Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جائزة وزارة الدفاع للاختراق إلى AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). تم دعم KCR جزئيا من خلال زمالات داخلية: زمالة Pease Cancer Pre-PhD وزمالة Mary Galvin Burden Pre-PhD في العلوم الطبية الحيوية وجامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد ، الجوائز الداخلية: منحة أبحاث أطروحة لجنة زمالة مجلس الدراسات العليا وجائزة برنامج سنة أطروحة قسم الدراسات العليا. يشكر المؤلفون جيليان م. رايت وأليسا م. كوماري على المساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها في وقت مبكر لهذه الطريقة.

تمت الموافقة على جميع إجراءات ومناولة الحيوانات من قبل جامعة كاليفورنيا ، لجنة ريفرسايد المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها ، وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن الجمعية الأمريكية لرعاية المختبر ، ووزارة الزراعة الأمريكية ، والمعاهد الوطنية للصحة. استخدمت الطريقة الموصوفة C57BL/6 م?...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

الأجزاء الثلاثة من قناة البيض متميزة نسيجيا ومورفولوجيا ووظيفيا1،2،3. تختلف الظهارة اختلافا كبيرا من أحد طرفي قناة البيض إلى الطرف الآخر. تهيمن الخلايا الهدبية في الطرف الوهمي/القاعي، بينما تهيمن الخلايا الإفرازية في المنطقة البرزخية1.<su...

تتشابه قناة البيض الفئرانية في وظيفتها ومورفولوجيتها مع قناة فالوب البشرية1. يتكون كلاهما من ظهارة هدبية زائفة ، تتكون من خليتين مقيمتين ظهاريتين موصوفتين تاريخيا: الخلايا الهدبية والخلايا الإفرازية1,2. تحتوي قناة البيض على ثلاثة أجزاء معترف بها كلاسيكيا: infundibulum و ampulla و isthmus. في دراسة حديثة ، Harwalkar et al. 3 بحث في مورفولوجيا قناة البيض والتعبير الجيني مما أدى إلى توسيع تصنيف الخلايا الظهارية المقيمة إلى سبع مجموعات سكانية متميزة. بالإضافة إلى ذلك ، أنشأوا تقاطع البرزخ الأمبولاري كجزء متميز من قناة البيض3. يمكن بسهولة توسيع الطريقة الموصوفة هنا ، والتي تركز على infundibulum و ampulla و برزخ ، لتشمل التقاطع الأمبولاري البرزخي أيضا2,3. تحتوي المنطقة القاعية على ostium ، أو فتحة قناة البيض ، وتشمل المنطقة fimbrial وكذلك الساق القريبة. بالانتقال نحو الرحم ، التالي هو الأمبولا ، ثم البرزخ. الخلايا الهدهدية هي الأكثر بروزا في الطرف البعيد من المنطقة ، بالقرب من المبيض ، أو infundibulum ، في حين أن الخلايا الإفرازية هي الأكثر بروزا في الطرف القريب أو جزء البرزخ 1. على عكس قناة فالوب البشرية ، فإن قناة البيض الفئران هي بنية ملفوفة مدعومة من الميزوسالبينكس ، وهو امتداد للرباط العريض الصفاق 1,4. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغليف قناة بيض الفأر في كيس جرابي يزيد من احتمال نقل البويضات إلى قناة البيض4. يتم تحديد الأمبولا على أنها موقع الإخصاب ، الذي تمر منه الأجنة النامية إلى البرزخ قبل دخول الرحم5. يبلغ قطر الأجزاء البوقية 200-400 ميكرومتر ويبلغ طول المناطق الأطول من الأمبولاري والبرزخ حوالي 0.5-1.0 سم4. تتوزع قناة البيض خلال دورة الاستروس والأمبولا و infundibulum أكثر قابلية للتمدد من البرزخ1.
إن الإفراط في انتشار الخلايا، وخاصة الخلايا الإفرازية، يميز آفات السلائف إلى الأورام المصلية الموجودة في تجويف الحوض6. تنشأ هذه الآفات المصلية داخل الظهارة السلائف في ظهارة قناة البيض فقط في المنطقة الفيمبرية. من غير المعروف لماذا يقتصر تكوين الآفة على هذه المنطقة حيث عادة ما يكون نوع الخلايا السائد مهدبا ، وليس إفرازيا2،7،8. تؤكد الإقليمية من حيث الوظيفة الفسيولوجية الطبيعية ، وكذلك الاهتمام المتزايد بالأصل القضوي لسرطان المبيض 9،10،11،12،13 ، على أهمية التقييم المنفصل لقطاعات قناة البيض.
تفصل الطريقة الموصوفة هنا جمع شرائح قنوات البيض المنفصلة للتحليلات اللاحقة في المصب للتعبير الجيني الخاص بالشرائح ووظيفة الخلايا المنفصلة. تقليديا ، تتم معالجة العديد من الأنسجة لاستخراج الحمض النووي الريبي بالكامل باتباع إما الفينول: طريقة الكلوروفورم أو طريقة الاستخراج الكامل على العمود. ومع ذلك ، وجدنا أنه تم الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي مع إنتاج عائد كاف باستخدام طريقة الجمع الموصوفة. باستخدام هذه الطريقة، يمكن معالجة أجزاء وظيفية صغيرة جدا من قناة البيض للتحليلات النهائية بدلا من التحقيق في قناة البيض ككل، والتي يمكن أن تخفي النتائج التي تمثل القطاعات المختلفة14.
نادرا ما تم التحقيق في الخلايا المبيضية الفئرانية المنفصلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، على الأرجح بسبب الحد من إنتاجية الخلايا من هذا الأنسجة. كان أحد الأساليب للتغلب على هذه المشكلة هو فصل الخلايا ، وتنميتها في الثقافة ، ثم تحفيز إعادة التمايز في المختبر للحصول على أرقام الخلايا المناسبة لتحليل الخلايا في المراحل النهائية15،16،17،18. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو الوقت خارج الجسم الحي والبيئة الدقيقة المتغيرة في الثقافة ، وكلاهما من المحتمل أن يغير التعبير الجيني. هناك أيضا افتراض بأن إعادة التمايز المورفولوجي لها نفس التوقيع النسخي والبروتيني كما كان موجودا في الحيوان السليم. تم تصميم طريقة التفكك الحالية لتحقيق أكبر عدد من الخلايا الظهارية في مجموعة خلايا القنوات البيضاوية غير المتجانسة مع الحفاظ على تمايز الخلية الواحدة. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن يحد النهج غير الأنزيمي في الغالب من فقدان بروتينات سطح الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

أنظمة نماذج الفئران لا مثيل لها لتحليل عمليات المرض بسبب قابليتها للتلاعب الجيني وانخفاض تكلفة العلاجات التجريبية. ومع ذلك ، بسبب صغر حجم الجسم ، أثبتت بعض الهياكل ، مثل قناة البيض التي يبلغ قطرها 200-400 ميكرومتر ، أنه من الصعب نسبيا دراستها إلا عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية. في الآونة الأخيرة ، كشفت الدراسات الكيميائية النسيجية المناعية عن اختلافات أكثر تعقيدا في قطاعات قناة البيض مما كان معترفا به سابقا. وبالتالي ، تنقسم قناة البيض إلى أربعة أجزاء وظيفية بنسب مختلفة من سبعة أنواع متميزة من الخلايا الظهارية. من المحتمل أن تجعل الأصول والنسب الجنينية المختلفة لأنواع الخلايا الظهارية المناطق الوظيفية الأربع عرضة للأمراض بشكل مختلف. فعلى سبيل المثال، تنشأ آفات السلائف للسرطان المصلي داخل الظهارة من الإنفونديبولوم في نماذج الفئران ومن المنطقة الفيمبرية المقابلة في قناة فالوب البشرية. يفصل البروتوكول الموصوف هنا طريقة للتشريح المجهري لتقسيم قناة البيض بطريقة تنتج كمية كافية ونقاء من الحمض النووي الريبي الضروري للتحليل النهائي مثل النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq). كما وصفت طريقة تفكك الأنسجة غير الأنزيمية في الغالب المناسبة لقياس التدفق الخلوي أو تحليل RNAseq أحادي الخلية للخلايا البيضية المتمايزة تماما. ستسهل الطرق الموصوفة إجراء مزيد من الأبحاث باستخدام قناة البيض الفئرانية في مجال التكاثر والخصوبة والسرطان والمناعة.

ينتج بروتوكول التفكك الموصوف 100،000-120،000 خلية لكل فأر مع تجميع كل من قنوات البيض. هذه الطريقة لطيفة بما يكفي لترك حدود الخلايا متعددة الأهداب سليمة ، مما يسمح بالتمييز بين الخلايا متعددة الأهداب والخلايا الإفرازية ، والتحقق من أن طريقة الهضم لطيفة بما يكفي لمنع إزالة التمايز. تظهر صور التأل...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

يتم تقديم طريقة للتشريح المجهري لقناة بيض الفأر تسمح بجمع الأجزاء الفردية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف إجراء تفكك الخلايا البيضوية غير الأنزيمية. الطرق مناسبة لتحليل الجينات والبروتين اللاحق للقطاعات البيضية المختلفة وظيفيا والخلايا البيضوية المنفصلة.

التشريح المجهري وتفكك قناة المبيض المورينية: تحديد الجزء الفردي وعزل الخلية الواحدة

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

شرائح قناة البيض المختلفة لها وظائف فسيولوجية متميزة وهي عرضة بشكل تفاضلي للتغير المرضي. يعد تحديد الأجزاء المختلفة في قناة بيض فأر صغيرة جدا أمرا صعبا ، وكذلك إنتاج عائد جيد من الخلايا المتمايزة جيدا عن طريق تفكك الأنسجة. في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية فك قناة بيض الفأر ، والتعرف على الأجزاء المختلفة بحيث يمكن تحليلها بشكل فردي ، وأخيرا ، كيفية إنتاج غلة عالية نسبيا من الخلايا المنفصلة المتباينة.قد يؤدي الفهم الأفضل للبيئة الخاصة بالأمبولا إلى تحسين تقنيات الإخصاب في المختبر. أيضا ، من خلال مقارنة infundibulum مع شرائح أخرى ، قد نفهم بشكل أفضل ميل infundibulum للتحول الخبيث. يقوم إجراء التفكك أحادي الخلية بتحرير الخلايا اللحمية والظهارية من قناة البيض.توفر طريقتنا أيضا فرصا لتحليل مساهمات الخلايا المناعية والعضلات الملساء والخلايا الظهارية بشكل منفصل في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في قناة البيض. قد يكون العمل تحت مجهر التشريح صعبا في البداية. أنصح بالتدرب على أنبوب أكبر مثل الرحم للتأكد من أن أدواتك كافية للتسلخ المجهري لقناة البيض.ابدأ بلصق قطعة من شمع الأسنان على طبق بتري بمادة لاصقة واتركها تجف. ثم قم بتعقيم الطبق بنسبة 70٪ من الإيثانول. السطح جاهز الآن للتشريح.شل حركة طبق بتري الذي يحتوي على شمع الأسنان على المنصة الباردة تحت مجهر تشريح عندما يكون جاهزا للتشريح. تطهير السطح البطني للحيوان بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم افتح تجويف البطن والحوض بمقص تشريح معقم.حرك الجهاز الهضمي إلى جانب واحد لتحديد موقع الرحم الظهري ثنائي القرن. اتبع كل قرن رحمي على السطح لتحديد موقع كل قناة بيض ومبيض مغلفة في وسادة الدهون الرحمية أسفل الكلى مباشرة. ثم قم باستئصال كل من قنوات البيض الجانبية مع المبيضين وجزء من قرن الرحم البعيد الذي لا يزال متصلا باستخدام مقص التشريح.قطع كل قرن رحمي جانبي مع ما يقرب من واحد إلى اثنين سنتيمترات من القرن لا يزال متصلا بقناة البيض الملفوفة والمبيض. غمر الأنسجة على الفور في ملليلتر من وسط التشريح البارد ، ثم قم بلصق أنسجة الرحم على شمع الأسنان بإبرة قياس 25 معقمة لتأمين الأنسجة للتشريح. تنظيف وتشريح وسادة الدهون المبيض والنسيج الضام لتصور قناة البيض بوضوح.استخدم حقنة ملليلتر واحدة لتوزيع قطرة إلى قطرتين من محلول صبغة التولويدين الأزرق المعقم بنسبة 1٪ واحتضانه لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. شطف مع DPBS الباردة ثم إزالة كل السائل. اسحب المبيض برفق من قناة البيض الملفوفة.قطع في الغشاء الجراب في الرباط العريض لإزالة المبيض من قناة البيض دون المساس بالأنسجة البوقية. حدد موقع الطرف الفيمبري البعيد لقناة البيض الموجودة جانبيا لتقاطع البوق الرحمي. اسحب الأنبوب بلطف واقطعه بعيدا عند الميزوسالبينكس باستخدام مقص صغير زنبركي لفك قناة البيض.قطع الأنبوب لإنتاج المنطقة القاعية. ثم قم باستئصال المنطقة الأمبولية عن طريق القطع بين الدورتين الثانية والثالثة. أخيرا ، قم بقطع الجزء المتبقي إلى تقاطع أنبوب الرحم وهو منطقة البرزخ.قم على الفور بتجميد أجزاء الأنسجة المشوهة في النيتروجين السائل ثم أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي البارد ومزيج خرزة التجانس الفردي إلى الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي. بدءا من منطقة فيمبرال ، شق الأنبوب طوليا باستخدام مقص زنبركي الشكل واستخدم الملقط كوسيلة ضغط لفضح الظهارة المضيئة. افرم الأجزاء المفتوحة من الشق وقناة البيض المتبقية إلى ما يقرب من جزء واحد إلى مليمترين.ثم أضف خمسة ملليلترات من العازلة الدافئة غير الأنزيمية إلى الأنسجة واحتضنها عند 37 درجة مئوية. تظهر هنا صور تباين الفلورسنت والطور لعنقود خلوي إيجابي للأوكلودين والنوى والتوبولين الأسيتيلات. الأحمر يدل على أوكلودين ، والأزرق يدل على النوى ، والأخضر يدل على توبولين أسيتيلات.تبقى الحدود القمية الهدبية سليمة طوال البروتوكول وتقاوم المزيد من الهضم للخلايا المفردة. في هذه الصور التمثيلية ، يتم عرض القنوات المدمجة والحمراء والزرقاء وتباين الطور والخضراء. بعد حضانة pronase قصيرة ، تكون غالبية الخلايا مفردة.يظهر تلطيخ يوديد البروبيديوم قابلية البقاء بنسبة 93٪ تقريبا في Brightfield ، وإيجابية PI للقناة الحمراء ، والدمج. يظهر التضمين عند الدمج حدا هدبيا سليما على خلية واحدة منفصلة. هذه الخلايا لديها بنشاط ضرب الأهداب.تم تقييم الحمض النووي الريبي الكامل من حيث الإنتاجية والجودة بواسطة مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم والمحلل الحيوي. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تنتج 800 إلى 1،200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لكل جزء باستثناء العينات غير القاعية حيث قد يكون التجمع من حيوانين ضروريا للحصول على عائد مناسب للفحوصات النهائية. يتم تجميع النتائج المقدمة ل infundibulum من حيوانين ، يبلغ مجموعهما أربع مناطق غير قابلة للتمويل.يحقق هذا البروتوكول بنجاح الحمض النووي الريبي النقي الذي تم تحليله باستخدام مقياس الطيف الضوئي صغير الحجم ومحلل حيوي. تحتوي العينات على نسبة امتصاص 260 × 280 نانومتر بين 1.8 و 2 ، وهي نموذجية لأنواع نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي النقية. أظهر التحليل الحيوي للعينات سلامة عالية للحمض النووي الريبي مع تقييم رقم سلامة الحمض النووي الريبي فوق سبعة ، وهو مناسب للتعبير عن المصب وتحليل التسلسل.تذكر الاحتفاظ بواحد إلى سنتيمترين من قرن الرحم لتثبيت نظام البوق على منصة التشريح. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد استخدام صبغة تولويدين الزرقاء في فك اللفائف السريع لقناة البيض. كلما كان فك اللفائف أسرع ، كان الحفظ أفضل وأقل قدر من تحلل الحمض النووي الريبي.هذه الطريقة كافية للحصول على الحمض النووي الريبي بجودة مناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي مما يسمح بتسلسل المقطع الفردي. يعد تفكك الخلية مناسبا لتسلسل الخلية الواحدة أو قياس التدفق الخلوي مما يسمح بتحليل أكثر دقة للجزء والخلية. ستساعد هذه الطريقة في نقل الحقل إلى ما وراء تحليل الأنبوب بأكمله الذي يخفي الاختلافات على مستوى الشريحة أو الخلية الواحدة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

انفصال الخلايا عن ظهارة اللسان وميسينشيم/ النسيج الضام للفئران الجنينية في اليوم 12.5 و8 أسابيع

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

العزل السريع للخلايا المفردة من الفأر والأسنان البشرية

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

عزل الخلايا البطانية الشبكية للجيل التالي

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

تحديد وعزل وحدة تشكيل الانفجار ووحدة تشكيل المستعمرات أسلاف الإريثرويد من أنسجة الفأر عن طريق قياس التدفق الخلوي

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...