Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af en DoD Breakthrough Award til AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR blev delvist støttet af intramurale stipendier: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship og Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences og University of California, Riverside, intramurale priser: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant og Graduate Division Dissertation Year Program Award. Forfatterne takker Gillian M. Wright og Alyssa M. Kumari for hjælp til tidlig fejlfinding af denne metode.

Alle dyrehåndtering og procedurer blev godkendt af University of California, Riverside institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg og var i overensstemmelse med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metode anvendte C57BL/6 voksne hunmus. Alle dyr blev aflivet ved halshugning forud for vævshøst.
BEMÆRK: En oversigt over protokollen, der bruger et blåt farvestof til at hjælpe...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

De tre segmenter af ovidukten er histologisk, morfologisk og funktionelt forskellige1,2,3. Epitelet varierer meget fra den ene ende af ovidukten til den anden. Cilierede celler dominerer i den fimbriale/infundibulære ende, mens sekretoriske celler dominerer i det istmiske område1. Mens denne samlede gradient er blevet anerkendt i nogen tid, har nyere arbejde afdækket flere forskelle mellem de oviductal...

Murinovidukten er ens i funktion og morfologi til det menneskelige æggeleder1. Begge består af et pseudostratificeret cilieret epitel, der består af to historisk beskrevne epitelceller: cilierede celler og sekretoriske celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkendte segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig undersøgelse, Harwalkar et al. 3 undersøgte oviduktmorfologi og genekspression, hvilket førte til udvidelsen af kategoriseringen af hjemmehørende epitelceller til syv forskellige populationer. Derudover etablerede de det ampullære-isthmus-kryds som et særskilt segment af ovidukten3. Metoden beskrevet heri, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kunne let udvides til også at omfatte det ampullære-istmiske kryds2,3. Den infundibulære region indeholder ostium eller åbning af ovidukten og omfatter den fimbriale region såvel som den proksimale stilk. Bevæger sig mod livmoderen, næste er ampulla, og derefter isthmus. Cilierede celler er mest fremtrædende i den distale ende af regionen, proksimal til æggestokken eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtrædende i den proksimale ende eller isthmussegmentet1. I modsætning til det menneskelige æggeleder er murine-ovidukten en oprullet struktur understøttet af mesosalpinxen, en forlængelse af det brede ledbåndsperitoneum1,4. Derudover er museovidukten indkapslet i en bursal sæk, der øger sandsynligheden for oocytoverførsel til ovidukten4. Ampulla er identificeret som befrugtningsstedet, hvorfra udviklende embryoner passerer ind i isthmusen, inden de kommer ind i livmoderen5. Tubalsegmenter er 200-400 μm i diameter, og de længere ampullære og isthmusregioner er ca. 0,5-1,0 cm lange4. Ovidukten distenderne under østruscyklussen og ampulla og infundibulum er mere distensible end isthmus1.
Overproliferation af celler, især sekretoriske celler, karakteriserer forløberlæsioner til serøse tumorer, der findes i bækkenhulen6. Disse forløber serøse intraepitellæsioner opstår i oviduktepitelet udelukkende i fimbrialområdet; det er ukendt, hvorfor læsionsdannelse er begrænset til denne region, hvor den fremherskende celletype normalt er cilieret, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten med hensyn til normal fysiologisk funktion samt øget interesse for oviduktal oprindelse af æggestokkræft9,10,11,12,13 understreger vigtigheden af separat evaluering af oviduktsegmenterne.
Metoden, der beskrives her, beskriver indsamlingen af separate oviduktale segmenter til efterfølgende downstream-analyser af segmentspecifik genekspression og funktion af dissocierede celler. Traditionelt behandles mange væv til hel RNA-ekstraktion efter enten phenol: chloroformmetoden eller en komplet ekstraktionsmetode på kolonnen; Vi fandt imidlertid, at RNA-kvaliteten blev opretholdt, samtidig med at der blev produceret tilstrækkeligt udbytte med den beskrevne kombinationsmetode. Ved hjælp af denne metode kan meget små funktionelle segmenter af ovidukten behandles til downstream-analyser i stedet for at undersøge ovidukten som helhed, hvilket kan maskere resultater, der er repræsentative for de forskellige segmenter14.
Dissocierede murin oviduktale celler er sjældent blevet undersøgt ved flowcytometri, sandsynligvis på grund af det begrænsende celleudbytte fra dette væv. En tilgang til at overvinde dette problem har været at dissociere celler, dyrke dem i kultur og derefter stimulere redifferentiering in vitro for at opnå passende celletal til nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrænsning af denne tilgang er tiden ex vivo og ændret mikromiljø i kultur, som begge sandsynligvis ændrer genekspression. Der er også en antagelse om, at morfologisk redifferentiering har den samme transkriptionelle og proteomiske signatur, som var til stede i det intakte dyr. Den nuværende dissociationsmetode blev designet til at opnå det højeste antal epitelceller i en heterogen oviduktal cellepopulation, samtidig med at enkeltcelledifferentiering opretholdes. Desuden begrænser den for det meste ikke-enzymatiske tilgang sandsynligvis tabet af celleoverfladeproteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Musemodelsystemer er uovertrufne til analyse af sygdomsprocesser på grund af deres genetiske manipulerbarhed og de lave omkostninger ved eksperimentelle behandlinger. På grund af deres lille kropsstørrelse har nogle strukturer, såsom ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist sig at være relativt vanskelige at studere undtagen ved immunhistokemi. For nylig har immunohistokemiske undersøgelser afdækket mere komplekse forskelle i oviduktsegmenter end tidligere anerkendt; ovidukten er således opdelt i fire funktionelle segmenter med forskellige forhold mellem syv forskellige epitelcelletyper. De forskellige embryologiske oprindelser og forhold mellem epitelcelletyperne gør sandsynligvis de fire funktionelle regioner forskelligt modtagelige for sygdom. For eksempel opstår prækursorlæsioner til serøse intraepiteliale carcinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbriale region i den humane æggeleder. Protokollen beskrevet her beskriver en metode til mikrodissektion til at opdele ovidukten på en sådan måde, at der opnås en tilstrækkelig mængde og renhed af RNA, der er nødvendig til downstream-analyse, såsom omvendt transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekventering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vævssociationsmetode, der er egnet til flowcytometri eller enkeltcelle-RNAseq-analyse af fuldt differentierede oviduktale celler. De beskrevne metoder vil lette yderligere forskning ved hjælp af murine ovidukt inden for reproduktion, fertilitet, kræft og immunologi.

Den beskrevne dissociationsprotokol giver 100.000-120.000 celler pr. Mus med pooling af begge ovidukter. Metoden er skånsom nok til at efterlade multicilierede cellegrænser intakte, hvilket giver mulighed for at skelne mellem multicilierede celler og sekretoriske celler og verificere, at fordøjelsesmetoden er skånsom nok til at forhindre dedifferentiering. Repræsentative immunfluorescensbilleder i figur 5 viser småcelleklumper efter trin 4.2.1, fastgjort i 3 minutter i 4% paraformaldeh...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

En metode til mikrodissektion af museovidukten, der tillader indsamling af de enkelte segmenter, samtidig med at RNA-integriteten opretholdes, præsenteres. Derudover beskrives ikke-enzymatisk oviduktal celle dissociationsprocedure. Metoderne er egnede til efterfølgende gen- og proteinanalyse af de funktionelt forskellige oviduktale segmenter og dissocierede oviduktale celler.

Mikrodissektion og dissociation af Murine-ovidukten: Individuel segmentidentifikation og enkeltcelleisolering

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Forskellige oviduktsegmenter har forskellige fysiologiske funktioner og er forskelligt modtagelige for patologisk forandring. Identifikation af de forskellige segmenter i en meget lille museovidukt er udfordrende, ligesom produktionen af et godt udbytte af veldifferentierede celler ved vævssociation. I denne video vil vi demonstrere, hvordan man vikler museovidukten ud, genkender de forskellige segmenter, så de kan analyseres individuelt, og endelig hvordan man producerer et relativt højt udbytte af differentierede dissocierede celler.En bedre forståelse af det miljø, der er specifikt for ampulla, kan forbedre in vitro-befrugtningsteknikker. Ved at kontrastere infundibulumet med andre segmenter kan vi også bedre forstå infundibulumets tilbøjelighed til ondartet transformation. Enkeltcelle dissociationsproceduren frigør stromal såvel som epitelceller fra ovidukten.Vores metode giver også mulighed for separat at analysere immun-, glatmuskel- og epitelcellebidrag til oviduktens fysiologi og patologi. At arbejde under et dissektionsmikroskop kan være svært i starten. Jeg vil råde til at øve med et større rør som livmoderen for at sikre, at dine værktøjer er tilstrækkelige til oviduktmikrodissektionen.Begynd med at anbringe et stykke tandvoks på en petriskål med klæbemiddel og lad det tørre. Rens derefter skålen med 70% ethanol. Overfladen er nu klar til dissektion.Immobiliser petriskålen, der indeholder tandvoks på den kolde platform under et dissektionsmikroskop, når den er klar til dissektion. Desinficere dyrets ventrale overflade med 70% ethanol. Åbn derefter mave- og bækkenhulen med steril dissektionssaks.Flyt mave-tarmkanalen til den ene side for at lokalisere den dorsale bihornale livmoder. Følg hvert livmoderhorn rostralt for at lokalisere hver ovidukt og æggestok, der er indhyllet i livmoderfedtpuden lige under nyren. Derefter udskæres begge laterale ovidukter med æggestokkene og en del af det distale livmoderhorn, der stadig er fastgjort ved hjælp af dissektionssaks.Skær hvert lateralt livmoderhorn med cirka en til to centimeter af hornet, der stadig er fastgjort til den oprullede ovidukt og æggestok. Sænk vævet straks i to milliliter koldt dissektionsmedium, og anbring derefter livmodervævet på tandvoksen med en steril 25 gauge nål for at sikre væv til dissektion. Rengør og disseker æggestokkens fedtpude og bindevæv for at visualisere ovidukten tydeligt.Brug en sprøjte på en milliliter til at dispensere en til to dråber steril 1% toluidinblå farvestofopløsning og inkubere i 30 sekunder til et minut. Skyl med kold DPBS og fjern derefter al væsken. Træk let æggestokken fra den oprullede ovidukt.Skær ved bursalmembranen i det brede ledbånd for at fjerne æggestokken fra ovidukten uden at gå på kompromis med det rørvæv. Find den distale fimbriale ende af ovidukten, der findes lateralt til livmodertubalkrydset. Træk forsigtigt røret og skær væk ved mesosalpinxen med springform mikrosaks for at vikle ovidukten ud.Skær røret for at producere det infundibulære område. Derefter punktafgiftspligtige det ampullære område ved at skære mellem sving to og tre. Til sidst skæres den resterende del til livmodertubalkrydset, som er den isthmiske region.Snap straks fryse de dissekerede vævssegmenter i flydende nitrogen og tilsæt derefter 200 mikroliter koldt RNA-ekstraktionsreagens og en-til-en homogeniseringsperleblanding til vævet til RNA-isolering. Start ved det fimbriale område, spalt røret i længderetningen med springform saks og brug tang som gearing til at udsætte det lysende epitel. Hak slidsens åbne dele og den resterende ovidukt i ca. en til to millimeter segmenter.Tilsæt derefter fem milliliter varm ikke-enzymatisk dissociationsbuffer til vævet og inkuber ved 37 grader Celsius. Fluorescerende og fasekontrastbilleder af en celleklynge, der er positiv for occludin, kerner og acetyleret tubulin, er vist her. Rød betegner occludin, blå betegner kerner, og grøn betegner acetyleret tubulin.Den cilierede apikale grænse forbliver intakt i hele protokollen og modstår yderligere fordøjelse til enkeltceller. I disse repræsentative billeder vises flettede, røde, blå, fasekontrast og grønne kanaler. Efter en kort pronaseinkubation er flertallet af celler single.Propidiumiodidfarvning viser ca. 93% levedygtighed i Brightfield, rød kanal PI positiv og fusionere. Inset on merge viser en intakt cilieret kant på en enkelt dissocieret celle. Sådanne celler har aktivt slået cilia.Hele RNA blev vurderet for udbytte og kvalitet ved hjælp af mikrovolumspektrofotometer og bioanalytiker. Resultaterne viser, at denne metode giver 800 til 1.200 nanogram RNA pr. segment undtagen infundibulære prøver, hvor pooling fra to dyr kan være nødvendig for passende udbytte til downstream-assays. De præsenterede resultater for infundibulum er samlet fra to dyr, i alt fire infundibulære regioner.Denne protokol opnår med succes rent RNA analyseret med et mikrovolumspektrofotometer og en bioanalytiker. Prøver har et absorptionsforhold på 260 x 280 nanometer mellem 1,8 og 2, typisk for rene RNA-nukleotidarter. Bioanalyse af prøverne viste høj RNA-integritet med vurderet RNA-integritetstal over syv, passende til downstream-ekspression og sekventeringsanalyse.Husk at beholde en til to centimeter af livmoderhornet for at fastgøre rørsystemet på dissektionsplatformen. Derudover hjælper brugen af det toluidinblå farvestof med hurtig udrøjning af ovidukten. Jo hurtigere vikylning, jo bedre er bevarelsen og den mindste mængde RNA-nedbrydning.Denne metode er tilstrækkelig til at opnå RNA af passende kvalitet til RNA-sekventering, der muliggør individuel segmentsekventering. Celledsociationen er egnet til enkeltcellesekventering eller flowcytometri, hvilket muliggør en mere præcis segment- og celleanalyse. Metoden vil hjælpe med at flytte feltet ud over hele røranalyse, der maskerer forskelle på segment- eller enkeltcelleniveau.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolation og kultur af primær epikardielle celler, der stammer fra menneskelige voksen og fostrets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolering af murine spermatogene celler ved hjælp af en Violet-ophidset celle-permeable DNA bindende dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Celle dissociation fra Tongue Epithelium og Mesenchyme / Bindevæv af Embryonale-Day 12,5 og 8-uger gamle mus

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Hurtig isolering af enkeltceller fra mus og menneskelige tænder

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Isolering af murine retinale endotelceller til næste generations sekventering

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Identifikation og isolering af burstdannende enhed og kolonidannende enhed erythroid-forfædre fra musevæv ved flowcytometri

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...