Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

We bedanken de leden van LBH's lab uit heden en verleden die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van deze techniek. Dit lab wordt ondersteund door NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Figuur 2 is getekend met behulp van Biorender software.

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Baylor College of Medicine voor de manipulatie van menselijke monsters. Bloedmonsters worden behandeld volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen voor menselijke monsters. Bloedmonsters worden verkregen bij een regionale bloedbank, waar ze worden verzameld met citraatfosfaat dextrose (CPD) oplossing. Bloed verzameld met andere anticoagulantia zoals natriumheparine, lithiumheparine of EDTA kan echter ook worden gebruikt voor dit...

<ol>
	<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer.">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).</li><li>Bol&#237;var, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspase+regulation:+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease.">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li><li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases:+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases.">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li><li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes.">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li><li>Vigan&#242;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes.">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761 (2015).</li><li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme.">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97 (1992).</li><li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome+activation+and+IL-1&#946;+and+IL-18+processing+during+infection.">Inflammasome activation and IL-1&#946; and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11.">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4.">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain:+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins.">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li><li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder.">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li><li>B&#252;rckst&#252;mmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome.">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling.">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS.">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li><li>Bol&#237;var, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1&#946;+Release+and+Cell+Death.">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1&#946; Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li><li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells.">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li><li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5.">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li><li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1&#946;+secretion+by+triggering+necrosis.">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1&#946; secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1813 (2015).</li><li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cells:+Isolation,+Freezing,+thawing,+and+culture.">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li><li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1+beta+maturation:+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin.">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li><li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mature+interleukin-1&#946;+(IL-1&#946;)+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1&#946;-converting+enzyme+processing.">Increased mature interleukin-1&#946; (IL-1&#946;) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1&#946;-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li><li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyroptosome:+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation.">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes.">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li><li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+Plasma+concentrations+of+hemopexin,+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases.">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1&#946;processing+in+monocytes.">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1&#946;processing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li><li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation.">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li><li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants:+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions.">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li><li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR/Cas9.">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).</li><li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+the+difference+between+CD80+and+CD86.">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li><li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+kinases+in+a+death+grip.">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li></ol>

Dit protocol beschrijft de workflow om macrofagen te verkrijgen uit monocyten geïsoleerd uit menselijke bloedmonsters en een methode om de inflammatoire caspase BiFC-verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen.
Dit protocol maakt gebruik van de BiFC-techniek35 om de inflammatoire caspasen op het caspase recruitment domein (CARD) te taggen met niet-fluorescerende fragmenten van het ...

De caspasen zijn een familie van cysteïne aspartaat proteasen die kunnen worden gegroepeerd in initiator caspasen en beul caspasen. Beul caspasen bestaan uit caspase-3, -6 en -7. Ze komen van nature voor in cellen als dimeren en worden door de initiator caspasen gesplitst om apoptose1 uit te voeren. Initiator caspasen omvatten human caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 en -12. Ze worden gevonden als inactieve zymogenen (pro-caspasen) die worden geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie en gestabiliseerd door auto-proteolytische splitsing 2,3. De inflammatoire caspasen zijn een subset van de initiator caspasen2 en omvatten caspase-1, -4, -5 en -12 bij mensen, en caspase-1, -11 en -12 bij muis 4,5. In plaats van een apoptotische rol, spelen ze een centrale rol bij ontstekingen. Ze bemiddelen proteolytische verwerking en secretie van pro-interleukine (IL)-1β en pro-IL-18 6,7, de eerste cytokines die vrijkomen als reactie op pathogene indringers 8,9. Caspase-1 wordt geactiveerd bij werving op zijn activeringsplatform; een eiwitcomplex met een groot molecuulgewicht dat het inflammasoom wordt genoemd (figuur 1A)10. Dimerisatie van caspase-4, -5 en -11 vindt onafhankelijk van deze platforms plaats via een niet-canonieke inflammasoomroute11,12.
Canonieke inflammasomen zijn cytosolische multimere eiwitcomplexen die bestaan uit een inflammasoomsensoreiwit, het adaptoreiwit ASC (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit dat een CARD bevat) en het effectoreiwit caspase-110. De best bestudeerde canonieke inflammasomen zijn de NOD-achtige receptorfamilie met een pyrinedomein (NLRP), NLRP1 en NLRP3, de NLR-familie met een CARD (NLRC), NLRC4 en de afwezige in melanoom 2 (AIM2). Ze bevatten elk een pyrinedomein, een CARD of beide domeinen. Het CARD-domein bemiddelt de interactie tussen CARD-bevattende caspasen en hun upstream activators. Daarom is het steigermolecuul ASC, dat bestaat uit een N-terminal pyrinedomein (PYD) en een C-terminal CARD-motief13,14, vereist voor de rekrutering van caspase-1 voor deNLRP1 10, NLRP315 en AIM216 inflammasomen.
Elk inflammasoom is vernoemd naar zijn unieke sensoreiwit dat verschillende pro-inflammatoire stimuli herkent (figuur 1B). Activatoren van deze route worden canonieke stimuli genoemd. Inflammasomen dienen als sensoren voor microbiële componenten en weefselstress en assembleren om een robuuste ontstekingsreactie te veroorzaken door activering van de inflammatoire caspasen17. Inflammasoomassemblage initieert caspase-1-activering om rijping en secretie van de belangrijkste substraten pro-IL-1β en pro-IL-18 te bemiddelen. Dit proces verloopt via een mechanisme in twee stappen. Ten eerste upreguleert een priming stimulus de expressie van bepaalde inflammasoomeiwitten en pro-IL-1β door activering van de NF-κB-route. Ten tweede induceert een intracellulaire (canonieke) stimulus inflammasoomassemblage en rekrutering van procaspase-1 6,7.
Caspase-4 en caspase-5 zijn de menselijke orthologen van murine caspase-1111. Ze worden op een inflammasoomonafhankelijke manier geactiveerd door intracellulair lipopolysaccharide (LPS), een molecuul dat wordt aangetroffen in het buitenmembraan van Gram-negatieve bacteriën 18,19,20, en door extracellulair heem, een product van hemolyse van rode bloedcellen 21. Er is voorgesteld dat LPS zich rechtstreeks bindt aan het CARD-motief van deze eiwitten en hun oligomerisatie induceert20. Activering van caspase-4 of caspase-5 bevordert de afgifte van IL-1β door het induceren van een inflammatoire vorm van celdood die pyroptose wordt genoemd door splitsing van het porievormende eiwit gasdermin D (GSDMD)18,19. Bovendien induceert de efflux van kaliumionen als gevolg van caspase-4 en GSDMD-gemedieerde pyroptotische dood activering van het NLRP3-inflammasoom en daaropvolgende activering van caspase-1 22,23. Daarom worden caspase-4, -5 en -11 beschouwd als intracellulaire sensoren voor LPS die pyroptose en caspase-1-activering kunnen induceren als reactie op specifieke stimuli11,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Figuur 1: Inflammatoire caspasen en caspase-bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) assay. (A) Diagram met het caspase-BiFC-systeem, waarbij twee caspase-1 prodomeinen (C1-pro) gekoppeld aan elk niet-fluorescerend fragment van Venus (Venus-C of Venus-N) worden gerekruteerd naar het NLRP3-activeringsplatform, waardoor Venus wordt gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren. Dit complex verschijnt als een groene vlek onder de microscoop en dient als een uitlezing voor inflammatoire caspase-geïnduceerde nabijheid, wat de eerste stap is in initiator caspase-activering. (B) Schema dat de domeinorganisatie van inflammasoomcomponenten en inflammatoire caspasen weergeeft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het meten van specifieke initiator caspases activering is moeilijk, en er zijn niet veel methoden beschikbaar om dit te doen door middel van imaging benaderingen. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) kan worden gebruikt om inflammatoire caspase-activering direct in levende cellen te visualiseren (figuur 1A)25. Deze techniek is onlangs aangepast voor gebruik in menselijke monocyten-afgeleide macrofagen (MDM)21. Caspase BiFC meet de eerste stap in inflammatoire caspase-activering, geïnduceerde nabijheid om dimerisatie te vergemakkelijken. Expressie van plasmiden die coderen voor het CARD-bevattende caspase-prodomein gefuseerd tot niet-fluorescerende fragmenten van het fotostabiele gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-C [VC]) en Venus-N [VN]) worden gebruikt. Wanneer de twee caspase-prodomeinen worden gerekruteerd naar hun activeringsplatform of geïnduceerde nabijheid ondergaan, worden de twee helften van Venus in de nabijheid gebracht en gedwongen om opnieuw te vouwen en te fluoresceren (zie figuur 1A,B). Dit biedt een real-time uitlezing van specifieke inflammatoire caspase-activering.
Menselijke MDM brengt overvloedig inflammasoomgenen en patroonherkenningsreceptoren tot expressie die gevaarsignalen en pathogene producten identificeren. Dit biedt een ideaal celtype voor de ondervraging van inflammatoire caspase-routes. Bovendien kunnen ze worden afgeleid uit perifeer bloed en zelfs uit patiëntmonsters om inflammatoire caspase-activering in een specifieke ziektetoestand te beoordelen. Dit protocol beschrijft hoe de BiFC caspase-verslaggevers in MDM kunnen worden geïntroduceerd met behulp van nucleofection, een op elektroporatie gebaseerde transfectiemethode, hoe de cellen moeten worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en hoe de actieve caspase-complexen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van microscopiebenaderingen. Bovendien kan deze methodologie worden aangepast om de moleculaire samenstelling van deze complexen, subcellulaire lokalisatie, kinetiek en grootte van deze zeer geordende structuren te bepalen 25,26,27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

Inflammatoire caspasen omvatten caspase-1, -4, -5, -11 en -12 en behoren tot de subgroep van initiator caspasen. Caspase-1 is vereist om een correcte regulatie van inflammatoire signalering te garanderen en wordt geactiveerd door nabijheidsgeïnduceerde dimerisatie na rekrutering voor inflammasomen. Caspase-1 is overvloedig aanwezig in de monocytische cellijn en induceert rijping van de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL)-1β en IL-18 tot actieve uitgescheiden moleculen. De andere inflammatoire caspasen, caspase-4 en -5 (en hun murine homolog caspase-11) bevorderen il-1β afgifte door pyroptose te induceren. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is een hulpmiddel dat wordt gebruikt om inflammatoire caspase geïnduceerde nabijheid te meten als een uitlezing van caspase-activering. Het caspase-1, -4 of -5 prodomein, dat het gebied bevat dat zich bindt aan het inflammasoom, is gefuseerd met niet-fluorescerende fragmenten van het gele fluorescerende eiwit Venus (Venus-N [VN] of Venus-C [VC]) die zich associëren om het fluorescerende Venus-complex te hervormen wanneer de caspasen geïnduceerde nabijheid ondergaan. Dit protocol beschrijft hoe deze verslaggevers kunnen worden geïntroduceerd in primaire menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM) met behulp van nucleofection, de cellen kunnen worden behandeld om inflammatoire caspase-activering te induceren en caspase-activering te meten met behulp van fluorescentie en confocale microscopie. Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van het inflammatoire caspase-activeringscomplex in levende cellen te identificeren. Er moeten echter zorgvuldige controles worden overwogen om te voorkomen dat de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar komen. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van dynamische caspase-interacties op inflammasoomniveau en voor de ondervraging van de inflammatoire signaalcascades in levende MDM en monocyten afgeleid van menselijke bloedmonsters.

Het schema in figuur 2 geeft een overzicht van hoe menselijke MDM kan worden verkregen, getransfecteerd en in beeld gebracht. Na incubatie van de geselecteerde CD14+ monocyten met GM-CSF gedurende 7 dagen, verandert de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode (figuur 3A), gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht (dag 3 en 4), en ten slotte naar meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd (dag 7). Volledig ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Dit protocol is belangrijk omdat het kan worden gebruikt om de inflammatoire caspase-route op moleculair niveau in levende cellen in een bepaalde ziektetoestand te visualiseren en te ondervragen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de componenten, vereisten en lokalisatie van de inflammatoire caspase-activeringscomplexen in primaire immuuncellen te identificeren. Met kleine optimalisaties kan deze methode worden aangepast aan andere primaire cellen en een reeks eiwitten die worden geactiveerd door oligomerisatie, en de toepasbaarheid ervan is niet beperkt tot microscopische methodologieën.Adem eerst de media uit volledig gedifferentieerde macrofagen op 10 centimeter vaat en was de celmonolaag met warm serumvrij RPMI-1640-medium, waarbij alle media volledig worden verwijderd. Oogst de cellen door twee milliliter 0,25% warme trypsine-EDTA-oplossing per schaal van 10 centimeter toe te voegen. Pipetteer de trypsine-EDTA voorzichtig op en neer over de hele schaal met een P-1000 micropipette en breng de suspensie vervolgens over in een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter warm volledig kweekmedium.Controleer op celloslating onder een heldere veldmicroscoop en maak indien nodig opnieuw los. Zuig het medium op en resuspend de cellen in 10 milliliter 1X steriel PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Neem vervolgens een aliquot van 20 microliter om het celgetal te bepalen met behulp van een hemocytometer.Neem één tot twee keer 10 tot de vijfde cel per transfectie en plaats ze in een buis van 15 milliliter. Breng tot een eindvolume van 15 milliliter met voorverwarmde 1X steriele PBS. Zuig de PBS aan en centrifugeer nog één keer gedurende één minuut bij 250 x g.Verwijder eventuele resterende PBS uit de celkorrel met behulp van een P-200 micropipette. Neem een steriele microbuis per transfectie van 1,5 milliliter en voeg de juiste reporterplasmide en caspase BiFC-plasmiden toe aan de kap. Plaats het pipetstation, apparaat, tips, elektroporatiebuizen en pipet in een steriele laminaire stroomkap.Sluit het nucleofectionapparaat aan en schakel het in. Voer de transsectieparameters in het weergegeven opstartscherm in. Druk op Voltage, voer 1000 in en druk op Gereed om het in te stellen op 1000 volt.Druk op Breedte, voer 40 in en druk op Gereed om de puls in te stellen op 40 milliseconden. Druk ten slotte op Pulsen, voer 2 in en druk op Gereed om het aantal elektrische pulsen in te stellen op 2. Neem een van de elektroporatiebuizen en vul deze met drie milliliter elektrolytische buffer E bij kamertemperatuur.Plaats de elektroporatiebuis in de pipethouder op het pipetstation en zorg ervoor dat de elektrode aan de zijkant van de buis naar binnen is gericht en dat er een klikgeluid wordt gehoord wanneer de buis wordt ingebracht. Neem de celkorrel en voeg 10 microliter voorverwarmde resuspensie R-buffer toe voor elke één tot twee keer 10 tot de vijfde cellen en meng voorzichtig met een P-20 micropipette. Voeg 10 microliter van de celsuspensie toe aan elke transfectiebuis en meng voorzichtig met een P-20 micropipette.Steek een punt in de pipet door de drukknop tot de tweede stop in te drukken, zodat de klem de montagesteel van de zuiger in de punt volledig oppakt. Druk vervolgens op de drukknop op de pipet tot de eerste stop en duik in de eerste buis met cel- of plasmide-DNA-mengsel om het monster op te zuigen. Plaats de pipet met het monster zeer voorzichtig in de pipethouder, zorg ervoor dat de pipet klikt en op de juiste manier wordt geplaatst.Druk op start op het aanraakscherm en wacht tot de elektrische pulsen worden geleverd. Verwijder de pipet langzaam uit het station en voeg onmiddellijk de getransceerde celsuspensie toe aan de overeenkomstige put met het voorverwarmde antibioticavrije medium door langzaam op de drukknop te drukken tot de eerste stop. Laat de plaat voorzichtig schommelen met getransecteerde cellen en incubeer gedurende één tot drie uur in een bevochtigde weefselkweekincubator en voeg vervolgens 200 microliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put.Plaats de schaal in de couveuse en wacht minstens 24 uur op genexpressie. Inspecteer de volgende dag de levensvatbaarheid van de cel en de transfectie-efficiëntie met behulp van een epifluorescentiemicroscoop. Verwijder de media voorzichtig uit de cellen met een P-1000 micropipette en voeg 500 microliter van de stimulusoplossing toe aan de zijkant van de put.Om onbehandelde controleputten uit te voeren, voegt u een beeldvormend medium toe zonder de stimulus. Om de cellen te visualiseren met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, schakelt u de microscoop en de fluorescerende lichtbron in volgens de instructies. Selecteer de 10 of 20 keer objectief en plaats de kweekschaal op het microscooppodium.Zoek cellen onder het 568 nanometer filter met het oogstuk. En focus op de cellen die de reporter-rode bloedcellen tot expressie brengen. Tel alle rode bloedcellen in het gezichtsveld.Terwijl u zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt, schakelt u over naar de filters 488 of 512 en telt u het aantal rode bloedcellen dat ook groen is. Tel ten minste 100 rode bloedcellen van minimaal drie velden. Bereken het percentage Venuspositieve transected cellen per gezichtsveld en gemiddelde de resulterende percentages voor elke behandeling goed om de standaarddeviatie te krijgen.Om de cellen in beeld te brengen met behulp van een epifluorescentie of confocale microscoop, visualiseer je het live beeld van de cellen op het computerscherm zoals verkregen door de camera. Verfijn de focus en positie van de cellen met behulp van de joystickbediening en het scherpstelwiel. Stel het percentage laservermogen en belichtingstijd in voor de 512 nanometer of 488 nanometer en 568 nanometer lasers, zodat het signaal in het beeld er goed uitziet zonder verzadiging.Schakel de live-opname in en bekijk het resulterende beeld, zodat er voor elke verdieping een duidelijke piek te zien is in de histogrammen van het scherm voor beide kanalen. Terwijl u het live beeld van de cellen visualiseert, maakt u meerdere representatieve afbeeldingen van een veld dat een of meer cellen bevat die de mCherry- of dsRedmito-reporter voor elke put van de plaat tot expressie brengen. Geselecteerde CD-14 positieve monocyten geïncubeerd met GM-CSF gedurende zeven dagen vertoonden veranderingen in de celmorfologie in de loop van de differentiatieperiode, gaande van bolvormige suspensiecellen tot spichtig en volledig gehecht, en ten slotte tot meer verspreide cellen wanneer volledig gedifferentieerd.Volledig gedifferentieerde cellen werden getransecteerd met de caspase BiFC-paren VC en VN samen met de reporter plasmide dsRedmito, die werd gebruikt om de getransecteerde cellen te labelen. Onbehandelde cellen vertoonden geen Venus-fluorescentie. En in met nigericine behandelde cellen verscheen caspase-1 BiFC als een enkel punctum met de typische vorm van ASC-stippen.Kwantificering van Venus-positieve MDM toonde aan dat het hoogste percentage caspase-1 BiFC wordt gezien in de LPS plus nigericine behandelingsgroep. Op plasmidetitratie van caspase-1, 4 en 5 pro-BiFC-paren was het hoogste percentage Venus-positieve cellen het gevolg van respectievelijk 400, 500 en 1.000 nanogram getranscteerd plasmide. Confocale beelden verkregen met een 20 keer objectief van een veld van cellen 24 uur na transsectie toonden aan dat de onbehandelde transected cellen levensvatbaar zijn omdat mitochondriën intact zijn.Na behandeling met heem verschijnt het caspase-1-complex als een enkel groen punctum vergelijkbaar met het punctuem dat wordt geïnduceerd door nigericine. Vergeet niet om zware omstandigheden en overmatige manipulatie van de cellen te vermijden tijdens differentiatie, transfectie en behandeling, omdat dit kan resulteren in een spontane activering en hoge achtergrondniveaus van caspase-activering.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activering en waardering van NLRP3 inflammasome activiteit met behulp van IL-1β in Human Monocyt-afgeleide dendritische cellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultuur van macrofaag kolonie-stimulerende factor Gedifferentieerde Human monocyt-afgeleide macrofagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse van Microglia en Monocyt-afgeleide Macrofagen uit het Centrale Zenuwstelsel door Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Kwantificering van monocyten Chemotactische activiteit in vivo en karakterisering van bloed monocyten afgeleide macrofagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptieve immunotherapie van iNKT-cellen in glucose-6-fosfaat-isomerase (G6PI)-Geïnduceerde RA-muizen

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In vitro stimulatie en visualisatie van extracellulaire val afgifte in gedifferentieerde humane monocyte-afgeleide macrofagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...