Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een DoD Breakthrough Award aan AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR werd gedeeltelijk ondersteund door intramurale beurzen: de Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship en de Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences en University of California, Riverside, intramurale prijzen: de Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant en de Graduate Division Dissertation Year Program Award. De auteurs bedanken Gillian M. Wright en Alyssa M. Kumari voor hulp bij het vroegtijdig oplossen van problemen met deze methode.

Alle dierbehandeling en -procedures werden goedgekeurd door de University of California, Riverside institutional animal care and use committee en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de American Association for Laboratory Animal Care, het Amerikaanse ministerie van Landbouw en de National Institutes of Health. De beschreven methode maakte gebruik van C57BL/6 volwassen, vrouwelijke muizen. Alle dieren werden geëuthanaseerd door onthoofding voorafgaand aan het oogsten van weefsel.
OP...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

De drie segmenten van de eileider zijn histologisch, morfologisch en functioneel verschillend1,2,3. Het epitheel varieert sterk van het ene uiteinde van de eileider naar het andere. Trilhaarcellen domineren aan het fimbardale/infundibulaire uiteinde, terwijl secretoire cellen domineren in het istmische gebied1. Hoewel deze algemene gradiënt al enige tijd wordt erkend, heeft recent werk meer verschillen t...

De eileider van de muriene lijn is qua functie en morfologie vergelijkbaar met de menselijke eileider1. Beide bestaan uit een pseudostraïstisch trilhaarepitheel, bestaande uit twee historisch beschreven epitheelbewonende cellen: trilhaarcellen en secretoire cellen1,2. De eileider heeft drie klassiek erkende segmenten: het infundibulum, de ampulla en de landengte. In een recente studie, Harwalkar et al. 3 onderzocht ovöcusmorfologie en genexpressie die leidden tot de uitbreiding van de categorisatie van residente epitheelcellen tot zeven verschillende populaties. Bovendien stelden ze de ampullaire-landengte-overgang vast als een apart segment van de eileider3. De hierin beschreven methode, die zich richt op het infundibulum, ampulla en landengte, kan gemakkelijk worden uitgebreid met de ampullaire-isthmische overgang2,3. Het infundibulaire gebied bevat het ostium, of de opening van de eileider, en omvat het fimbriale gebied en de proximale stengel. Als je naar de baarmoeder gaat, is de volgende het ampulla en dan de landengte. Trilhaarcellen zijn het meest prominent in het distale uiteinde van het gebied, proximaal aan de eierstok of infundibulum, terwijl secretoire cellen het meest prominent zijn in het proximale uiteinde of landengtesegment1. In tegenstelling tot de menselijke eileider is de eileider een opgerolde structuur die wordt ondersteund door de mesosalpinx, een uitbreiding van het brede ligament peritoneum1,4. Bovendien is de eileider van de muis ingepakt in een bursale zak die de kans op oöcytoverdracht in de eileider verhoogt4. De ampulla wordt geïdentificeerd als de locatie van bevruchting, van waaruit zich ontwikkelende embryo's in de landengte overgaan voordat ze de baarmoeder binnengaan5. Tubale segmenten hebben een diameter van 200-400 μm en de langere ampullen- en landengtegebieden zijn ongeveer 0,5-1,0 cm lang4. De eileider zwelt op tijdens de oestruscyclus en de ampulla en infundibulum zijn uitzetbaarder dan de landengte1.
Over proliferatie van cellen, vooral secretoire cellen, karakteriseren voorloperlaesies van sereuze tumoren in de bekkenholte6. Deze voorloper sereuze intra-epitheliale laesies ontstaan in het eileiderepitheel uitsluitend in het fimboriale gebied; het is onbekend waarom de vorming van laesies beperkt is tot dit gebied waar normaal gesproken het overheersende celtype wordt geciliteerd, niet secretoir2,7,8. De regionaliteit in termen van normale fysiologische functie, evenals verhoogde interesse in de eileideroorsprong van eierstokkanker9,10,11,12,13, onderstreept het belang van afzonderlijke evaluatie van de eileidersegmenten.
De hier beschreven methode beschrijft de verzameling van afzonderlijke eileidersegmenten voor daaropvolgende downstream-analyses van segmentspecifieke genexpressie en functie van gedissocieerde cellen. Traditioneel worden veel weefsels verwerkt voor hele RNA-extractie volgens de fenol: chloroform-methode of een volledige extractiemethode op de kolom; we vonden echter dat de RNA-kwaliteit behouden bleef terwijl er voldoende opbrengst werd geproduceerd met de beschreven combinatiemethode. Met behulp van deze methode kunnen zeer kleine functionele segmenten van de eileider worden verwerkt voor stroomafwaartse analyses in plaats van de eileider als geheel te onderzoeken, wat resultaten kan maskeren die representatief zijn voor de verschillende segmenten14.
Gedissocieerde muriene eileidercellen zijn zelden onderzocht door flowcytometrie, hoogstwaarschijnlijk vanwege de beperkende celopbrengst van dit weefsel. Een benadering om dit probleem te overwinnen was om cellen te dissociëren, ze in cultuur te laten groeien en vervolgens re-differentiatie in vitro te stimuleren om geschikte celnummers te verkrijgen voor downstream celanalyse15,16,17,18. Een beperking van deze benadering is de tijd ex vivo en veranderde micro-omgeving in cultuur, die beide waarschijnlijk de genexpressie veranderen. Er is ook een aanname dat morfologische redifferentiatie dezelfde transcriptionele en proteomische signatuur heeft als bij het intacte dier. De huidige dissociatiemethode is ontworpen om het hoogste aantal epitheelcellen in een heterogene eileidercelpopulatie te bereiken met behoud van eencellige differentiatie. Verder beperkt de meestal niet-enzymatische benadering waarschijnlijk het verlies van celoppervlakeiwitten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Muismodelsystemen zijn ongeëvenaard voor de analyse van ziekteprocessen vanwege hun genetische manipuleerbaarheid en de lage kosten van experimentele behandelingen. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte zijn sommige structuren, zoals de eileider met een diameter van 200-400 μm, echter relatief moeilijk te bestuderen gebleken, behalve door immunohistochemie. Onlangs hebben immunohistochemische studies complexere verschillen in eileidersegmenten blootgelegd dan eerder werd erkend; de eileider is dus verdeeld in vier functionele segmenten met verschillende verhoudingen van zeven verschillende epitheelceltypen. De verschillende embryologische oorsprong en verhoudingen van de epitheelceltypen maken de vier functionele regio's waarschijnlijk differentieel vatbaar voor ziekten. Voorloperlaesies van sereuze intra-epitheliale carcinomen ontstaan bijvoorbeeld uit het infundibulum in muismodellen en uit het overeenkomstige fimboriale gebied in de menselijke eileider. Het hier beschreven protocol beschrijft een methode voor microdissectie om de eileider zodanig te verdelen dat er voldoende hoeveelheid en zuiverheid van RNA ontstaat die nodig is voor downstream-analyse, zoals reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) en RNA sequencing (RNAseq). Ook wordt een meestal niet-enzymatische weefseldissociatiemethode beschreven die geschikt is voor flowcytometrie of eencellige RNAseq-analyse van volledig gedifferentieerde eileidercellen. De beschreven methoden zullen verder onderzoek met behulp van de muizenne eileider op het gebied van voortplanting, vruchtbaarheid, kanker en immunologie vergemakkelijken.

Het beschreven dissociatieprotocol levert 100.000-120.000 cellen per muis op met pooling van beide eileiders. De methode is zacht genoeg om multi-ciliated celgrenzen intact te laten, waardoor een onderscheid mogelijk is tussen multi-ciliated cellen en secretoire cellen, en wordt gecontroleerd of de verteringsmethode zacht genoeg is om de-differentiatie te voorkomen. Representatieve immunofluorescentiebeelden in figuur 5 tonen kleincellige klonten na stap 4.2.1, gedurende 3 minuten gefixeerd ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Een methode voor microdissectie van de eileider van de muis die het mogelijk maakt om de afzonderlijke segmenten te verzamelen met behoud van RNA-integriteit wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een niet-enzymatische ovductale celdissociatieprocedure beschreven. De methoden zijn geschikt voor latere gen- en eiwitanalyse van de functioneel verschillende eileidersegmenten en gedissocieerde eileidercellen.

Microdissectie en dissociatie van de murine-eileider: individuele segmentidentificatie en eencellige isolatie

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Verschillende eileidersegmenten hebben verschillende fysiologische functies en zijn differentieel gevoelig voor pathologische veranderingen. Identificatie van de verschillende segmenten in een zeer kleine eileider bij muizen is een uitdaging, net als de productie van een goede opbrengst van goed gedifferentieerde cellen door weefseldissociatie. In deze video zullen we laten zien hoe we de eileider van de muis kunnen ontkoppelen, de verschillende segmenten kunnen herkennen zodat ze individueel kunnen worden geanalyseerd en ten slotte hoe een relatief hoge opbrengst van gedifferentieerde gedissocieerde cellen kan worden geproduceerd.Een beter begrip van de omgeving die specifiek is voor het ampulla kan de in-vitrofertilisatietechnieken verbeteren. Door het infundibulum te contrasteren met andere segmenten, kunnen we ook de neiging van het infundibulum voor kwaadaardige transformatie beter begrijpen. De eencellige dissociatieprocedure bevrijdt stromale, evenals epitheelcellen uit de eileider.Onze methode biedt ook mogelijkheden om immuun-, gladde spier- en epitheelcelbijdragen aan de fysiologie en pathologie van de eileider afzonderlijk te analyseren. Werken onder een dissectiemicroscoop kan in het begin moeilijk zijn. Ik zou adviseren om te oefenen met een grotere buis zoals de baarmoeder om ervoor te zorgen dat je gereedschap geschikt is voor de eileider microdissectie.Begin met het aanbrengen van een stuk tandwas op een petrischaaltje met lijm en laat het drogen. Ontsmet vervolgens het gerecht met 70% ethanol. Het oppervlak is nu klaar voor dissectie.Immobiliseer de petrischaal met de tandwas op het koude platform onder een dissectiemicroscoop wanneer deze klaar is voor dissectie. Desinfecteer het ventrale oppervlak van het dier met 70% ethanol. Open vervolgens de buik- en bekkenholte met een steriele dissectieschaar.Verplaats het maagdarmkanaal naar één kant om de dorsale bihornale baarmoeder te lokaliseren. Volg elke baarmoederhoorn rostrally om elke eileider en eierstok te lokaliseren die zijn gehuld in het baarmoedervetkussen net onder de nier. Verwijder vervolgens beide laterale eileiders met de eierstokken en een deel van de distale baarmoederhoorn die nog steeds met een dissectieschaar is bevestigd.Snijd elke laterale baarmoederhoorn af met ongeveer één tot twee centimeter van de hoorn nog bevestigd aan de opgerolde eileider en eierstok. Dompel het weefsel onmiddellijk onder in twee milliliter koud dissectiemedium en bevestig het baarmoederweefsel vervolgens op de tandwas met een steriele naald van 25 gauge om weefsel vast te zetten voor dissectie. Reinig en ontleed het ovariële vetkussen en bindweefsel om de eileider duidelijk te visualiseren.Gebruik een spuit van één milliliter om één tot twee druppels steriele 1% toluïstische blauwe kleurstofoplossing af te geven en incubeer gedurende 30 seconden tot één minuut. Spoel af met koude DPBS en verwijder vervolgens alle vloeistof. Trek de eierstok lichtjes uit de opgerolde eileider.Snijd bij het bursale membraan in het brede ligament om de eierstok van de eileider te verwijderen zonder het tubale weefsel in gevaar te brengen. Lokaliseer het distale fimboriale uiteinde van de eileider die lateraal naar de baarmoederbuisverbinding wordt gevonden. Trek voorzichtig aan de buis en knip de mesosalpinx weg met een springvorm microschaar om de eileider los te maken.Snijd de buis om het infundibulaire gebied te produceren. Snijd vervolgens het ampullaire gebied door tussen bocht twee en drie te snijden. Snijd ten slotte het resterende deel naar de baarmoederbuisverbinding die het istmische gebied is.Vries onmiddellijk de ontlede weefselsegmenten in vloeibare stikstof en voeg vervolgens 200 microliter koud RNA-extractiereagens en een-op-een homogenisatieparelmengsel toe aan het weefsel voor RNA-isolatie. Vanaf het fimboriale gebied snijdt u de buis in de lengterichting door met een springvormschaar en gebruikt u een tang als hefboom om het luminale epitheel bloot te leggen. Hak de opengespleet delen en de resterende eileider in segmenten van ongeveer één tot twee millimeter.Voeg vervolgens vijf milliliter warme niet-enzymatische dissociatiebuffer toe aan het weefsel en incubeer bij 37 graden Celsius. Fluorescerende en fasecontrastbeelden van een celcluster die positief zijn voor occludin, kernen en geacetyleerde tubuline worden hier getoond. Rood duidt op occludin, blauw op kernen en groen op geacetyleerde tubuline.De ciliated apicale grens blijft intact gedurende het hele protocol en is bestand tegen verdere vertering naar afzonderlijke cellen. In deze representatieve afbeeldingen worden samengevoegde, rode, blauwe, fasecontrast en groene kanalen weergegeven. Na een korte pronase incubatie zijn de meeste cellen enkelvoudig.Propidiumjodidekleuring vertoont ongeveer 93% levensvatbaarheid in Brightfield, rood kanaal PI positief en merge. Inzet bij samenvoeging toont een intacte ciliated rand op een enkele gedissocieerde cel. Dergelijke cellen hebben actief kloppende trilharen.Heel RNA werd beoordeeld op opbrengst en kwaliteit door microvolumespectrofotometer en bioanalysator. De resultaten tonen aan dat deze methode 800 tot 1.200 nanogram RNA per segment oplevert, behalve voor infundibulaire monsters waarbij pooling van twee dieren nodig kan zijn voor een passende opbrengst voor downstream-assays. De gepresenteerde resultaten voor infundibulum zijn samengevoegd van twee dieren, in totaal vier infundibulaire regio's.Dit protocol bereikt met succes zuiver RNA geanalyseerd met een microvolumespectrofotometer en een bioanalysator. Monsters hebben een absorptieverhouding van 260 bij 280 nanometer tussen 1,8 en 2, typisch voor zuivere RNA-nucleotidesoorten. Bioanalyse van de monsters vertoonde een hoge RNA-integriteit met een beoordeeld RNA-integriteitsgetal boven zeven, geschikt voor downstream-expressie en sequencinganalyse.Vergeet niet om één tot twee centimeter van de baarmoederhoorn vast te houden om het tubale systeem op het dissectieplatform te bevestigen. Bovendien helpt het gebruik van de toluidineblauwe kleurstof bij het snel losmaken van de eileider. Hoe sneller het loskoppelen, hoe beter het behoud en de minste hoeveelheid RNA-afbraak.Deze methode is voldoende om RNA van geschikte kwaliteit te verkrijgen voor RNA-sequencing, waardoor individuele segmentsequencing mogelijk is. De celdissociatie is geschikt voor eencellige sequencing of flowcytometrie die een nauwkeuriger segment- en celanalyse mogelijk maakt. De methode zal helpen het veld verder te brengen dan de analyse van de hele buis die verschillen op segment- of enkele celniveau maskeert.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Celdissociatie van het tongepitheel en mesenchym/bindweefsel van embryonale dag 12,5 en 8 weken oude muizen

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...