Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Bu tekniğin geliştirilmesine katkıda bulunan LBH'nin geçmiş ve şimdiki laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Bu laboratuvar NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH) tarafından desteklenmektedir. Şekil 2, Biorender yazılımı kullanılarak çizilmiştir.

Bu protokol, Baylor College of Medicine'in insan örneklerinin manipülasyonu için insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip etmektedir. Kan örnekleri, insan örnekleri için kurumsal güvenlik kurallarına uyularak ele alınır. Kan örnekleri, sitrat fosfat dekstroz (CPD) çözeltisi ile toplandıkları bölgesel bir kan bankasında elde edilir. Bununla birlikte, sodyum heparin, lityum heparin veya EDTA gibi diğer antikoagülanlarla toplanan kan da bu protokoliçin kullanılabilir 28,...

<ol>
	<li>Boatright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unified+model+for+apical+caspase+activation.">A unified model for apical caspase activation.</a> Molecular Cell. 11 (2), 529-541 (2003).</li><li>Pop, C., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspases:+activation,+specificity,+and+regulation.">Human caspases: activation, specificity, and regulation.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).</li><li>Boice, A., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+apoptotic+caspases+in+cancer.">Targeting apoptotic caspases in cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1867 (6), 118688 (2020).</li><li>Bol&#237;var, B. E., Vogel, T. P., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspase+regulation:+maintaining+balance+between+inflammation+and+cell+death+in+health+and+disease.">Inflammatory caspase regulation: maintaining balance between inflammation and cell death in health and disease.</a> The FEBS Journal. 286 (14), 2628-2644 (2019).</li><li>Martinon, F., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases:+linking+an+intracellular+innate+immune+system+to+autoinflammatory+diseases.">Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.</a> Cell. 117 (5), 561-574 (2004).</li><li>Lamkanfi, M., Vishva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+inflammasomes.">Mechanisms and functions of inflammasomes.</a> Cell. 157 (5), 1013-1022 (2014).</li><li>Vigan&#242;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+caspase-4+and+caspase-5+regulate+the+one-step+noncanonical+inflammasome+activation+in+monocytes.">Human caspase-4 and caspase-5 regulate the one-step noncanonical inflammasome activation in monocytes.</a> Nature Communications. 6, 8761 (2015).</li><li>Cerretti, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+interleukin-1+beta+converting+enzyme.">Molecular cloning of the interleukin-1 beta converting enzyme.</a> Science. 256 (5053), 97 (1992).</li><li>van de Veerdonk, F. L., Netea, M. G., Dinarello, C. A., Joosten, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome+activation+and+IL-1&#946;+and+IL-18+processing+during+infection.">Inflammasome activation and IL-1&#946; and IL-18 processing during infection.</a> Trends in Immunology. 32 (3), 110-116 (2011).</li><li>Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome:+a+molecular+platform+triggering+activation+of+inflammatory+caspases+and+processing+of+proIL-beta.">The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta.</a> Molecular Cell. 10 (2), 417-426 (2002).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+targets+caspase-11.">Noncanonical inflammasome activation targets caspase-11.</a> Nature. 479 (7371), 117-121 (2011).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+inflammasome+activation+by+intracellular+LPS+independent+of+TLR4.">Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4.</a> Science. 341 (6151), 1246-1249 (2013).</li><li>Masumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASC,+a+novel+22-kDa+protein,+aggregates+during+apoptosis+of+human+promyelocytic+leukemia+HL-60+cells.">ASC, a novel 22-kDa protein, aggregates during apoptosis of human promyelocytic leukemia HL-60 cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (48), 33835-33838 (1999).</li><li>Bertin, J., DiStefano, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PYRIN+domain:+a+novel+motif+found+in+apoptosis+and+inflammation+proteins.">The PYRIN domain: a novel motif found in apoptosis and inflammation proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 7 (12), 1273-1274 (2000).</li><li>Agostini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALP3+forms+an+IL-1beta-processing+inflammasome+with+increased+activity+in+Muckle-Wells+autoinflammatory+disorder.">NALP3 forms an IL-1beta-processing inflammasome with increased activity in Muckle-Wells autoinflammatory disorder.</a> Immunity. 20 (3), 319-325 (2004).</li><li>B&#252;rckst&#252;mmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orthogonal+proteomic-genomic+screen+identifies+AIM2+as+a+cytoplasmic+DNA+sensor+for+the+inflammasome.">An orthogonal proteomic-genomic screen identifies AIM2 as a cytoplasmic DNA sensor for the inflammasome.</a> Nature Immunology. 10 (3), 266-272 (2009).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-11+cleaves+gasdermin+D+for+noncanonical+inflammasome+signalling.">Caspase-11 cleaves gasdermin D for noncanonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death.">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+caspases+are+innate+immune+receptors+for+intracellular+LPS.">Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS.</a> Nature. 514 (7521), 187-192 (2014).</li><li>Bol&#237;var, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+Roles+of+Caspase-4+and+Caspase-5+in+Heme-Driven+IL-1&#946;+Release+and+Cell+Death.">Noncanonical Roles of Caspase-4 and Caspase-5 in Heme-Driven IL-1&#946; Release and Cell Death.</a> The Journal of Immunology. 206 (8), 1878-1889 (2021).</li><li>Schmid-Burgk, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-4+mediates+noncanonical+activation+of+the+NLRP3+inflammasome+in+human+myeloid+cells.">Caspase-4 mediates noncanonical activation of the NLRP3 inflammasome in human myeloid cells.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2911-2917 (2015).</li><li>Baker, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasome+activation+downstream+of+cytoplasmic+LPS+recognition+by+both+caspase-4+and+caspase-5.">NLRP3 inflammasome activation downstream of cytoplasmic LPS recognition by both caspase-4 and caspase-5.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2918-2926 (2015).</li><li>Cullen, S. P., Kearney, C. J., Clancy, D. M., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+activators+of+the+NLRP3+inflammasome+promote+IL-1&#946;+secretion+by+triggering+necrosis.">Diverse activators of the NLRP3 inflammasome promote IL-1&#946; secretion by triggering necrosis.</a> Cell Reports. 11 (10), 1535-1548 (2015).</li><li>Sanders, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+of+inflammatory+caspase+dimerization+reveals+differential+recruitment+to+inflammasomes.">Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes.</a> Cell Death &amp; Disease. 6, 1813 (2015).</li><li>Charendoff, C. I., Bouchier-Hayes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+the+pathways+to+caspase+activation+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Lighting up the pathways to caspase activation using bimolecular fluorescence complementation.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (133), e57316 (2018).</li><li>Bouchier-Hayes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+cytoplasmic+caspase-2+activation+by+induced+proximity.">Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity.</a> Molecular Cell. 35 (6), 830-840 (2009).</li><li>Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+mononuclear+cells:+Isolation,+Freezing,+thawing,+and+culture.">Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, Freezing, thawing, and culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).</li><li>Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biospecimen+science+of+blood+for+peripheral+blood+mononuclear+cell+(PBMC)+functional+applications.">Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications.</a> Current Pathobiology Reports. 7 (2), 17-27 (2019).</li><li>Perregaux, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1+beta+maturation:+evidence+that+mature+cytokine+formation+can+be+induced+specifically+by+nigericin.">IL-1 beta maturation: evidence that mature cytokine formation can be induced specifically by nigericin.</a> The Journal of Immunology. 149 (4), 1294-1303 (1992).</li><li>Cheneval, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mature+interleukin-1&#946;+(IL-1&#946;)+secretion+from+THP-1+cells+induced+by+nigericin+is+a+result+of+activation+of+p45+IL-1&#946;-converting+enzyme+processing.">Increased mature interleukin-1&#946; (IL-1&#946;) secretion from THP-1 cells induced by nigericin is a result of activation of p45 IL-1&#946;-converting enzyme processing.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (28), 17846-17851 (1998).</li><li>Fernandes-Alnemri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyroptosome:+a+supramolecular+assembly+of+ASC+dimers+mediating+inflammatory+cell+death+via+caspase-1+activation.">The pyroptosome: a supramolecular assembly of ASC dimers mediating inflammatory cell death via caspase-1 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 14 (9), 1590-1604 (2007).</li><li>Lu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+polymerization+mechanism+for+the+assembly+of+ASC-dependent+inflammasomes.">Unified polymerization mechanism for the assembly of ASC-dependent inflammasomes.</a> Cell. 156 (6), 1193-1206 (2014).</li><li>Muller-Eberhard, U., Javid, J., Liem, H. H., Hanstein, A., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+Plasma+concentrations+of+hemopexin,+haptoglobin+and+heme+in+patients+with+various+hemolytic+diseases.">Brief report: Plasma concentrations of hemopexin, haptoglobin and heme in patients with various hemolytic diseases.</a> Blood. 32 (5), 811-815 (1968).</li><li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions.">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).</li><li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heterodimeric+cysteine+protease+is+required+for+interleukin-1&#946;processing+in+monocytes.">A novel heterodimeric cysteine protease is required for interleukin-1&#946;processing in monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li><li>Jensen, K., Anderson, J. A., Glass, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+small+interfering+RNA+(siRNA)+delivery+into+bovine+monocyte-derived+macrophages+by+transfection+and+electroporation.">Comparison of small interfering RNA (siRNA) delivery into bovine monocyte-derived macrophages by transfection and electroporation.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 158 (3-4), 224-232 (2014).</li><li>Tada, Y., Sakamoto, M., Fujimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+introduction+into+rice+by+electroporation+and+analysis+of+transgenic+plants:+use+of+electroporation+buffer+lacking+chloride+ions.">Efficient gene introduction into rice by electroporation and analysis of transgenic plants: use of electroporation buffer lacking chloride ions.</a> Theoretical and Applied Genetics. 80 (4), 475-480 (1990).</li><li>Bhowmik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+in+wheat+microspores+using+CRISPR/Cas9.">Targeted mutagenesis in wheat microspores using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6502 (2018).</li><li>Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+the+difference+between+CD80+and+CD86.">What's the difference between CD80 and CD86.</a> Trends in Immunology. 24 (6), 314-319 (2003).</li><li>Kurokawa, M., Kornbluth, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+and+kinases+in+a+death+grip.">Caspases and kinases in a death grip.</a> Cell. 138 (5), 838-854 (2009).</li></ol>

Bu protokol, insan kan örneklerinden izole edilen monositlerden makrofajlar elde etmek için iş akışını ve enflamatuar kaspaz BiFC muhabirlerini hücre canlılığından ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için bir yöntemi açıklar.
Bu protokol, bölünmüş floresan protein Venüs'ün floresan olmayan fragmanları ile kaspaz işe alım alanındaki (CARD) inflamatuar kaspazları etiketlemek için BiFC tekniği35'ten...

Kaspazlar, başlatıcı kaspazlar ve cellat kaspazlar olarak gruplandırılabilen bir sistein aspartat proteazlar ailesidir. Cellater kaspazlar kaspaz-3, -6 ve -7'den oluşur. Doğal olarak hücrelerde dimerler olarak bulunurlar ve apoptoz1'i yürütmek için başlatıcı kaspazlar tarafından bölünürler. Başlatıcı kaspazlar insan kaspazı-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 ve -12'yi içerir. Yakınlığa bağlı dimerizasyon ile aktive olan ve otoproteolitik bölünme 2,3 ile stabilize edilen inaktif zimojenler (pro-kaspazlar) olarak bulunurlar. İnflamatuar kaspazlar, başlatıcı kaspaz2'nin bir alt kümesidir ve insanlarda kaspaz-1, -4, -5 ve -12'yi ve fare 4,5'te kaspaz-1, -11 ve -12'yi kapsar. Apoptotik bir rolden ziyade, inflamasyonda merkezi bir rol oynarlar. Patojenik istilacılara yanıt olarak salınan ilk sitokinler olan pro-interlökin (IL)-1β ve pro-IL-18 6,7'nin proteolitik işlenmesine ve salgılanmasına aracılık ederler 8,9. Caspase-1, aktivasyon platformuna işe alındıktan sonra etkinleştirilir; inflamatuar olarak adlandırılan büyük bir moleküler ağırlıklı protein kompleksi (Şekil 1A)10. Kaspaz-4, -5 ve -11'in dimerizasyonu, kanonik olmayan bir enflamatuar yol11,12 aracılığıyla bu platformlardan bağımsız olarak gerçekleşir.
Kanonik enflamatuarlar, bir enflamatuar sensör proteini, adaptör protein ASC (CARD içeren apoptozla ilişkili leke benzeri protein) ve efektör protein kaspaz-110'dan oluşan sitozolik multimerik protein kompleksleridir. En iyi çalışılmış kanonik enflamatuarlar, bir pirin alanı (NLRP), NLRP1 ve NLRP3 içeren NOD benzeri reseptör ailesi, bir CARD (NLRC), NLRC4 içeren NLR ailesi ve melanom 2'de (AIM2) bulunmayanlardır. Her biri bir pirin etki alanı, bir CARD veya her iki etki alanı içerir. CARD etki alanı, CARD içeren kaspazlar ve bunların yukarı akış aktivatörleri arasındaki etkileşime aracılık eder. Bu nedenle, bir N-terminal pirin alanı (PYD) ve bir C-terminal CARD motifi 13,14'ten oluşan iskele molekülü ASC, NLRP1 10, NLRP315 ve AIM216 enflamatuarlarına kaspaz-1'in alınması için gereklidir.
Her enflamatuar, farklı pro-inflamatuar uyaranları tanıyan benzersiz sensör proteininden sonra adlandırılır (Şekil 1B). Bu yolun aktivatörlerine kanonik uyaranlar denir. Enflamatuarlar, mikrobiyal bileşenler ve doku stresi için sensörler görevi görür ve enflamatuar kaspazların aktivasyonu yoluyla sağlam bir enflamatuar yanıtı tetiklemek için bir araya gelir17. Enflamatuar düzenek, ana substratları pro-IL-1β ve pro-IL-18'in olgunlaşmasına ve salgılanmasına aracılık etmek için kaspaz-1 aktivasyonunu başlatır. Bu işlem iki adımlı bir mekanizma ile gerçekleşir. İlk olarak, bir astarlama uyaranı, NF-κB yolunun aktivasyonu yoluyla bazı enflamatuar proteinlerin ve pro-IL-1β'nin ekspresyonunu düzenler. İkincisi, hücre içi (kanonik) bir uyaran, enflamatuar montaja ve prokaspaz-1 6,7'nin işe alınmasına neden olur.
Kaspaz-4 ve kaspaz-5, murin kaspaz-11 11'in insan ortologlarıdır. Gram-negatif bakterilerin dış zarında bulunan bir molekül olan hücre içi lipopolisakkarit (LPS) 18,19,20 ve kırmızı kan hücresi hemolizi 21'in bir ürünü olan hücre dışı heme ile enflamatuardan bağımsız bir şekilde aktive edilirler. LPS'nin doğrudan bu proteinlerin CARD motifine bağlandığı ve oligomerizasyonlarını indüklediği öne sürülmüştür20. Kaspaz-4 veya kaspaz-5'in aktivasyonu, gözenek oluşturan protein gasdermin D'nin (GSDMD) bölünmesi yoluyla piroptoz adı verilen enflamatuar bir hücre ölümü formunu indükleyerek IL-1β salınımını teşvik eder18,19. Ek olarak, kaspaz-4 ve GSDMD aracılı piroptotik ölümden kaynaklanan potasyum iyonlarının efflüksü, NLRP3 enflamatuarının aktivasyonunu ve ardından kaspaz-122,23'ün aktivasyonunu indükler. Bu nedenle, kaspaz-4, -5 ve -11, spesifik uyaranlar 11,24'e yanıt olarak piroptoz ve kaspaz-1 aktivasyonunu indükleyebilen LPS için hücre içi sensörler olarak kabul edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Şekil 1: İnflamatuar kaspazlar ve kaspaz-bimoleküler floresan kompleman (BiFC) testi. (A) Venüs'ün floresan olmayan her bir parçasına (Venüs-C veya Venüs-N) bağlı iki kaspaz-1 prodomaininin (C1-pro) NLRP3 aktivasyon platformuna alındığı ve Venüs'ü refere ve floresan yapmaya zorlayan kaspaz-BiFC sistemini gösteren diyagram. Bu kompleks mikroskop altında yeşil bir nokta olarak görünür ve başlatıcı kaspaz aktivasyonunda ilk adım olan inflamatuar kaspaz kaynaklı yakınlık için bir okuma görevi görür. (B) Enflamatuar bileşenlerin ve inflamatuar kaspazların etki alanı organizasyonunu gösteren şematik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Spesifik başlatıcı kaspaz aktivasyonunu ölçmek zordur ve görüntüleme yaklaşımlarıyla bunu yapmak için çok fazla yöntem yoktur. Kaspaz Bimoleküler Floresan Komplemanı (BiFC), doğrudan canlı hücrelerde inflamatuar kaspaz aktivasyonunu görselleştirmek için kullanılabilir (Şekil 1A)25. Bu teknik yakın zamanda insan monosit türevi makrofajlarda (MDM) kullanılmak üzere uyarlanmıştır (MDM)21. Kaspaz BiFC, dimerizasyonu kolaylaştırmak için inflamatuar kaspaz aktivasyonundaki ilk adımı, indüklenmiş yakınlığı ölçer. Fotolanabilir sarı floresan protein Venüs'ün (Venüs-C [VC]) ve Venüs-N [VN]) floresan olmayan fragmanlarına kaynaşmış CARD içeren kaspaz prodomainini kodlayan plazmidlerin ekspresyonu kullanılır. İki kaspaz prodomaini aktivasyon platformlarına alındığında veya indüklenmiş yakınlığa maruz kaldığında, Venüs'ün iki yarısı yakına getirilir ve refold ve floresan yapmaya zorlanır (bkz. Şekil 1A, B). Bu, spesifik inflamatuar kaspaz aktivasyonunun gerçek zamanlı bir okumasını sağlar.
İnsan MDM'si, tehlike sinyallerini ve patojen ürünlerini tanımlayan enflamatuar genleri ve patern tanıma reseptörlerini bolca eksprese eder. Bu, inflamatuar kaspaz yolaklarının sorgulanması için ideal bir hücre tipi sağlar. Ek olarak, periferik kandan ve hatta belirli bir hastalık durumunda inflamatuar kaspaz aktivasyonunu değerlendirmek için hasta örneklerinden türetilebilirler. Bu protokol, elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon yöntemi olan nükleofeksiyon kullanılarak BiFC kaspaz muhabirlerinin MDM'ye nasıl tanıtılacağını, inflamatuar kaspaz aktivasyonunu indüklemek için hücrelerin nasıl tedavi edileceğini ve mikroskopi yaklaşımlarını kullanarak aktif kaspaz komplekslerinin nasıl görselleştirileceğini açıklamaktadır. Ek olarak, bu metodoloji, bu komplekslerin moleküler bileşimini, hücre altı lokalizasyonunu, kinetik ve bu yüksek sıralı yapıların büyüklüğünü belirlemek için uyarlanabilir25,26,27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

İnflamatuar kaspazlar kaspaz-1, -4, -5, -11 ve -12'yi içerir ve başlatıcı kaspazların alt grubuna aittir. Kaspaz-1, enflamatuar sinyalizasyonun doğru düzenlenmesini sağlamak için gereklidir ve enflamatuarlara işe alımı takiben yakınlık kaynaklı dimerizasyon ile aktive edilir. Kaspaz-1, monositik hücre soyunda bol miktarda bulunur ve pro-inflamatuar sitokinlerin interlökin (IL)-1β ve IL-18'in aktif salgılanan moleküllere olgunlaşmasını indükler. Diğer inflamatuar kaspazlar, kaspaz-4 ve -5 (ve bunların murin homolog kaspaz-11), pirotozu indükleyerek IL-1β salınımını teşvik eder. Kaspaz Bimoleküler Floresan Komplesyonu (BiFC), kaspaz aktivasyonunun bir okuması olarak inflamatuar kaspaz kaynaklı yakınlığı ölçmek için kullanılan bir araçtır. Enflamatuara bağlanan bölgeyi içeren kaspaz-1, -4 veya -5 prodomain, kaspazlar indüklenen yakınlığa maruz kaldığında floresan Venüs kompleksini reforme etmekle ilişkili sarı floresan protein Venüs'ün (Venüs-N [VN] veya Venüs-C [VC]) floresan olmayan parçalarına kaynaştırılır. Bu protokol, bu muhabirlerin nükleofeksiyon kullanarak birincil insan monosit kaynaklı makrofajlara (MDM) nasıl tanıtılacağını, inflamatuar kaspaz aktivasyonunu indüklemek için hücrelerin nasıl tedavi edileceğini ve floresan ve konfokal mikroskopi kullanarak kaspaz aktivasyonunun nasıl ölçüleceğini açıklamaktadır. Bu yaklaşımın avantajı, canlı hücrelerdeki inflamatuar kaspaz aktivasyon kompleksinin bileşenlerini, gereksinimlerini ve lokalizasyonunu tanımlamak için kullanılabilmesidir. Bununla birlikte, hücre canlılığından ve davranışından ödün vermemek için dikkatli kontrollerin göz önünde bulundurulması gerekir. Bu teknik, enflamatuar düzeyde dinamik kaspaz etkileşimlerinin analizi ve canlı MDM ve insan kan örneklerinden türetilen monositlerdeki inflamatuar sinyal kaskadlarının sorgulanması için güçlü bir araçtır.

Şekil 2'de gösterilen şema, insan MDM'sinin nasıl elde edileceğine, transfekte edileceğine ve görüntüleneceğine dair genel bir bakış sunmaktadır. seçilen CD14 + monositlerinin GM-CSF ile 7 gün boyunca inkübasyonundan sonra, hücre morfolojisi farklılaşma periyodu boyunca değişir (Şekil 3A), küresel süspansiyon hücrelerinden ve tamamen bağlı (gün 3 ve 4), ve son olarak, tamamen farklılaştığında daha fazla yayılmış hücrelere (7...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Bu protokol, insan kan örneklerinden monosit türevi makrofajlar (MDM) elde etmek için iş akışını, enflamatuar kaspaz Bimoleküler Floresan Kompleman (BiFC) muhabirlerini hücre canlılığı ve davranışından ödün vermeden insan MDM'sine verimli bir şekilde tanıtmak için basit bir yöntemi ve canlı hücrelerde enflamatuar kaspaz aktivasyonunu ölçmek için görüntüleme tabanlı bir yaklaşımı açıklamaktadır.

İnsan Monosit Kaynaklı Makrofajlarda İnflamatuar Kaspazların İndüklenen Yakınlığının Görselleştirilmesi

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Bu protokol önemlidir, çünkü belirli bir hastalık durumundaki canlı hücrelerde moleküler düzeyde inflamatuar kaspaz yolunu görselleştirmek ve sorgulamak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer immün hücrelerdeki inflamatuar kaspaz aktivasyon komplekslerinin bileşenlerini, gereksinimlerini ve lokalizasyonunu tanımlamak için kullanılabilmesidir. Küçük optimizasyonlarla, bu yöntem diğer birincil hücrelere ve oligomerizasyon ile aktive edilen bir dizi proteine uyarlanabilir ve uygulanabilirliği mikroskobik metodolojilerle sınırlı değildir.İlk olarak, ortamı 10 santimetrelik bulaşıklarda tamamen farklılaşmış makrofajlardan aspire edin ve hücre tek katmanını ılık serum içermeyen RPMI-1640 ortamı ile yıkayarak tüm ortamları tamamen çıkarın. 10 santimetrelik çanak başına iki mililitre% 0.25 ılık tripsin-EDTA çözeltisi ekleyerek hücreleri hasat edin. Tripsin-EDTA'yı bir P-1000 mikropipet ile tüm çanak boyunca yukarı ve aşağı doğru yavaşça pipetleyin, ardından süspansiyonu beş mililitre sıcak tam kültür ortamı içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.Parlak alan mikroskobu altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve gerekirse tekrar ayırın. Ortamı aspire edin ve hücreleri 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 10 mililitre 1X steril PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücre sayısını belirlemek için 20 mikrolitrelik bir aliquot alın.Transfeksiyon başına bir ila iki kez 10 ila beşinci hücre alın ve bunları 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Önceden ısıtılmış 1X steril PBS ile 15 mililitrelik son hacme getirin. PBS'yi aspire edin ve 250 x g'de bir dakika boyunca bir kez daha santrifüj yapın.P-200 mikropipeti kullanarak hücre peletinden kalan PBS'yi çıkarın. Transfeksiyon başına 1,5 mililitrelik steril bir mikrotüp alın ve kaputa uygun muhabir plazmidini ve kaspaz BiFC plazmidlerini ekleyin. Pipet istasyonunu, cihazı, uçları, elektroporasyon tüplerini ve pipeti steril laminer akış başlığına yerleştirin.Nükleofeksiyon cihazını bağlayın ve açın. Transeksiyon parametrelerini görüntülenen başlangıç ekranına girin. Voltaj üzerine basın, 1000 girin ve 1000 volta ayarlamak için Bitti düğmesine basın.Genişlik üzerine basın, 40 girin ve darbeyi 40 milisaniyeye ayarlamak için Bitti düğmesine basın. Son olarak, elektrik darbelerinin sayısını 2 olarak ayarlamak için Darbeler üzerine basın, 2 girin ve Bitti düğmesine basın. Elektroporasyon tüplerinden birini alın ve oda sıcaklığında üç mililitre elektrolitik tampon E ile doldurun.Elektroporasyon tüpünü pipet istasyonundaki pipet tutucuya yerleştirerek tüpün yan tarafındaki elektrotun içe baktığından ve tüp takıldığında bir tıklama sesi duyulduğundan emin olun. Hücre peletini alın ve beşinci hücrelere her biri için 10 ila iki kez 10 kez 10 mikrolitre önceden ısıtılmış resüsitasyon R tamponu ekleyin ve bir P-20 mikropipeti ile hafifçe karıştırın. Her transfeksiyon tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve bir P-20 mikropipeti ile hafifçe karıştırın.Basmalı düğmeye ikinci durağa kadar basarak pipete bir uç yerleştirin ve kelepçenin uçtaki pistonun montaj sapını tamamen aldığından emin olun. Ardından, pipet üzerindeki basma düğmesine ilk durağa basın ve numuneyi aspire etmek için hücre veya plazmid DNA karışımı içeren ilk tüpe daldırın. Pipetin tıkırdadığından ve uygun şekilde yerleştirildiğinden emin olmak için pipeti numuneyle birlikte çok dikkatli bir şekilde pipet tutucuya yerleştirin.Dokunmatik ekranda başlat düğmesine basın ve elektrik darbeleri teslim edilene kadar bekleyin. Pipetleri istasyondan yavaşça çıkarın ve hemen transekte edilmiş hücre süspansiyonunu, basma düğmesine ilk durağa yavaşça basarak önceden ısıtılmış antibiyotik içermeyen ortamla ilgili kuyuya ekleyin. Plakayı transekte hücrelerle hafifçe sallayın ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe bir ila üç saat inkübe edin, ardından her bir kuyucuğa 200 mikrolitre önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin.Çanağı inkübatöre yerleştirin ve gen ekspresyonu için en az 24 saat bekleyin. Ertesi gün, bir epifloresan mikroskobu kullanarak hücre canlılığını ve transfeksiyon verimliliğini inceleyin. Ortamı bir P-1000 mikropipeti ile hücrelerden dikkatlice çıkarın ve kuyucuğun kenarına 500 mikrolitre uyaran çözeltisi ekleyin.Tedavi edilmemiş kontrol kuyularını çalıştırmak için, uyaran olmadan bir görüntüleme ortamı ekleyin. Bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görselleştirmek için, talimatları izleyerek mikroskopu ve floresan ışık kaynağını açın. 10 kez veya 20 kez hedefi seçin ve kültür kabını mikroskop aşamasına yerleştirin.Göz merceği ile 568 nanometre filtrenin altındaki hücreleri bulun. Ve muhabirin kırmızı hücrelerini ifade eden hücrelere odaklanın. Görme alanındaki tüm kırmızı hücreleri sayın.Aynı görsel alandayken, 488 veya 512 filtrelerine geçin, aynı zamanda yeşil olan kırmızı hücrelerin sayısını sayın. En az üç alandan en az 100 kırmızı hücre sayın. Venüs-pozitif transekte hücrelerin görme alanı başına yüzdesini hesaplayın ve standart sapmayı elde etmek için her tedavi için ortaya çıkan yüzdelerin ortalamasını alın.Bir epifloresan veya konfokal mikroskop kullanarak hücreleri görüntülemek için, bilgisayar ekranındaki hücrelerin canlı görüntüsünü kamera tarafından elde edildiği şekilde görselleştirin. Joystick kontrolünü ve odak tekerleğini kullanarak hücrelerin odağına ve konumuna ince ayar yapın. 512 nanometre veya 488 nanometre ve 568 nanometre lazerler için yüzde lazer gücünü ve pozlama süresini ayarlayın, böylece görüntüdeki sinyal doygunluk olmadan iyi görünür.Canlı çekimi açın ve elde edilen görüntüyü inceleyerek her iki kanalın ekran histogramlarında her kat için ayrı bir tepe noktası görülmesini sağlayın. Hücrelerin canlı görüntüsünü görselleştirirken, plakanın her bir kuyucuğu için mCherry veya dsRedmito muhabirini ifade eden bir veya daha fazla hücre içeren bir alanın birden fazla temsili görüntüsünü alın. GM-CSF ile yedi gün boyunca inkübe edilen seçilmiş CD-14 pozitif monositler, farklılaşma periyodu boyunca hücre morfolojisinde, küresel süspansiyon hücrelerinden ve tam olarak bağlanmış ve son olarak, tamamen farklılaştığında daha fazla yayılmış hücrelere giden değişiklikler gösterdi.Tamamen farklılaşmış hücreler, transekte hücreleri etiketlemek için kullanılan muhabir plazmid dsRedmito ile birlikte kaspaz BiFC çiftleri VC ve VN ile transekte edildi. Tedavi edilmeyen hücreler Venüs floresansı göstermedi. Ve nijeris ile tedavi edilen hücrelerde, kaspaz-1 BiFC, ASC lekelerinin tipik şekline sahip tek bir punctum olarak ortaya çıktı.Venüs pozitif MDM'nin kantitasyonu, en yüksek kaspaz-1 BiFC yüzdesinin LPS artı nigerisin tedavi grubunda görüldüğünü göstermiştir. Kaspaz-1, 4 ve 5 pro-BiFC çiftlerinin plazmid titrasyonunda, Venüs pozitif hücrelerin en yüksek yüzdesi sırasıyla 400, 500 ve 1.000 nanogram transekte plazmidden kaynaklanmıştır. Transeksiyondan 24 saat sonra bir hücre alanının 20 katı bir hedefle elde edilen konfokal görüntüler, tedavi edilmemiş transekte hücrelerin mitokondri sağlam olduğu için canlı olduğunu göstermiştir.Hem ile tedaviden sonra, kaspaz-1 kompleksi, nijerin tarafından indüklenene benzer tek bir yeşil punctum olarak ortaya çıkar. Farklılaşma, transfeksiyon ve tedavi sırasında sert koşullardan ve hücrelerin aşırı manipülasyonundan kaçınmayı unutmayın, çünkü spontan aktivasyona ve yüksek arka plan kaspaz aktivasyonu seviyelerine neden olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Akış Sitometresi ile Merkezi Sinir Sisteminden Mikroglia ve Monosit Türevi Makrofajların Analizi

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

Glukoz-6-Fosfat İzomazlarında (G6PI)-Indüklenen RA Farelerde iNKT Hücrelerinin Benimseyici İmmünoterapisi

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Diferansiye İnsan Monosit türevi Makrofajlarda Hücre Dışı Tuzak Salınımının İn Vitro Stimülasyon ve Görselleştirilmesi

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...