Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
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この研究は、AMWへの国防総省ブレークスルー賞(BCRP W81XWH-14-1-0425)によって部分的に支援されました。KCRは、Pease Cancer Pre-Doctoral FellowshipとMary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical SciencesおよびUniversity of California, Riverside、intramural awards:Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant、Graduate Division Dissertation Year Program Awardによって部分的に支援されました。著者らは、この方法の早期トラブルシューティングにおける支援について、Gillian M. WrightとAlyssa M. Kumariに感謝する。

すべての動物の取り扱いと手順は、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、米国実験動物ケア協会、米国農務省、および国立衛生研究所のガイドラインに準拠していました。記載された方法は、C57BL/6成体、雌マウスを利用した。全ての動物を、組織採取前に断頭により安楽死させた。
注:青色染料を使用して卵管の効率的...

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	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

卵管の3つのセグメントは、組織学的、形態学的、および機能的に異なっている1,2,3。上皮は卵管の一方の端から他方の端まで大きく変化する。繊毛細胞はフィンブリア/眼底末端で優勢であり、分泌細胞は地峡領域で優勢です1。この全体的な勾配はしばらく前から認識されていましたが、最近の研究では?...

マウスの卵管は、機能と形態が人間の卵管と似ています1。どちらも擬似層状繊毛上皮からなり、歴史的に記述された2つの上皮常駐細胞、繊毛細胞と分泌細胞からなる1,2。卵管には、古典的に認識された3つのセグメント、すなわち眼底、アンプラ、地峡があります。最近の研究では、Harwalkarらが3は、卵管形態および遺伝子発現を調査し、常在上皮細胞の分類を7つの異なる集団に拡大させた。さらに、彼らは卵管の別個のセグメントとしてアンプラリー - 地峡接合部を確立した3。眼底内、アンプラ、および地峡に焦点を当てた本明細書に記載の方法は、アンプラ - 地峡接合部も含むように容易に拡張することができた2,3。眼底領域は、オスチウム、または卵管の開口部を含み、フィンブリア領域ならびに近位茎を含む。子宮に向かって移動すると、次はアンプラ、次に地峡です。繊毛化細胞は、卵巣または眼底の近位にある領域の遠位端で最も顕著であり、一方、分泌細胞は近位端または地峡セグメントで最も顕著である1。ヒトの卵管とは異なり、マウス卵管は、広い靭帯腹膜の延長であるメソサルピンクスによって支持されたコイル構造である1,4。さらに、マウス卵管は滑液包嚢に包まれており、卵母細胞が卵管に移入する可能性が高まります4。アンプラは受精の場所として同定され、発達中の胚は子宮に入る前に地峡に入る5。管状セグメントの直径は200〜400μmで、より長いアンプラリーおよび地峡領域の長さは約0.5〜1.0cmです4。卵管は発情周期の間に収縮し、アンプラと眼底は地峡よりも伸展性が高い1。
細胞、特に分泌細胞の過剰増殖は、骨盤腔内に見出される漿液性腫瘍の前駆病変を特徴付ける6。これらの前駆体漿液性上皮内病変は、卵管上皮においてのみ、フィンブリア領域においてのみ生じる。病変形成が、通常、優勢な細胞型が分泌型ではなく繊毛化されるこの領域に限定される理由は不明である2,7,8。正常な生理機能に関する地域性、ならびに卵巣癌の卵管起源に対する関心の高まり9,10,11,12,13は、卵管セグメントの別個の評価の重要性を強調する。
ここで説明する方法は、解離した細胞のセグメント特異的遺伝子発現および機能のその後の下流分析のための別個の卵管セグメントの収集を詳述する。伝統的に、多くの組織は、フェノールのいずれかに続いて全RNA抽出のために処理される:クロロホルム法またはオンカラム完全抽出法;しかし、RNAの品質は維持され、記載された併用法では十分な収率が得られていることを見出した。この方法を利用すると、卵管の非常に小さな機能セグメントを、卵管全体を調査するのではなく、下流分析のために処理することができ、異なるセグメントを表す結果をマスクすることができる14。
解離したマウス卵管細胞は、フローサイトメトリーによって調査されることはめったになく、おそらくこの組織からの細胞収量が限られているためである。この問題を克服するための1つのアプローチは、細胞を解離させ、培養中で増殖させ、次いでインビトロで再分化を刺激して、下流の細胞分析に適した細胞数を得ることであった15,16,17,18。このアプローチの限界は、培養中の時間エクスビボおよび変化した微小環境であり、どちらも遺伝子発現を変化させる可能性が高い。形態学的再分化は、無傷の動物に存在していたのと同じ転写的およびプロテオミクス的特徴を有するという仮定もある。現在の解離法は、単一細胞分化を維持しながら、異種卵管細胞集団において最多の上皮細胞数を達成するように設計した。さらに、ほとんどが非酵素的アプローチは、細胞表面タンパク質の損失を制限する可能性が高い。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

マウスモデルシステムは、その遺伝的操作性と実験的治療の低コストのために、疾患プロセスの分析には比類のないものです。しかし、その小さな体の大きさのために、直径200〜400μmの卵管のようないくつかの構造は、免疫組織化学によってを除いて研究することが比較的困難であることが証明されている。最近、免疫組織化学的研究は、以前に認識されていたよりも卵管セグメントのより複雑な違いを明らかにした。したがって、卵管は、7つの異なる上皮細胞型の異なる比率を有する4つの機能セグメントに分割される。上皮細胞型の異なる発生学的起源および比率は、4つの機能領域を疾患に対して差次的に感受性にする可能性が高い。例えば、漿液性上皮内癌の前駆体病変は、マウスモデルにおける眼底内およびヒト卵管内の対応するフィンブリア領域から生じる。ここで説明するプロトコルは、逆転写定量PCR(RT-qPCR)やRNAシーケンシング(RNAseq)などの下流分析に必要な十分な量と純度のRNAを得られるような方法で卵管を細分化するマイクロダイセクションの方法を詳述しています。また、完全に分化した卵管細胞のフローサイトメトリーまたは単一細胞RNAseq分析に適した、ほとんどが非酵素的な組織解離法も記載されている。記載された方法は、生殖、生殖能力、癌、および免疫学の分野におけるマウス卵管を利用するさらなる研究を容易にするであろう。

記載された解離プロトコールは、両方の卵管のプールを有するマウス当たり100,000〜120,000個の細胞を生じる。この方法は、多繊毛細胞の境界をそのまま残すのに十分なほど穏やかであり、多繊毛細胞と分泌細胞の区別を可能にし、消化法が脱分化を防ぐのに十分穏やかであることを確認する。図5の代表的な免疫蛍光画像は、ステップ4.2.1に続く小細胞凝集塊を、4%パラホ...

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Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。

マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

異なる卵管セグメントは、別個の生理学的機能を有し、病理学的変化に対して異なる感受性を有する。非常に小さなマウス卵管における異なるセグメントの同定は、組織解離による良好な収率の産生と同様に困難である。このビデオでは、マウスの卵管のコイルを解き、異なるセグメントを認識して個別に分析できるようにする方法、そして最後に、分化解離した細胞の比較的高い収率を生成する方法を示します。アンプラに特有の環境をよりよく理解することは、体外受精技術を改善するかもしれない。また、眼底を他のセグメントと対比させることで、眼底内科の悪性変換の傾向をよりよく理解できるかもしれない。単一細胞解離手順は、卵管から間質および上皮細胞を解放する。私たちの方法はまた、卵管の生理学および病理学に対する免疫、平滑筋、および上皮細胞の寄与を別々に分析する機会を提供する。解剖顕微鏡下での作業は、最初は難しい場合があります。私はあなたのツールが卵管微小解剖に適切であることを確認するために子宮のようなより大きなチューブで練習することをお勧めします。まず、歯用ワックスをペトリ皿に接着剤で貼り付け、乾かします。その後、70%エタノールで皿を消毒する。これで、表面は解剖の準備が整いました。解剖の準備ができたら、解剖顕微鏡下で冷たいプラットフォーム上に歯科用ワックスを含むペトリ皿を固定化する。動物の腹側表面を70%エタノールで消毒する。その後、腹腔と骨盤腔を滅菌解剖ハサミで開きます。胃腸管を片側に移動して、背側双角子宮を見つけます。腎臓のすぐ下の子宮脂肪パッドに包まれている各卵管と卵巣を見つけるために、各子宮角を吻側にたどります。次に、卵巣と遠位子宮角の一部がまだ取り付けられた側方卵管の両方を解剖ハサミを使用して切除します。各側方子宮角を、コイル状の卵管と卵巣にまだ取り付けられたままの角の約1〜2センチメートルで切断する。組織を直ちに2ミリリットルの冷間解剖培地に沈め、次いで滅菌された25ゲージ針で子宮組織を歯科用ワックスに貼り付け、解剖のために組織を固定する。卵巣脂肪パッドと結合組織をきれいにして解剖し、卵管をはっきりと視覚化します。1ミリリットルのシリンジを使用して、滅菌1%トルイジンブルー色素溶液を1〜2滴分注し、30秒〜1分間インキュベートする。冷たいDPBSですすぎ、すべての液体を取り除きます。コイル状の卵管から卵巣を軽く引き抜きます。広い靭帯の滑液包膜で切断し、卵管組織を損なうことなく卵巣を卵管から除去する。子宮管接合部の側方に見られる卵管の遠位フィンブリアル端を見つける。チューブを静かに引っ張り、スプリングフォームのマイクロハサミでメソサルピンクスを切り取り、卵管を巻き戻します。チューブを切断して眼底領域を作製する。次に、ターン2と3の間をカットしてアンプラリー領域を切除します。最後に、残りの部分を地峡領域である子宮管接合部に切断する。解剖した組織セグメントを液体窒素で直ちにスナップ凍結し、次いで200マイクロリットルの冷RNA抽出試薬および1対1のホモジナイズビーズミックスをRNA単離のために組織に加える。フィンブリアル領域から始めて、スプリングフォームハサミでチューブを縦方向にスリットし、鉗子をてこにして管腔上皮を露出させます。スリットの開いた部分と残りの卵管を約1〜2ミリメートルのセグメントに細かく刻む。次いで、5ミリリットルの温かい非酵素解離緩衝液を組織に加え、摂氏37度でインキュベートする。オクルージン、核、およびアセチル化チューブリンに対して陽性の細胞クラスターの蛍光および位相差画像をここに示す。赤はオクルジン、青は核、緑はアセチル化チューブリンを示します。繊毛様根尖境界は、プロトコル全体を通して無傷のままであり、単一細胞へのさらなる消化に耐える。これらの代表的な画像では、マージされた、赤、青、位相コントラスト、および緑のチャンネルが示されている。短いプロナーゼインキュベーションの後、細胞の大部分は単一である。ヨウ化プロピジウム染色は、明視野、赤色チャネルPI陽性、およびマージにおいて約93%の生存率を示す。マージ時の差し込み図は、単一の解離したセル上の無傷の繊毛境界を示す。そのような細胞は積極的に繊毛を叩いている。全RNAについて、マイクロボリューム分光光度計およびバイオアナライザーによって収率および品質について評価した。結果は、この方法が、下流アッセイのための適切な収量のために2匹の動物からのプーリングが必要な場合がある眼底サンプルを除いて、セグメント当たり800〜1,200ナノグラムのRNAを生じることを示している。infundibulumについて提示された結果は、2匹の動物からプールされ、合計4つの眼底領域である。このプロトコルは、マイクロボリューム分光光度計とバイオアナライザーで分析された純粋なRNAを首尾よく達成します。サンプルは、純粋なRNAヌクレオチド種の典型である1.8〜2の間の260×280ナノメートルの吸収比を有する。サンプルのバイオアナリシスは、7個を超える評価済みRNAインテグリティ数で高いRNAインテグリティを示し、下流の発現およびシーケンシング解析に適している。卵管系を解剖プラットフォームに貼り付けるために、子宮角の1〜2センチメートルを保持することを忘れないでください。さらに、トルイジンブルー染料の使用は、卵管の迅速な巻き戻しに役立ちます。アンコイリングが速いほど、保存性が向上し、RNA分解の量が最小限に抑えられます。この方法は、個々のセグメントシーケンシングを可能にするRNAシーケンシングに適切な品質のRNAを得るのに十分である。細胞解離は、単一細胞シーケンシングまたはフローサイトメトリーに適しており、より正確なセグメントおよび細胞分析を可能にします。この方法は、セグメントレベルまたは単一細胞レベルでの違いを隠すチューブ全体分析を超えてフィールドを移動するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

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Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

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Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

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12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

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Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

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Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)

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