) fra humane blodprøver, en simpel metode til effektivt at introducere inflammatorisk caspase Bimolekylær Fluorescenskomplementering (BiFC) journalister i human MDM uden at gå på kompromis med cellelevedygtighed og adfærd og en billeddannelsesbaseret tilgang til måling af inflammatorisk caspaseaktivering i levende celler.

Visualisering af inflammatorisk caspases induceret nærhed i humane monocytafledte makrofager

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Denne protokol er vigtig, fordi den kan bruges til at visualisere og forhøre inflammatorisk caspasevej på molekylært niveau i levende celler i en bestemt sygdomstilstand. Den største fordel ved denne teknik er, at den kan bruges til at identificere komponenter, krav og lokalisering af de inflammatoriske caspaseaktiveringskomplekser i primære immunceller. Med mindre optimeringer kan denne metode tilpasses andre primære celler og en række proteiner aktiveret ved oligomerisering, og dens anvendelighed er ikke begrænset til mikroskopiske metoder.Først aspirerer medierne fra fuldt differentierede makrofager på 10 centimeter tallerkener og vask cellemonolaget med varmt serumfrit RPMI-1640 medium, fjern alle medier fuldstændigt. Høst cellerne ved at tilsætte to milliliter 0,25% varm trypsin-EDTA-opløsning pr. 10 centimeter skål. Rør forsigtigt trypsin-EDTA op og ned over hele fadet med en P-1000 mikropipette, og overfør derefter suspensionen til et 15 ml konisk rør indeholdende fem milliliter varmt komplet kulturmedium.Kontroller for celleløsning under et lyst feltmikroskop, og fjern igen, hvis det er nødvendigt. Aspirer mediet og resuspend cellerne i 10 ml 1X steril PBS forvarmet til 37 grader Celsius. Tag derefter en 20 mikroliter aliquot for at bestemme cellenummeret ved hjælp af et hæmocytometer.Tag en til to gange 10 til de femte celler pr. Transfektion og læg dem i et 15 ml rør. Bring til et endeligt volumen på 15 ml med forvarmet 1X steril PBS. Aspirer PBS og centrifuge endnu en gang i et minut ved 250 x g.Fjern eventuel resterende PBS fra cellepillen ved hjælp af en P-200 mikropipette. Tag et sterilt mikrorør på 1,5 ml pr. transfektion, og tilsæt de relevante reporterplasmid- og caspase BiFC-plasmider i emhætten. Anbring pipettestationen, enheden, spidserne, elektroporationsrørene og pipetten i en steril laminær strømningshætte.Tilslut og tænd for nukleofektionsenheden. Indtast transektionsparametrene på det viste startskærmbillede. Tryk på Spænding, indtast 1000, og tryk på Udført for at indstille den til 1000 volt.Tryk på Bredde, indtast 40, og tryk på Udført for at indstille pulsen til 40 millisekunder. Til sidst skal du trykke på Impulser, indtaste 2 og trykke på Udført for at indstille antallet af elektriske impulser til 2. Tag et af elektroporationsrørene og fyld det med tre milliliter elektrolytisk buffer E ved stuetemperatur.Indsæt elektroporationsrøret i pipetteholderen på pipettestationen, og det sikres, at elektroden på siden af røret vender indad, og at der høres en kliklyd, når røret indsættes. Tag cellepillen og tilsæt 10 mikroliter forvarmet resuspension R-buffer for hver til to gange 10 til de femte celler, og bland forsigtigt med en P-20 mikropipette. Tilsæt 10 mikroliter cellesuspension til hvert transfektionsrør og bland forsigtigt med en P-20 mikropipette.Indsæt en spids i pipetten ved at trykke på trykknappen til det andet stop, og sørg for, at klemmen helt opfanger stempelstammens monteringsstamme i spidsen. Tryk derefter på trykknappen på pipetten til det første stop og dypp ned i det første rør, der indeholder celle- eller plasmid-DNA-blanding for at aspirere prøven. Indsæt pipetten med prøven meget forsigtigt i pipetteholderen, og sørg for, at pipetten klikker og er korrekt placeret.Tryk på start på den berøringsfølsomme skærm, og vent, indtil de elektriske impulser er leveret. Fjern langsomt pipetten fra stationen, og tilsæt straks den transekterede cellesuspension i den tilsvarende brønd med det forvarmede antibiotikafrie medium ved langsomt at trykke på trykknappen til det første stop. Rock forsigtigt pladen med transekterede celler og inkuber i en til tre timer i en befugtet vævskulturinkubator, og tilsæt derefter 200 mikroliter forvarmet kulturmedium til hver brønd.Placer skålen i inkubatoren og tillad mindst 24 timer til genekspression. Den næste dag skal du inspicere cellens levedygtighed og transfektionseffektivitet ved hjælp af et epifluorescensmikroskop. Fjern medierne forsigtigt fra cellerne med en P-1000 mikropipette og tilsæt 500 mikroliter stimulusopløsningen ned ad siden af brønden.For at køre ubehandlede kontrolbrønde skal du tilføje et billeddannende medium uden stimulans. For at visualisere cellerne ved hjælp af et epifluorescens- eller konfokalmikroskop skal du tænde mikroskopet og den fluorescerende lyskilde ved at følge instruktionerne. Vælg 10 gange eller 20 gange mål, og placer kulturskålen på mikroskopscenen.Find celler under 568 nanometer filteret med øjestykket. Og fokuser på de celler, der udtrykker reporterens røde blodlegemer. Tæl alle de røde celler i synsfeltet.Mens du er i det samme synsfelt, skal du skifte til 488- eller 512-filtrene, tælle antallet af røde celler, der også er grønne. Tæl mindst 100 røde blodlegemer i mindst tre felter. Beregn procentdelen af Venus-positive transekterede celler pr. Synsfelt, og gennemsnit de resulterende procentdele for hver behandlingsbrønde for at få standardafvigelsen.For at afbilde cellerne ved hjælp af et epifluorescens- eller konfokalmikroskop skal du visualisere det levende billede af cellerne på computerskærmen som erhvervet af kameraet. Finjuster cellernes fokus og position ved hjælp af joystickets kontrol- og fokushjul. Indstil den procentvise lasereffekt og eksponeringstid for 512 nanometer eller 488 nanometer og 568 nanometer lasere, så signalet i billedet ser godt ud uden mætning.Tænd for liveoptagelsen, og undersøg det resulterende billede, og det sikres, at der ses en tydelig top for hver etage i displayhistogrammet for begge kanaler. Mens du visualiserer det levende billede af cellerne, skal du tage flere repræsentative billeder af et felt, der indeholder en eller flere celler, der udtrykker mCherry- eller dsRedmito-reporteren for hver brønd på pladen. Udvalgte CD-14 positive monocytter inkuberet med GM-CSF i syv dage viste ændringer i cellemorfologien i løbet af differentieringsperioden, der gik fra sfæriske suspensionsceller til spindly og fuldt fastgjort og endelig til mere spredte celler, når de var fuldt differentierede.Fuldt differentierede celler blev transekteret med caspase BiFC-parrene VC og VN sammen med reporterplasmidet dsRedmito, som blev brugt til at mærke de transekterede celler. Ubehandlede celler viste ingen Venus fluorescens. Og i nigericinbehandlede celler optrådte caspase-1 BiFC som et enkelt punktum med den typiske form af ASC-pletter.Kvantation af Venus-positiv MDM viste, at den højeste procentdel af caspase-1 BiFC ses i LPS plus nigericin-behandlingsgruppen. Ved plasmititrering af caspase-1, 4 og 5 pro-BiFC-par skyldtes den højeste procentdel af Venus-positive celler henholdsvis 400, 500 og 1.000 nanogram transekteret plasmid. Konfokale billeder opnået med et 20 gange objektivt af et cellefelt 24 timer efter transektion viste, at de ubehandlede transekterede celler er levedygtige, da mitokondrier er intakte.Efter behandling med hæm fremstår caspase-1-komplekset som et enkelt grønt punktumctum svarende til det, der induceres af nigericin. Husk at undgå barske tilstande og overdreven manipulation af cellerne under differentiering, transfektion og behandling, da det kan resultere i en spontan aktivering og høje baggrundsniveauer af caspaseaktivering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

En<em&gt; In vitro</em&gt; Samtidig infektion model for at studere<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interactions i humane primære Monocytafledte immunceller

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivering og måling af NLRP3 Inflammasome Aktivitet hjælp af IL-1β i Human monocytafledte dendritiske celler

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Dyrkning af makrofag kolonistimulerende faktor differentierede humane monocytafledte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering af Humane monocytafledte dendritiske celler fra Imaging flowcytometri: en sammenligning mellem to Monocyt Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Generation of Human monocytafledte dendritiske celler fra fuldblod

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse af Microglia og Monocyt-afledte Makrofager fra Centralnervesystemet ved Flowcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kvantificering af Monoyte Chemotaktisk aktivitet in vivo og karakterisering af blod monocytter afledt makrofager

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptivimmunterapi af iNKT-celler i glucose-6-fosfatisomerase (G6PI)-Induceret RA-mus

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulation og visualisering af ekstracellulær fælde frigivelse i differentierede humane monocytter-afledte makrofager

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestemmelse af vaccineimmunogenicitet under anvendelse af bovin monocytafledte dendritiske celler

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...