Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס פריצת דרך של משרד ההגנה ל- AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR נתמכה חלקית על ידי מלגות פנימיות: מלגת קדם-דוקטורט לסרטן Pease והמלגה לקדם-דוקטורט של מרי גאלווין נטל במדעים ביו-רפואיים ואוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד, פרסים פנימיים: מענק מחקר עבודת הדוקטורט של ועדת האחווה של מועצת הבוגרים ופרס תוכנית שנת הדוקטורט של חטיבת הבוגרים. המחברים מודים לג'יליאן מ. רייט ואליסה מ. קומארי על הסיוע בפתרון בעיות מוקדם של שיטה זו.

כל הטיפול בבעלי חיים והנהלים אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים ריברסייד והיו בהתאם להנחיות האגודה האמריקאית לטיפול בבעלי חיים במעבדה, מחלקת החקלאות של ארצות הברית ומכוני הבריאות הלאומיים. השיטה המתוארת השתמשה C57BL / 6 מבוגר, עכברים נקבות. כל בעלי הח?...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

שלושת המקטעים של האובידוקט הם היסטולוגיים, מורפולוגיים ונבדלים מבחינה תפקודית, 1,2,3. האפיתל משתנה מאוד מקצה אחד של oviduct למשנהו. תאים מסוכסכים שולטים בקצה הפימברי/לא-מימון, בעוד שתאי הפרשה שולטים באזור האיסתמי1. בעוד שיפוע כולל ...

oviduct murine דומה בתפקוד ומורפולוגיה לחצוצרה האנושית1. שניהם מורכבים מאפיתל פסאודו-אסטרטגי, המורכב משני תאים מקומיים אפיתל המתוארים היסטורית: תאים מחוספסים ותאי הפרשה 1,2. לאובידוקט שלושה קטעים מוכרים קלאסית: האינפונדיבולום, האמפולה והאיסתמוס. במחקר שנערך לאחרונה, Harwalkar ואח '. 3 חקר מורפולוגיה oviduct וביטוי גנים המוביל להרחבת הסיווג של תאי אפיתל תושב לשבע אוכלוסיות נפרדות. בנוסף, הם הקימו את צומת אמפולרי-איסתמוס כמקטע נפרד של oviduct3. השיטה המתוארת בזאת, המתמקדת אינפונדבולום, אמפולה, ו isthmus, יכול בקלות להיות מורחב לכלול את הצומת אמפולרי-איסתמי, כמו גם 2,3. האזור הבלתי מוחרי מכיל את האוסטיום, או הפתיחה של oviduct, וכולל את האזור fimbrial, כמו גם את הגבעול הפרוקסימלי. נע לכיוון הרחם, הבא הוא אמפולה, ולאחר מכן isthmus. תאים מסוכסכים בולטים ביותר בקצה הדיסטלי של האזור, קרובים לשחלה, או אינפונבולום, בעוד שתאי הפרשה בולטים ביותר בקצה הפרוקסימלי או בקטע איסתמוס1. שלא כמו החצוצרה האנושית, oviduct murine הוא מבנה מפותל נתמך על ידי mesosalpinx, הרחבה של הרצועה הרחבה צפק 1,4. בנוסף, oviduct העכבר עטוף בשק בורסל שמגדיל את הסבירות להעברת ביציות לתוך oviduct4. האמפולה מזוהה כמיקום ההפריה, שממנו עוברים מתפתחים עוברים לאיתמוס לפני הכניסה לרחם 5. מקטעי חצובות הם בקוטר 200-400 מיקרומטר ואזורי האמפולר והאיסתמוס הארוכים יותר הם כ 0.5-1.0 ס"מ אורך4. האובידוקט נחלש במהלך המחזור האסטרוס והאמפולה והאינדיבולום נפוחים יותר מהאיתמוס1.
התפשטות יתר של תאים, במיוחד תאים הפרשה, מאפיינים נגעים קודמים לגידולים סרוסיים שנמצאו בחלל האגן6. נגעים תוך-אפיתל-אפיתליים מבשרים אלה מתעוררים באפיתל האובידוקט אך ורק באזור הפימברי; לא ידוע מדוע היווצרות נגע מוגבלת לאזור זה שבו בדרך כלל סוג התא השולט הוא ciliated, לא הפרשה2,7,8. האזוריות במונחים של תפקוד פיזיולוגי נורמלי, כמו גם עניין מוגבר במקור oviductal של סרטן השחלות9,10,10,11,12,13, מדגיש את החשיבות של הערכה נפרדת של קטעי oviduct.
השיטה המתוארת כאן מפרטת את האוסף של מקטעי oviductal נפרדים לניתוחים במורד הזרם הבאים של ביטוי גנים ספציפיים למגזר ותפקוד של תאים מנותקים. באופן מסורתי, רקמות רבות מעובדות עבור מיצוי RNA שלם בעקבות הפנול: שיטת כלורופורם או שיטת מיצוי מלאה בעמודה; עם זאת, מצאנו כי איכות RNA נשמר תוך הפקת תשואה מספקת עם שיטת השילוב המתוארת. באמצעות שיטה זו, קטעים פונקציונליים קטנים מאוד של oviduct ניתן לעבד עבור ניתוחים במורד הזרם במקום לחקור את oviduct בכללותו, אשר יכול להסוות תוצאות נציג של המקטעים השונים14.
תאי אובידוקטלי מורין מנותקים נחקרו לעתים רחוקות על ידי ציטומטריית זרימה, ככל הנראה בשל תפוקת התא המגבילה מרקמה זו. גישה אחת כדי להתגבר על בעיה זו הייתה לנתק תאים, לגדל אותם בתרבית, ולאחר מכן לעורר בידול מחדש במבחנה כדי להשיג מספרי תאים מתאימים לניתוח תאים במורד הזרם15,16,17,18. מגבלה לגישה זו היא הזמן ex vivo ושינוי microenvironment בתרבות, שניהם עשויים לשנות ביטוי גנים. יש גם הנחה כי בידול מחדש מורפולוגי יש את אותה חתימה תמלולית פרוטאומית כפי שהיה נוכח בחיה שלמה. שיטת הניתוק הנוכחית תוכננה להשיג את המספר הגבוה ביותר של תאי אפיתל באוכלוסיית תאים אובידוקטליים הטרוגניים תוך שמירה על בידול תאים בודדים. יתר על כן, הגישה הלא אנזימטית בעיקר מגבילה ככל הנראה את אובדן חלבוני פני התא.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

מערכות מודל עכבר הם ללא תחרות לניתוח של תהליכי מחלה בגלל manipulability הגנטית שלהם ואת העלות הנמוכה של טיפולים ניסיוניים. עם זאת, בגלל גודל הגוף הקטן שלהם, כמה מבנים, כגון oviduct עם קוטר של 200-400 מיקרומטר, הוכיחו להיות קשה יחסית ללמוד אלא על ידי immunohistochemistry. לאחרונה, מחקרים אימונוהיסטוכימיים חשפו הבדלים מורכבים יותר במגזרי oviduct מאשר היו מוכרים בעבר; לפיכך, האובידוקט מחולק לארבעה מקטעים פונקציונליים עם יחסים שונים של שבעה סוגי תאי אפיתל נפרדים. המקורות והיחסים העובריים השונים של סוגי תאי האפיתל עשויים להפוך את ארבעת האזורים התפקודיים לרגישים באופן דיפרנציאלי למחלות. לדוגמה, נגעים מבשרים לקרצינומות תוך-אפיתליות serous נובעים מהאינפובולום במודלים של עכברים ומהאיזור הפימברי המתאים בחצוצרה האנושית. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט שיטה עבור microdissection כדי לחלק את oviduct באופן כזה להניב כמות מספקת וטוהר של RNA הדרוש לניתוח במורד הזרם כגון תמלול הפוך-כמותי PCR (RT-qPCR) ורצף RNA (RNAseq). כמו כן מתוארת היא שיטת פירוק רקמות לא אנזימטית בעיקר המתאימה לציטומטריית זרימה או ניתוח RNAseq תא יחיד של תאים oviductal מובחנים לחלוטין. השיטות המתוארות יאפשרו מחקר נוסף תוך שימוש באובידוקט מורין בתחום הרבייה, הפוריות, הסרטן והאימונולוגיה.

פרוטוקול הניתוק המתואר מניב 100,000-120,000 תאים לעכבר עם איגום של שני oviducts. השיטה עדינה מספיק כדי להשאיר את גבולות התאים הרב-תכליתיים ללא פגע, ומאפשרת הבחנה בין תאים מרובי סיבים לתאי הפרשה, ומוודאת ששיטת העיכול עדינה מספיק כדי למנוע דה-הבחנה. תמונות אימונופלואורסצנטיות מייצגות באיור...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

מוצגת שיטה למיקרודיסקציה של oviduct העכבר המאפשרת איסוף של מקטעים בודדים תוך שמירה על שלמות RNA. בנוסף, הליך פירוק תאים oviductal לא אנזימטי מתואר. השיטות מתאימות לניתוח גנים וחלבון לאחר מכן של מקטעי oviductal שונים מבחינה תפקודית ותאי oviductal מנותקים.

ניתוח מיקרו-דיסקט וניתוק של אובידוקט מורין: זיהוי מקטע בודד ובידוד תא בודד

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

מקטעי oviduct שונים יש פונקציות פיזיולוגיות ברורות והם רגישים באופן דיפרנציאלי לשינוי פתולוגי. זיהוי של המקטעים השונים בעכבר קטן מאוד oviduct הוא מאתגר, כמו גם הייצור של תשואה טובה של תאים מובחנים היטב על ידי ניתוק רקמות. בסרטון זה, נדגים כיצד לשחרר את oviduct העכבר, לזהות את המקטעים השונים, כך שהם יכולים להיות מנותחים בנפרד, ולבסוף, כיצד לייצר תשואה גבוהה יחסית של תאים מנותקים מובחנים.הבנה טובה יותר של הסביבה הספציפית לאמפולה עשויה לשפר את טכניקות ההפריה חוץ גופית. כמו כן, על ידי ניגוד התבערה עם קטעים אחרים, אנו עשויים להבין טוב יותר את הנטייה של infundibulum לשינוי ממאיר. הליך פירוק התא הבודד משחרר סטרומלי, כמו גם תאי אפיתל מן oviduct.השיטה שלנו מספקת גם הזדמנויות לנתח בנפרד את תרומות מערכת החיסון, השריר החלקה ותאי האפיתל לפיזיולוגיה ולפתולוגיה של האובידוקט. עבודה תחת מיקרוסקופ ניתוח יכולה להיות קשה בהתחלה. הייתי ממליץ להתאמן עם צינור גדול יותר כגון הרחם כדי להבטיח כי הכלים שלך מתאימים עבור microdissection oviduct.התחל על ידי הדבקת חתיכת שעווה דנטלית לצלחת פטרי עם דבק ולתת לו להתייבש. ואז לחטא את המנה עם 70% אתנול. פני השטח מוכנים כעת לחיתוך.לשתק את צלחת פטרי המכילה את שעוות השיניים על הפלטפורמה הקרה תחת מיקרוסקופ ניתוח כאשר מוכן לחיתוך. לחטא את פני השטח הגחוניים של החיה עם 70% אתנול. ואז לפתוח את חלל הבטן והאגן עם מספריים ניתוח סטריליים.העבר את מערכת העיכול לצד אחד כדי לאתר את הרחם הדו-קרן הגבי. בצע כל קרן הרחם rostrally כדי לאתר כל oviduct ושחלה כי הם עטופים כרית השומן ברחם ממש מתחת לכליה. לאחר מכן לחתוך הן oviducts לרוחב עם השחלות וחלק של קרן הרחם דיסטלי עדיין מחובר באמצעות מספריים ביתור.חותכים כל קרן רחם לרוחב עם כ 1 עד 2 ס"מ של הקרן עדיין מחובר oviduct מפותל השחלה. להטביע את הרקמה מיד בשני מיליליטרים של מדיום ביתור קר, ולאחר מכן להצמיד את רקמת הרחם שעווה שיניים עם מחט 25 מד סטרילי כדי לאבטח את הרקמה לנתיחה. לנקות ולנתח את כרית השומן השחלות ורקמת החיבור כדי לדמיין את oviduct בבירור.השתמש מזרק מיליליטר אחד כדי לחלק 1 עד 2 טיפות של סטרילי 1% טולואידין פתרון צבע כחול ודגור במשך 30 שניות עד דקה אחת. יש לשטוף עם DPBS קר ולאחר מכן להסיר את כל הנוזלים. משוך קלות את השחלה מן oviduct מפותל.חותכים את קרום הבורסל ברצועה הרחבה כדי להסיר את השחלה מן oviduct מבלי להתפשר על רקמת החצוצרות. אתר את הקצה הפימברי הדיסטלי של האובידוקט שנמצא לרוחב לצומת חצוצרות הרחם. משכו בעדינות את הצינור וחתכו את המזוסלפינקס עם מיקרו-מספריים קפיציים כדי לשחרר את האובידוקט.חותכים את הצינור כדי לייצר את האזור הפנימי. לאחר מכן לחתוך את אזור האמפולר על ידי חיתוך בין הסיבובים 2 ו -3. לבסוף, לחתוך את החלק הנותר לצומת חצוצרות הרחם שהוא האזור האיסתמי.מיד להקפיא את מקטעי הרקמה המנותחים בחנקן נוזלי ולאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטרים של ריאגנט מיצוי RNA קר תערובת חרוזי הומוגניזציה אחד על אחד לרקמה לבידוד RNA. החל באזור הפימבריאלי, לחתוך את הצינור אורך עם מספריים springform ולהשתמש מלקחיים כמנוף לחשוף את האפיתל הזוהר. טחון את החלקים הפתוחים החתוכים ואת oviduct הנותרים לתוך קטעים כ 1 עד 2 מילימטר.לאחר מכן מוסיפים חמישה מיליליטר של חוצץ דיסוציאציה לא אנזימטית חם לרקמה ודגורים ב 37 מעלות צלזיוס. תמונות פלואורסצנטיות וניגודיות פאזה של צביר תאים חיוביים עבור אוקולדין, גרעינים, טובולין אצטילציה מוצגים כאן. אדום מציין occludin, כחול מציין גרעינים, וירוק מציין טובולין אצטילציה.הגבול האפילי הסגור נשאר שלם לאורך הפרוטוקול ועומד בפני עיכול נוסף לתאים בודדים. בתמונות מייצגות אלה מוצגים ערוצים ממוזגים, אדומים, כחולים, ניגודיות פאזה וירוקים. לאחר דגירה קצרה של פרונאז, רוב התאים הם בודדים.כתמי יודיד פרופידיום מראה כ 93% הכדאיות בברייטפילד, PI ערוץ אדום חיובי, ומיזוג. Inset בעת המיזוג מציג גבול שלם שלם בתא מנותק יחיד. תאים כאלה מכים באופן פעיל cilia.RNA שלם הוערך לתפוקה ואיכות על ידי ספקטרופוטומטר microvolume וביואנלייזר. התוצאות מראות כי שיטה זו מניבה 800 עד 1, 200 ננוגרם RNA לכל קטע למעט דגימות לא ממונפות שבהן איגום משני בעלי חיים עשוי להיות נחוץ לתשואה מתאימה לבדיקות במורד הזרם. התוצאות המוצגות עבור אינפונדיבולום משולבות משני בעלי חיים, בסך הכל ארבעה אזורים לא ממונפים.פרוטוקול זה משיג בהצלחה RNA טהור מנותח עם ספקטרופוטומטר מיקרו-וולום וביואנלייזר. לדגימות יש יחס ספיגה של 260 על 280 ננומטר בין 1.8 ל -2, אופייני למינים נוקלאוטידים RNA טהורים. ניתוח ביולוגי של הדגימות הראה שלמות RNA גבוהה עם מספר שלמות RNA מוערך מעל שבע, מתאים לביטוי במורד הזרם וניתוח רצף.זכור לשמור על סנטימטר אחד עד שני סנטימטרים של קרן הרחם כדי להצמיד את מערכת החצוצרות לפלטפורמת החיתוך. בנוסף, השימוש בצבע הכחול טולואידין מסייע בהתנתקות מהירה של oviduct. ככל שההתפרקות מהירה יותר, כך השימור טוב יותר והכמות הקטנה ביותר של השפלת RNA.שיטה זו מספיקה כדי לקבל RNA באיכות מתאימה עבור ריצוף RNA המאפשר ריצוף מקטע בודד. ניתוק התא מתאים לרצף תא בודד או לציטומטריית זרימה המאפשרת ניתוח מקטע ותא מדויק יותר. השיטה תסייע להזיז את השדה מעבר לניתוח שפופרת שלם שמסווה הבדלים ברמת המקטע או התא הבודד.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

ניתוק תאים מאפיתל הלשון ומיסנצ'ימה/רקמת החיבור של עכברים בני 12.5 ו-8 שבועות

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

בידוד מהיר של תאים בודדים מעכבר ושיניים אנושיות

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

בידוד תאי אנדותל רשתית מורין לריצוף הדור הבא

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...