Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des LBH-Labors in Vergangenheit und Gegenwart, die zur Entwicklung dieser Technik beigetragen haben. Dieses Lab wird unterstützt von NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). Abbildung 2 wurde mit der Biorender-Software gezeichnet.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung des Baylor College of Medicine für die Manipulation menschlicher Proben. Blutproben werden gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien für menschliche Proben behandelt. Blutproben werden in einer regionalen Blutbank entnommen, wo sie mit Citratphosphatdextrose (CPD) -Lösung entnommen werden. Blut, das mit anderen Antikoagulanzien wie Natriumheparin, Lithiumheparin oder EDTA gesammelt wird, kann jedoch auch für dieses Protokoll<sup ...

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Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Makrophagen aus Monozyten, die aus menschlichen Blutproben isoliert wurden, und eine Methode, um die entzündlichen Caspase-BiFC-Reporter effizient in das menschliche MDM einzuführen, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen.
Dieses Protokoll nutzt die BiFC-Technik35, um die entzündlichen Caspasen an der Caspase-Rekrutierungsdomäne (CARD) mit nicht-fluoreszierenden Fragm...

Die Caspasen sind eine Familie von Cystein-Aspartat-Proteasen, die in Initiator-Caspasen und Scharfrichter-Caspases gruppiert werden können. Scharfrichter-Caspasen umfassen Caspase-3, -6 und -7. Sie kommen natürlicherweise in Zellen als Dimere vor und werden von den Initiator-Caspasen gespalten, um Apoptose1 auszuführen. Initiator-Caspasen umfassen menschliche Caspase-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 und -12. Sie werden als inaktive Zymogene (Pro-Caspasen) gefunden, die durch näherungsinduzierte Dimerisierung aktiviert und durch autoproteolytische Spaltung stabilisiert werden 2,3. Die entzündlichen Caspasen sind eine Teilmenge der Initiator-Caspasen2 und umfassen Caspase-1, -4, -5 und -12 beim Menschen sowie Caspase-1, -11 und -12 bei Maus 4,5. Sie spielen keine apoptotische Rolle, sondern eine zentrale Rolle bei Entzündungen. Sie vermitteln die proteolytische Verarbeitung und Sekretion von Pro-Interleukin (IL)-1β und Pro-IL-186,7, den ersten Zytokinen, die als Reaktion aufpathogene Eindringlinge 8,9 freigesetzt werden. Caspase-1 wird bei der Rekrutierung für seine Aktivierungsplattform aktiviert; ein Proteinkomplex mit hohem Molekulargewicht, der als Inflammasom bezeichnet wird (Abbildung 1A)10. Die Dimerisierung von Caspase-4, -5 und -11 erfolgt unabhängig von diesen Plattformen durch einen nicht-kanonischen Inflammasom-Weg11,12.
Kanonische Inflammasomen sind zytosolische multimere Proteinkomplexe, die aus einem Inflammasom-Sensorprotein, dem Adapterprotein ASC (Apoptose-assoziiertes Speck-ähnliches Protein, das eine CARD enthält) und dem Effektorprotein Caspase-110 bestehen. Die am besten untersuchten kanonischen Inflammasomen sind die NOD-ähnliche Rezeptorfamilie, die eine Pyrindomäne (NLRP), NLRP1 und NLRP3 enthält, die NLR-Familie, die eine CARD (NLRC), NLRC4 enthält, und die fehlenden in Melanom 2 (AIM2). Sie enthalten jeweils eine Pyrindomäne, eine CARD oder beide Domänen. Die CARD-Domäne vermittelt die Interaktion zwischen CARD-haltigen Caspasen und ihren Upstream-Aktivatoren. Daher wird das Gerüstmolekül ASC, das aus einer N-terminalen Pyrindomäne (PYD) und einem C-terminalen CARD-Motiv 13,14 besteht, für die Rekrutierung von Caspase-1 zu den NLRP1 10-, NLRP3 15- und AIM2 16-Inflammasomen benötigt.
Jedes Inflammasom ist nach seinem einzigartigen Sensorprotein benannt, das unterschiedliche entzündungsfördernde Reize erkennt (Abbildung 1B). Aktivatoren dieses Pfades werden als kanonische Reize bezeichnet. Inflammasomen dienen als Sensoren für mikrobielle Komponenten und Gewebestress und lösen durch Aktivierung der Entzündungskaspasen eine robuste Entzündungsreaktion aus17. Die Inflammasom-Assemblierung initiiert die Caspase-1-Aktivierung, um die Reifung und Sekretion ihrer Hauptsubstrate pro-IL-1β und pro-IL-18 zu vermitteln. Dieser Prozess erfolgt über einen zweistufigen Mechanismus. Erstens reguliert ein Priming-Stimulus die Expression bestimmter Inflammasom-Proteine und Pro-IL-1β durch Aktivierung des NF-κB-Signalwegs. Zweitens induziert ein intrazellulärer (kanonischer) Reiz die Inflammasom-Assemblierung und Rekrutierung von Prochasase-1 6,7.
Caspase-4 und Caspase-5 sind die menschlichen Orthologe der murinen Caspase-1111. Sie werden inflammasomenunabhängig durch intrazelluläres Lipopolysaccharid (LPS), ein Molekül, das in der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien18,19,20 vorkommt, und durch extrazelluläres Häm, ein Produkt der Hämolyse roter Blutkörperchen 21, aktiviert. Es wurde vorgeschlagen, dass LPS direkt an das CARD-Motiv dieser Proteine bindet und ihre Oligomerisierung induziert20. Die Aktivierung von Caspase-4 oder Caspase-5 fördert die IL-1β-Freisetzung, indem sie eine entzündliche Form des Zelltods namens Pyroptose durch Spaltung des porenbildenden Proteins Gasdermin D (GSDMD) 18,19 induziert. Darüber hinaus induziert der Ausfluss von Kaliumionen, die aus Caspase-4 und GSDMD-vermitteltem pyroptotischem Tod resultieren, die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und die anschließende Aktivierung von Caspase-122,23. Daher gelten Caspase-4, -5 und -11 als intrazelluläre Sensoren für LPS, die in der Lage sind, Pyroptose und Caspase-1-Aktivierung als Reaktion auf spezifische Reize11,24 zu induzieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Abbildung 1: Entzündliche Caspasen und Caspase-bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC) Assay. (A) Diagramm des Caspase-BiFC-Systems, bei dem zwei Caspase-1-Prodomänen (C1-pro), die mit jedem nicht-fluoreszierenden Fragment der Venus (Venus-C oder Venus-N) verbunden sind, für die NLRP3-Aktivierungsplattform rekrutiert werden, wodurch die Venus gezwungen wird, sich zu verformen und zu fluoreszieren. Dieser Komplex erscheint als grüner Fleck unter dem Mikroskop und dient als Auslese für entzündliche Caspase-induzierte Nähe, die der erste Schritt bei der Aktivierung der Initiator-Caspase ist. (B) Schematische Darstellung der Domänenorganisation von Inflammasom-Komponenten und entzündlichen Caspasen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Messung der Aktivierung spezifischer Initiatorkaspasen ist schwierig, und es gibt nicht viele Methoden, um dies durch bildgebende Ansätze zu tun. Die bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) von Caspase kann verwendet werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung direkt in lebenden Zellen sichtbar zu machen (Abbildung 1A)25. Diese Technik wurde kürzlich für den Einsatz in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) angepasst21. Caspase BiFC misst den ersten Schritt in der entzündlichen Caspase-Aktivierung, induzierte Nähe, um die Dimerisierung zu erleichtern. Es wird die Expression von Plasmiden verwendet, die für die CARD-haltige Caspase-Prodomain kodieren, die mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des photostablen gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-C [VC]) und Venus-N [VN] verschmolzen sind. Wenn die beiden Caspase-Prodomänen für ihre Aktivierungsplattform rekrutiert werden oder induzierte Nähe erfahren, werden die beiden Venushälften in die Nähe gebracht und gezwungen, sich umzuformen und zu fluoreszieren (siehe Abbildung 1A,B). Dies bietet eine Echtzeit-Anzeige der spezifischen entzündlichen Caspase-Aktivierung.
Humanes MDM exprimiert reichlich Inflammasom-Gene und Mustererkennungsrezeptoren, die Gefahrensignale und pathogene Produkte identifizieren. Dies bietet einen idealen Zelltyp für die Abfrage von entzündlichen Caspasebahnen. Darüber hinaus können sie aus peripherem Blut und sogar aus Patientenproben gewonnen werden, um die entzündliche Caspase-Aktivierung in einem bestimmten Krankheitszustand zu beurteilen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die BiFC-Caspase-Reporter mit Nukleofektion, einer auf Elektroporation basierenden Transfektionsmethode, in MDM eingeführt werden, wie die Zellen behandelt werden, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und wie die aktiven Caspase-Komplexe mit mikroskopischen Ansätzen sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus kann diese Methodik angepasst werden, um die molekulare Zusammensetzung dieser Komplexe, die subzelluläre Lokalisation, die Kinetik und die Größe dieser hochgeordneten Strukturenzu bestimmen 25,26,27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

Entzündliche Caspasen umfassen Caspase-1, -4, -5, -11 und -12 und gehören zur Untergruppe der Initiator-Caspasen. Caspase-1 ist erforderlich, um eine korrekte Regulation der Entzündungssignale zu gewährleisten und wird durch näherungsinduzierte Dimerisierung nach der Rekrutierung zu Inflammasomen aktiviert. Caspase-1 ist in der monozytären Zelllinie reichlich vorhanden und induziert die Reifung der entzündungsfördernden Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 zu aktiven sezernierten Molekülen. Die anderen entzündlichen Caspasen, Caspase-4 und -5 (und ihre murine homologe Caspase-11) fördern die IL-1β-Freisetzung durch Induktion von Pyroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) ist ein Werkzeug zur Messung der entzündlichen Caspase-induzierten Nähe als Auslesung der Caspase-Aktivierung. Die Caspase-1-, -4- oder -5-Prodomain, die die Region enthält, die an das Inflammasom bindet, ist mit nicht-fluoreszierenden Fragmenten des gelben fluoreszierenden Proteins Venus (Venus-N [VN] oder Venus-C [VC]) verschmolzen, die sich mit der Reform des fluoreszierenden Venuskomplexes verbinden, wenn die Caspasen induzierte Nähe erfahren. Dieses Protokoll beschreibt, wie diese Reporter mittels Nukleofektion in primäre humane Monozyten-abgeleitete Makrophagen (MDM) eingeführt werden, die Zellen behandeln, um eine entzündliche Caspase-Aktivierung zu induzieren, und die Caspase-Aktivierung mittels Fluoreszenz und konfokaler Mikroskopie messen. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass er verwendet werden kann, um die Komponenten, Anforderungen und Lokalisation des entzündlichen Caspase-Aktivierungskomplexes in lebenden Zellen zu identifizieren. Es müssen jedoch sorgfältige Kontrollen in Betracht gezogen werden, um die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen nicht zu beeinträchtigen. Diese Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Analyse dynamischer Caspase-Interaktionen auf Inflammasomenebene sowie für die Abfrage der entzündlichen Signalkaskaden in lebenden MDM und Monozyten, die aus menschlichen Blutproben stammen.

Das in Abbildung 2 gezeigte Schema gibt einen Überblick darüber, wie humanes MDM erhalten, transfekt und abgebildet werden kann. Nach der Inkubation der ausgewählten CD14+-Monozyten mit GM-CSF für 7 Tage ändert sich die Zellmorphologie im Laufe der Differenzierungsperiode (Abbildung 3A) von sphärischen Suspensionszellen zu spindeldürren und vollständig gebundenen (Tage 3 und 4), und schließlich zu mehr verteilten Zellen, wenn sie vollständig differenz...

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Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf zur Gewinnung von Monozyten-abgeleiteten Makrophagen (MDM) aus menschlichen Blutproben, eine einfache Methode zur effizienten Einführung von BiFC-Reportern (Bimolecular Fluorescence Complementation) in das menschliche MDM, ohne die Lebensfähigkeit und das Verhalten der Zellen zu beeinträchtigen, und einen bildgebenden Ansatz zur Messung der entzündlichen Caspase-Aktivierung in lebenden Zellen.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es verwendet werden kann, um den entzündlichen Kaspaseweg auf molekularer Ebene in lebenden Zellen in einem bestimmten Krankheitszustand zu visualisieren und abzufragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie verwendet werden kann, um die Komponenten, Anforderungen und die Lokalisation der entzündlichen Caspase-Aktivierungskomplexe in primären Immunzellen zu identifizieren. Mit geringfügigen Optimierungen kann diese Methode an andere Primärzellen und eine Reihe von Proteinen angepasst werden, die durch Oligomerisierung aktiviert werden, und ihre Anwendbarkeit ist nicht auf mikroskopische Methoden beschränkt.Saugen Sie zunächst die Medien aus vollständig differenzierten Makrophagen auf 10 Zentimeter langes Geschirr und waschen Sie die Zellmonoschicht mit warmem serumfreiem RPMI-1640-Medium, wobei Sie alle Medien vollständig entfernen. Ernten Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter 0,25% warme Trypsin-EDTA-Lösung pro 10-Zentimeter-Schale hinzufügen. Pipettieren Sie das Trypsin-EDTA vorsichtig mit einer P-1000-Mikropipette über die gesamte Schale und übertragen Sie die Suspension dann auf ein 15-Milliliter-konisches Rohr, das fünf Milliliter warmes Vollkulturmedium enthält.Überprüfen Sie die Zellablösung unter einem Hellfeldmikroskop und lösen Sie sie bei Bedarf erneut. Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern 1X sterilem PBS, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Nehmen Sie dann ein 20-Mikroliter-Aliquot, um die Zellzahl mit einem Hämozytometer zu bestimmen.Nehmen Sie ein bis zwei Mal 10 bis die fünften Zellen pro Transfektion und legen Sie sie in eine 15-Milliliter-Röhre. Mit vorgewärmtem 1X sterilem PBS auf ein Endvolumen von 15 Millilitern bringen. Den PBS absaugen und noch einmal für eine Minute bei 250 x g zentrifugieren.Entfernen Sie alle verbleibenden PBS aus dem Zellpellet mit einer P-200-Mikropipette. Nehmen Sie pro Transfektion ein steriles Mikroröhrchen von 1,5 Millilitern und fügen Sie das entsprechende Reporterplasmid und Caspase BiFC-Plasmide in die Kapuze hinzu. Legen Sie die Pipettenstation, das Gerät, die Spitzen, die Elektroporationsröhrchen und die Pipette in eine sterile Laminar-Flow-Haube.Schließen Sie das Nukleofektionsgerät an und schalten Sie es ein. Geben Sie die Transsektionsparameter im angezeigten Startbildschirm ein. Drücken Sie auf Spannung, geben Sie 1000 ein und drücken Sie auf Fertig, um sie auf 1000 Volt einzustellen.Drücken Sie auf Breite, geben Sie 40 ein, und drücken Sie Fertig, um den Puls auf 40 Millisekunden einzustellen. Drücken Sie abschließend auf Impulse, geben Sie 2 ein und drücken Sie auf Fertig, um die Anzahl der elektrischen Impulse auf 2 einzustellen. Nehmen Sie einen der Elektroporationsröhrchen und füllen Sie ihn bei Raumtemperatur mit drei Millilitern Elektrolytpuffer E.Setzen Sie das Elektroporationsrohr in den Pipettenhalter an der Pipettenstation ein und stellen Sie sicher, dass die Elektrode an der Seite des Rohres nach innen zeigt und ein Klickgeräusch zu hören ist, wenn das Rohr eingeführt wird. Nehmen Sie das Zellpellet und fügen Sie 10 Mikroliter vorgewärmten Resuspension R-Puffer für jeweils ein bis zwei mal 10 zu den fünften Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer P-20-Mikropipette. Fügen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu jedem Transfektionsröhrchen hinzu und mischen Sie vorsichtig mit einer P-20-Mikropipette.Führen Sie eine Spitze in die Pipette ein, indem Sie den Druckknopf zum zweiten Anschlag drücken, um sicherzustellen, dass die Klemme den Montageschaft des Kolbens in der Spitze vollständig aufnimmt. Als nächstes drücken Sie den Druckknopf an der Pipette zum ersten Stopp und tauchen Sie in das erste Röhrchen mit Zell- oder Plasmid-DNA-Gemisch ein, um die Probe abzusaugen. Setzen Sie die Pipette mit der Probe sehr vorsichtig in den Pipettenhalter ein, um sicherzustellen, dass die Pipette einrastet und richtig platziert ist.Drücken Sie auf dem Touchscreen auf Start und warten Sie, bis die elektrischen Impulse abgegeben werden. Entfernen Sie langsam die Pipette aus der Station und fügen Sie sofort die transektorierte Zellsuspension in die entsprechende Vertiefung mit dem vorerwärmten antibiotikafreien Medium hinzu, indem Sie langsam den Druckknopf zum ersten Anschlag drücken. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig mit transektierten Zellen und inkubieren Sie für ein bis drei Stunden in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator, dann fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu.Stellen Sie die Schale in den Inkubator und warten Sie mindestens 24 Stunden auf Genexpression. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zelllebensfähigkeit und Transfektionseffizienz mit einem Epifluoreszenzmikroskop. Entfernen Sie die Medien vorsichtig mit einer P-1000-Mikropipette aus den Zellen und fügen Sie 500 Mikroliter der Stimuluslösung an der Seite des Brunnens hinzu.Um unbehandelte Kontrollbrunnen zu betreiben, fügen Sie ein Bildgebungsmedium ohne den Stimulus hinzu. Um die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop sichtbar zu machen, schalten Sie das Mikroskop und die Fluoreszenzlichtquelle gemäß den Anweisungen ein. Wählen Sie das 10-fache oder 20-fache Ziel aus und stellen Sie die Kulturschale auf die Mikroskopbühne.Finden Sie Zellen unter dem 568-Nanometer-Filter mit dem Okular. Und konzentrieren Sie sich auf die Zellen, die die roten Blutkörperchen des Reporters exprimieren. Zählen Sie alle roten Zellen im Gesichtsfeld.Wechseln Sie im selben Gesichtsfeld zu den Filtern 488 oder 512, zählen Sie die Anzahl der roten Zellen, die ebenfalls grün sind. Zählen Sie mindestens 100 rote Zellen mit mindestens drei Feldern. Berechnen Sie den Prozentsatz der Venus-positiven transektierten Zellen pro Gesichtsfeld und durchschnittlich die resultierenden Prozentsätze für jede Behandlung gut, um die Standardabweichung zu erhalten.Um die Zellen mit einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop abzubilden, visualisieren Sie das Live-Bild der Zellen auf dem Computerbildschirm, wie es von der Kamera aufgenommen wurde. Feinabstimmung des Fokus und der Position der Zellen mithilfe der Joystick-Steuerung und des Fokusrads. Stellen Sie die prozentuale Laserleistung und Belichtungszeit für die 512-Nanometer- oder 488-Nanometer- und 568-Nanometer-Laser so ein, dass das Signal im Bild ohne Sättigung gut aussieht.Schalten Sie die Live-Aufnahme ein und untersuchen Sie das resultierende Bild, um sicherzustellen, dass für jede Etage in den Display-Histogrammen für beide Kanäle ein eindeutiger Höhepunkt zu sehen ist. Während Sie das Live-Bild der Zellen visualisieren, nehmen Sie mehrere repräsentative Bilder eines Feldes auf, das eine oder mehrere Zellen enthält, die den mCherry- oder dsRedmito-Reporter für jede Vertiefung der Platte exprimieren. Ausgewählte CD-14-positive Monozyten, die sieben Tage lang mit GM-CSF inkubiert wurden, zeigten Veränderungen in der Zellmorphologie im Laufe der Differenzierungsperiode, die von sphärischen Suspensionszellen zu spindeldürren und vollständig gebundenen und schließlich zu mehr verteilten Zellen führten, wenn sie vollständig differenziert waren.Vollständig differenzierte Zellen wurden mit den Caspase-BiFC-Paaren VC und VN zusammen mit dem Reporterplasmid dsRedmito transektiert, das zur Markierung der transektierten Zellen verwendet wurde. Unbehandelte Zellen zeigten keine Venusfluoreszenz. Und in mit Nigericin behandelten Zellen erschien Caspase-1 BiFC als einzelnes Punctum mit der typischen Form von ASC-Flecken.Die Quantifizierung von Venus-positivem MDM zeigte, dass der höchste Prozentsatz an Caspase-1 BiFC in der LPS plus Nigericin-Behandlungsgruppe beobachtet wird. Bei der Plasmidtitration von Caspase-1-, 4- und 5-Pro-BiFC-Paaren ergab sich der höchste Prozentsatz an Venus-positiven Zellen aus 400, 500 bzw. 1.000 Nanogramm transektiertem Plasmid. Konfokale Bilder, die mit einem 20-fachen Objektiv eines Zellfeldes 24 Stunden nach der Transsektion aufgenommen wurden, zeigten, dass die unbehandelten transektivierten Zellen lebensfähig sind, da die Mitochondrien intakt sind.Nach der Behandlung mit Häm erscheint der Caspase-1-Komplex als ein einzelnes grünes Punctum, ähnlich dem durch Nigericin induzierten. Denken Sie daran, raue Bedingungen und übermäßige Manipulation der Zellen während der Differenzierung, Transfektion und Behandlung zu vermeiden, da dies zu einer spontanen Aktivierung und einer hohen Hintergrundaktivierung der Caspase führen kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

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Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Infektion Modell zum Studium<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; HIV-1-Wechselwirkungen in primären menschlichen Monozyten abgeleitete Immunzellen

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivierung und Messung der NLRP3 Inflammasom Aktivität mit IL-1β in humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Analyse von Mikroglia und Monozyten-abgeleiteten Makrophagen aus dem Zentralnervensystem durch Durchflusszytometrie

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Adoptive Immuntherapie von iNKT-Zellen in Glucose-6-Phosphat-Isomerase (G6PI)-Induzierte RA-Mäuse

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

In Vitro Stimulation und Visualisierung der extrazellulären Trap-Freisetzung in differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Bestimmung der Immunogenität von Impfstoffen anhand von dendritischen Zellen aus Rindermonozyten

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...