Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
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Questo lavoro è stato supportato in parte da un DoD Breakthrough Award ad AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR è stato parzialmente supportato da borse di studio intramurali: la Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship e la Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences e University of California, Riverside, premi intramurali: il Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant e il Graduate Division Dissertation Year Program Award. Gli autori ringraziano Gillian M. Wright e Alyssa M. Kumari per l'assistenza nella risoluzione precoce di questo metodo.

Tutte le procedure e la manipolazione degli animali sono state approvate dall'Università della California, dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Riverside ed erano conformi alle linee guida dell'American Association for Laboratory Animal Care, del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti e del National Institutes of Health. Il metodo descritto ha utilizzato C57BL/6 topi adulti, femmine. Tutti gli animali sono stati sottoposti a eutanasia per decapitazione prima della raccolta dei tessuti...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. 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(45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

I tre segmenti dell'ovidotto sono istologicamente, morfologicamente e funzionalmente distinti1,2,3. L'epitelio varia notevolmente da un'estremità all'altra dell'ovidotto. Le cellule ciliate dominano all'estremità fibriale/infundibolare, mentre le cellule secretorie dominano nella regione istmica1. Mentre questo gradiente complessivo è stato riconosciuto per qualche tempo, lavori recenti hanno scoperto ...

L'ovidotto murino è simile per funzione e morfologia alla tuba di Falloppio umana1. Entrambi sono costituiti da un epitelio ciliato pseudostratificato, costituito da due cellule residenti epiteliali storicamente descritte: cellule ciliate e cellule secretorie1,2. L'ovidotto ha tre segmenti classicamente riconosciuti: l'infundibulum, l'ampolla e l'istmo. In un recente studio, Harwalkar et al. 3 hanno studiato la morfologia dell'ovidotto e l'espressione genica che ha portato all'espansione della categorizzazione delle cellule epiteliali residenti a sette popolazioni distinte. Inoltre, hanno stabilito la giunzione ampollare-istmo come un segmento distinto dell'ovidotto3. Il metodo qui descritto, che si concentra sull'infundibulum, l'ampolla e l'istmo, potrebbe essere facilmente esteso per includere anche la giunzione ampollare-istmmica2,3. La regione infundibolare contiene l'ostio, o apertura dell'ovidotto, e comprende la regione fimbriale e il gambo prossimale. Spostandosi verso l'utero, il prossimo è l'ampolla, e poi l'istmo. Le cellule ciliate sono più prominenti nell'estremità distale della regione, prossimali all'ovaio o all'infundibulum, mentre le cellule secretorie sono più prominenti nell'estremità prossimale o nel segmento dell'istmo1. A differenza della tuba di Falloppio umana, l'ovidotto murino è una struttura a spirale sostenuta dal mesosalpinx, un'estensione del legamento largo peritoneo1,4. Inoltre, l'ovidotto di topo è racchiuso in un sacco bursale che aumenta la probabilità di trasferimento di ovociti nell'ovidotto4. L'ampolla è identificata come il luogo della fecondazione, da cui gli embrioni in via di sviluppo passano nell'istmo prima di entrare nell'utero5. I segmenti tubarici hanno un diametro di 200-400 μm e le regioni ampollari e istmo più lunghe sono lunghe circa 0,5-1,0 cm4. L'ovidotto si distende durante il ciclo estrale e l'ampolla e l'infundibulum sono più distensibili dell'istmo1.
L'eccessiva proliferazione delle cellule, in particolare le cellule secretorie, caratterizza le lesioni precursori dei tumori sierosi presenti nella cavità pelvica6. Queste lesioni intraepiteliali sierose precursori insorgono nell'epitelio dell'ovidotto esclusivamente nella regione fimbriale; non è noto il motivo per cui la formazione di lesioni è limitata a questa regione dove normalmente il tipo cellulare predominante è ciliato, non secretorio2,7,8. La regionalità in termini di normale funzione fisiologica, nonché l'accresciuto interesse per l'origine oviduttale del carcinoma ovarico9,10,11,12,13, sottolinea l'importanza di una valutazione separata dei segmenti dell'ovidotto.
Il metodo qui descritto descrive in dettaglio la raccolta di segmenti oviduttali separati per le successive analisi a valle dell'espressione genica specifica del segmento e della funzione delle cellule dissociate. Tradizionalmente, molti tessuti vengono elaborati per l'estrazione dell'RNA intero seguendo il metodo del cloroformio fenolo: o un metodo di estrazione completo su colonna; tuttavia, abbiamo scoperto che la qualità dell'RNA è stata mantenuta producendo una resa sufficiente con il metodo di combinazione descritto. Utilizzando questo metodo, segmenti funzionali molto piccoli dell'ovidotto possono essere elaborati per analisi a valle piuttosto che indagare l'ovidotto nel suo complesso, il che può mascherare risultati rappresentativi dei diversi segmenti14.
Le cellule oviduttali murine dissociate sono state raramente studiate mediante citometria a flusso, molto probabilmente a causa della resa cellulare limitante di questo tessuto. Un approccio per superare questo problema è stato quello di dissociare le cellule, farle crescere in coltura e quindi stimolare la ri-differenziazione in vitro per ottenere numeri di cellule appropriati per l'analisi cellulare a valle15,16,17,18. Una limitazione a questo approccio è il tempo ex vivo e il microambiente alterato in coltura, entrambi i quali probabilmente cambiano l'espressione genica. C'è anche l'ipotesi che il ridis differenziato morfologico abbia la stessa firma trascrizionale e proteomica presente nell'animale intatto. L'attuale metodo di dissociazione è stato progettato per ottenere il maggior numero di cellule epiteliali in una popolazione eterogenea di cellule oviduttali, mantenendo la differenziazione a singola cellula. Inoltre, l'approccio per lo più non enzimatico probabilmente limita la perdita di proteine di superficie cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

I sistemi di modelli murini non hanno eguali per l'analisi dei processi patologici a causa della loro manipolabilità genetica e del basso costo dei trattamenti sperimentali. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni corporee, alcune strutture, come l'ovidotto con un diametro di 200-400 μm, si sono dimostrate relativamente difficili da studiare se non con l'immunoistochimica. Recentemente, studi immunoistochimici hanno scoperto differenze più complesse nei segmenti dell'ovidotto di quanto precedentemente riconosciuto; quindi, l'ovidotto è diviso in quattro segmenti funzionali con rapporti diversi di sette distinti tipi di cellule epiteliali. Le diverse origini embriologiche e i rapporti dei tipi di cellule epiteliali probabilmente rendono le quattro regioni funzionali differenzialmente suscettibili alle malattie. Ad esempio, le lesioni precursori dei carcinomi intraepiteliali sierosi derivano dall'infundibulum nei modelli murini e dalla corrispondente regione fimbriale nella tuba di Falloppio umana. Il protocollo qui descritto descrive un metodo per la microdissezione per suddividere l'ovidotto in modo tale da produrre una quantità e una purezza sufficienti di RNA necessarie per l'analisi a valle come la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) e il sequenziamento dell'RNA (RNAseq). Viene inoltre descritto un metodo di dissociazione tissutale per lo più non enzimatico appropriato per la citometria a flusso o l'analisi RNAseq a singola cellula di cellule oviduttali completamente differenziate. I metodi descritti faciliteranno ulteriori ricerche utilizzando l'ovidotto murino nel campo della riproduzione, della fertilità, del cancro e dell'immunologia.

Il protocollo di dissociazione descritto produce 100.000-120.000 cellule per topo con raggruppamento di entrambi gli ovidotti. Il metodo è abbastanza delicato da lasciare intatti i bordi delle cellule multi-ciliate, consentendo una distinzione tra cellule multi-ciliate e cellule secretorie e verificando che il metodo di digestione sia abbastanza delicato da prevenire la de-differenziazione. Le immagini rappresentative di immunofluorescenza nella Figura 5 mostrano grumi di piccole cellule do...

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Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Diversi segmenti dell'ovidotto hanno funzioni fisiologiche distinte e sono differenzialmente suscettibili al cambiamento patologico. L'identificazione dei diversi segmenti in un ovidotto di topo molto piccolo è impegnativa, così come la produzione di una buona resa di cellule ben differenziate mediante dissociazione tissutale. In questo video, dimostreremo come srotolare l'ovidotto del topo, riconoscere i diversi segmenti in modo che possano essere analizzati individualmente e, infine, come produrre una resa relativamente alta di cellule dissociate differenziate.Una migliore comprensione dell'ambiente specifico dell'ampolla può migliorare le tecniche di fecondazione in vitro. Inoltre, confrontando l'infundibulum con altri segmenti, possiamo comprendere meglio la propensione dell'infundibulum alla trasformazione maligna. La procedura di dissociazione a singola cellula libera le cellule stromali ed epiteliali dall'ovidotto.Il nostro metodo offre anche l'opportunità di analizzare separatamente i contributi immunitari, muscolari lisci ed epiteliali alla fisiologia e alla patologia dell'ovidotto. Lavorare al microscopio di dissezione può essere difficile all'inizio. Consiglierei di esercitarsi con un tubo più grande come l'utero per garantire che i tuoi strumenti siano adeguati per la microdissezione dell'ovidotto.Inizia apponendo un pezzo di cera dentale su una capsula di Petri con adesivo e lasciandolo asciugare. Quindi disinfettare il piatto con il 70% di etanolo. La superficie è ora pronta per la dissezione.Immobilizzare la capsula di Petri contenente la cera dentale sulla piattaforma fredda sotto un microscopio di dissezione quando è pronta per la dissezione. Disinfettare la superficie ventrale dell'animale con il 70% di etanolo. Quindi aprire la cavità addominale e pelvica con forbici di dissezione sterili.Spostare il tratto gastrointestinale su un lato per individuare l'utero bihornale dorsale. Seguire ogni corno uterino rostralmente per individuare ogni ovidotto e ovaio che sono avvolti nel cuscinetto di grasso uterino appena sotto il rene. Quindi asportare entrambi gli ovidotti laterali con le ovaie e una porzione del corno uterino distale ancora attaccato usando le forbici di dissezione.Tagliare ogni corno uterino laterale con circa uno o due centimetri del corno ancora attaccato all'ovidotto e all'ovaio arrotolati. Immergere immediatamente il tessuto in due millilitri di mezzo di dissezione a freddo, quindi apporre il tessuto uterino alla cera dentale con un ago sterile da 25 gauge per fissare il tessuto per la dissezione. Pulire e sezionare il cuscinetto di grasso ovarico e il tessuto connettivo per visualizzare chiaramente l'ovidotto.Utilizzare una siringa da un millilitro per erogare una o due gocce di soluzione sterile di colorante blu toluidina all'1% e incubare per 30 secondi a un minuto. Risciacquare con DPBS freddo e quindi rimuovere tutto il liquido. Tirare leggermente l'ovaio dall'ovidotto arrotolato.Tagliare la membrana borsale nel legamento largo per rimuovere l'ovaio dall'ovidotto senza compromettere il tessuto tubarico. Individuare l'estremità fimbriale distale dell'ovidotto che si trova lateralmente alla giunzione tubarica uterina. Tirare delicatamente il tubo e tagliare via il mesosalpinx con micro-forbici a molla per srotolare l'ovidotto.Tagliare il tubo per produrre la regione infundibolare. Quindi asportare la regione ampollare tagliando tra i giri due e tre. Infine, tagliare la porzione rimanente alla giunzione tubarica uterina che è la regione istmica.Congelare immediatamente i segmenti di tessuto sezionati in azoto liquido e quindi aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA freddo e miscela di perline di omogeneizzazione one-to-one al tessuto per l'isolamento dell'RNA. Partendo dalla regione fibriale, tagliare longitudinalmente il tubo con forbici a molla e utilizzare la pinza come leva per esporre l'epitelio luminale. Tritare le porzioni aperte a fessura e l'ovidotto rimanente in segmenti di circa uno o due millimetri.Quindi aggiungere cinque millilitri di tampone di dissociazione caldo non enzimatico al tessuto e incubare a 37 gradi Celsius. Qui vengono mostrate immagini fluorescenti e a contrasto di fase di un cluster cellulare positivo per occludina, nuclei e tubulina acetilata. Il rosso denota occludina, il blu denota nuclei e il verde denota tubulina acetilata.Il bordo apicale ciliato rimane intatto per tutto il protocollo e resiste a un'ulteriore digestione alle singole cellule. In queste immagini rappresentative vengono mostrati i canali uniti, rosso, blu, contrasto di fase e verde. Dopo una breve incubazione della pronasi, la maggior parte delle cellule sono singole.La colorazione dello ioduro di propidio mostra una vitalità di circa il 93% in Brightfield, pi positivo del canale rosso e fusione. L'inserto all'unione mostra un bordo ciliato intatto su una singola cella dissociata. Tali cellule hanno attivamente battendo le ciglia.L'RNA intero è stato valutato per la resa e la qualità mediante spettrofotometro a microvolume e bioanalizzatore. I risultati mostrano che questo metodo produce da 800 a 1.200 nanogrammi di RNA per segmento, ad eccezione dei campioni infundibolari in cui può essere necessario il pooling di due animali per una resa appropriata per i saggi a valle. I risultati presentati per l'infundibulum sono raggruppati da due animali, per un totale di quattro regioni infundibolari.Questo protocollo raggiunge con successo l'RNA puro analizzato con uno spettrofotometro a microvolume e un bioanalizzatore. I campioni hanno un rapporto di assorbimento di 260 per 280 nanometri tra 1,8 e 2, tipico delle specie di nucleotidi di RNA puro. La bioanalisi dei campioni ha mostrato un'elevata integrità dell'RNA con un numero di integrità dell'RNA valutato superiore a sette, appropriato per l'espressione a valle e l'analisi di sequenziamento.Ricorda di trattenere uno o due centimetri del corno uterino per fissare il sistema tubarico alla piattaforma di dissezione. Inoltre, l'uso del colorante blu toluidina aiuta nello srotolamento rapido dell'ovidotto. Più veloce è lo srotolamento, migliore è la conservazione e la minima quantità di degradazione dell'RNA.Questo metodo è sufficiente per ottenere RNA di qualità appropriata per il sequenziamento dell'RNA che consente il sequenziamento dei singoli segmenti. La dissociazione cellulare è appropriata per il sequenziamento a singola cellula o la citometria a flusso che consente un'analisi più precisa del segmento e della cellula. Il metodo aiuterà a spostare il campo oltre l'analisi dell'intero tubo che maschera le differenze a livello di segmento o singola cella.

Research

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Developmental Biology

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