Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av en DoD Breakthrough Award til AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR ble delvis støttet av intramurale stipender: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship og Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences and University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant og Graduate Division Dissertation Year Program Award. Forfatterne takker Gillian M. Wright og Alyssa M. Kumari for hjelp i tidlig feilsøking av denne metoden.

All dyrehåndtering og prosedyrer ble godkjent av University of California, Riverside institusjonelle dyrepleie- og brukskomité og var i samsvar med retningslinjer fra American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture og National Institutes of Health. Den beskrevne metoden benyttet C57BL/6 voksne, kvinnelige mus. Alle dyr ble avlivet ved halshugging før vevshøsting.
MERK: En oversikt over protokollen, som bruker et blått fargestoff for å hjelpe til m...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

De tre segmentene av ovidukten er histologisk, morfologisk og funksjonelt distinkte1,2,3. Epitelet varierer sterkt fra den ene enden av ovidukten til den andre. Ciliated celler dominerer i den fimbrial / infundibulære enden, mens sekretoriske celler dominerer i den istemiske regionen1. Selv om denne samlede gradienten har blitt anerkjent i noen tid, har nyere arbeid avdekket flere forskjeller blant ovidu...

Murin ovidukten er lik i funksjon og morfologi til det menneskelige fallopianrøret1. Begge består av et pseudostratifisert ciliated epitel, bestående av to historisk beskrevne epitelceller: ciliated celler og sekretoriske celler1,2. Ovidukten har tre klassisk anerkjente segmenter: infundibulum, ampulla og isthmus. I en nylig studie, Harwalkar et al. 3 undersøkte oviduktmorfologi og genuttrykk som førte til utvidelse av kategorisering av bosatte epitelceller til syv forskjellige populasjoner. I tillegg etablerte de ampullary-isthmus-krysset som et tydelig segment av ovidukten3. Metoden som er beskrevet her, som fokuserer på infundibulum, ampulla og isthmus, kan lett utvides til å omfatte det ampullære-iskemiske krysset også2,3. Den infundibulære regionen inneholder ostium, eller åpning av ovidukten, og inkluderer fimbrialområdet så vel som den proksimale stengelen. Beveger seg mot livmoren, neste er ampulla, og deretter isthmus. Ciliated celler er mest fremtredende i den distale enden av regionen, proksimal til eggstokken, eller infundibulum, mens sekretoriske celler er mest fremtredende i den proksimale enden eller isthmus segment1. I motsetning til det menneskelige egglederen er murin ovidukten en spolet struktur støttet av mesosalpinxen, en forlengelse av det brede ligamentperitoneum1,4. I tillegg er mus ovidukten innkapslet i en bursalsekk som øker sannsynligheten for oocyttoverføring til ovidukten4. Ampulla er identifisert som plasseringen av befruktning, hvorfra utviklende embryoer passerer inn i isthmus før de går inn i livmoren5. Tubal segmenter er 200-400 μm i diameter og lengre ampullære og isthmus regioner er ca 0,5-1,0 cm i lengde4. Ovidukten distendene under østrogensyklusen og ampulla og infundibulum er mer distensible enn isthmus1.
Over spredning av celler, spesielt sekretoriske celler, karakteriserer forløperlesjoner til serøse svulster som finnes i bekkenhulen6. Disse forløper serøse intraepitheliale lesjonene oppstår i oviduktepitelet utelukkende i fimbrialområdet; Det er ukjent hvorfor lesjonsdannelse er begrenset til denne regionen der normalt den dominerende celletypen er ciliated, ikke sekretorisk2,7,8. Regionaliteten når det gjelder normal fysiologisk funksjon, samt økt interesse for oviduktal opprinnelse av eggstokkkreft9,10,11,12,13, understreker viktigheten av separat evaluering av oviduktsegmentene.
Metoden som er beskrevet her beskriver innsamlingen av separate oviduktsegmenter for påfølgende nedstrømsanalyser av segmentspesifikke genuttrykk og funksjon av dissosierte celler. Tradisjonelt behandles mange vev for hele RNA-ekstraksjon etter enten fenol: kloroformmetode eller en komplett ekstraksjonsmetode på kolonnen; Vi fant imidlertid at RNA-kvaliteten ble opprettholdt samtidig som den produserte tilstrekkelig avkastning med den beskrevne kombinasjonsmetoden. Ved hjelp av denne metoden kan svært små funksjonelle segmenter av ovidukten behandles for nedstrømsanalyser i stedet for å undersøke ovidukten som helhet, noe som kan maskere resultater som er representative for de forskjellige segmentene14.
Dissosierte murinlegende celler har sjelden blitt undersøkt av strømningscytometri, mest sannsynlig på grunn av det begrensende celleutbyttet fra dette vevet. En tilnærming for å overvinne dette problemet har vært å dissosiere celler, vokse dem i kultur, og deretter stimulere re-differensiering in vitro for å oppnå passende celletall for nedstrøms celleanalyse15,16,17,18. En begrensning i denne tilnærmingen er tiden ex vivo og endret mikromiljø i kulturen, som begge sannsynligvis endrer genuttrykk. Det er også en antagelse at morfologisk re-differensiering har samme transkripsjonelle og proteomiske signatur som var tilstede i det intakte dyret. Den nåværende dissosiasjonsmetoden ble designet for å oppnå det høyeste antallet epitelceller i en heterogen oviduktcellepopulasjon samtidig som man opprettholder encellet differensiering. Videre begrenser den for det meste ikke-enzymatiske tilnærmingen sannsynligvis tapet av celleoverflateproteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Musemodellsystemer er uovertruffen for analyse av sykdomsprosesser på grunn av deres genetiske manipulabilitet og lave kostnader for eksperimentelle behandlinger. Men på grunn av deres lille kroppsstørrelse har noen strukturer, som ovidukten med en diameter på 200-400 μm, vist seg å være relativt vanskelig å studere bortsett fra ved immunhiistokjemi. Nylig har immunhiistokjemiske studier avdekket mer komplekse forskjeller i oviduktsegmenter enn tidligere anerkjent; Dermed er ovidukten delt inn i fire funksjonelle segmenter med forskjellige forhold mellom syv forskjellige epitelcelletyper. De forskjellige embryologiske opprinnelsene og forholdene til epitelcelletypene gjør sannsynligvis de fire funksjonelle regionene differensialt utsatt for sykdom. For eksempel oppstår forløperlesjoner til serøse intraepitheliale karsinomer fra infundibulum i musemodeller og fra den tilsvarende fimbrial-regionen i det menneskelige egglederne. Protokollen som er beskrevet her beskriver en metode for mikrodisseksjon for å dele opp ovidukten på en slik måte at den gir tilstrekkelig mengde og renhet av RNA som er nødvendig for nedstrømsanalyser som omvendt transkripsjon-kvantitativ PCR (RT-qPCR) og RNA-sekvensering (RNAseq). Også beskrevet er en for det meste ikke-enzymatisk vev dissosiasjonsmetode egnet for strømning cytometri eller enkeltcellet RNAseq analyse av fullt differensierte oviduktceller. Metodene som beskrives vil lette videre forskning ved hjelp av murin ovidukten innen reproduksjon, fruktbarhet, kreft og immunologi.

Den beskrevne dissosiasjonsprotokollen gir 100 000-120 000 celler per mus ved sammenslåing av begge oviduktene. Metoden er mild nok til å la multi-ciliated cellekantlinjer være intakte, noe som gir et skille mellom multi-ciliated celler og sekretoriske celler, og verifisere at fordøyelsesmetoden er mild nok til å forhindre avdifferensiering. Representative immunfluorescensbilder i figur 5 viser små celleklumper etter trinn 4.2.1, festet i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DPBS, vasket ...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

En metode for mikrodisseksjon av musens ovidukt som tillater innsamling av de enkelte segmentene samtidig som RNA-integriteten opprettholdes. I tillegg er ikke-enzymatisk oviductal celle dissosiasjonsprosedyre beskrevet. Metodene er egnet for påfølgende gen- og proteinanalyse av de funksjonelt forskjellige oviduktsegmentene og dissosierte oviduktceller.

Mikrodisseksjon og dissosiasjon av Murine Oviduct: Individuell segmentidentifikasjon og enkeltcelleisolasjon

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Ulike oviduktsegmenter har distinkte fysiologiske funksjoner og er differensialt utsatt for patologisk endring. Identifisering av de forskjellige segmentene i en svært liten muse ovidukt er utfordrende, og det samme er produksjonen av et godt utbytte av godt differensierte celler ved vevsdissosiasjon. I denne videoen vil vi demonstrere hvordan du løsner muse ovidukten, gjenkjenner de forskjellige segmentene slik at de kan analyseres individuelt, og til slutt hvordan man produserer et relativt høyt utbytte av differensierte dissosierte celler.En bedre forståelse av miljøet som er spesifikt for ampulla kan forbedre in vitro befruktningsteknikker. Også, ved å kontrastere infundibulum med andre segmenter, kan vi bedre forstå infundibulumets tilbøyelighet til ondartet transformasjon. Encellet dissosiasjonsprosedyre frigjør stromal, samt epitelceller fra ovidukten.Vår metode gir også muligheter til å analysere immun-, glatte muskler og epitelcellebidrag separat til fysiologi og patologi i ovidukten. Det kan være vanskelig å jobbe under et disseksjonsmikroskop i begynnelsen. Jeg vil anbefale å øve med et større rør som livmor for å sikre at verktøyene dine er tilstrekkelige for oviduktmikrodeisseksjonen.Begynn med å feste et stykke tannvoks til en Petri-tallerken med lim og la den tørke. Desinfiser deretter parabolen med 70% etanol. Overflaten er nå klar for disseksjon.Immobiliser Petri-retten som inneholder tannvoksen på den kalde plattformen under et disseksjonsmikroskop når den er klar til disseksjon. Desinfiser dyrets ventrale overflate med 70% etanol. Åpne deretter buk- og bekkenhulen med steril disseksjonssaks.Flytt mage-tarmkanalen til den ene siden for å finne dorsal bihornal livmor. Følg hvert livmorhorn rostrally for å finne hver ovidukt og eggstokk som er innhyllede i livmorfettputen like under nyrene. Deretter eksisjonerer både laterale ovidukter med eggstokkene og en del av det distale livmorhornet som fortsatt er festet ved hjelp av disseksjonssaks.Klipp hvert lateralt livmorhorn med omtrent en til to centimeter av hornet fortsatt festet til den spolede ovidukten og eggstokken. Senk vevet umiddelbart i to milliliter kaldt disseksjonsmedium, og fest deretter livmorvevet til tannvoksen med en steril 25 gauge nål for å sikre vev for disseksjon. Rengjør og disseker eggstokkfettputen og bindevevet for å visualisere ovidukten tydelig.Bruk en en milliliter sprøyte for å dispensere en til to dråper steril 1% toluidin blå fargestoffløsning og inkubere i 30 sekunder til ett minutt. Skyll med kald DPBS og fjern deretter all væsken. Trekk eggstokken lett fra den spolede ovidukten.Klipp på bursalmembranen i det brede ligamentet for å fjerne eggstokken fra ovidukten uten å gå på kompromiss med tubalvevet. Finn den distale fimbrial enden av ovidukten som finnes lateral til livmor tubal krysset. Trekk forsiktig røret og kutt bort på mesosalpinxen med fjærformet mikrosaks for å løsne ovidukten.Klipp røret for å produsere det infundibulære området. Deretter sluker ampullærområdet ved å kutte mellom sving to og tre. Til slutt, kutt den gjenværende delen til livmor tubal krysset som er den ertmiske regionen.Umiddelbart snap fryse dissekert vev segmenter i flytende nitrogen og deretter legge 200 mikroliter av kaldt RNA ekstraksjon reagens og en-til-en homogenisering perle blanding til vevet for RNA isolasjon. Start ved fimbrialområdet, skjær røret langsgående med vårform saks og bruk tang som giring for å eksponere lysepitelet. Hakk de slit åpne delene og den gjenværende ovidukten i omtrent ett til to millimeter segmenter.Tilsett deretter fem milliliter varm ikke-enzymatisk dissosiasjonsbuffer til vevet og inkuber ved 37 grader Celsius. Fluorescerende og fasekontrastbilder av en celleklynge som er positive for okcludin, kjerner og acetylert tubulin, vises her. Rødt betegner okcludin, blå betegner kjerner, og grønt betegner acetylert tubulin.Den ciliated apikale grensen forblir intakt gjennom hele protokollen og tåler videre fordøyelse til enkeltceller. I disse representative bildene vises sammenslåtte, røde, blå, fasekontrast og grønne kanaler. Etter en kort pronase inkubasjon er flertallet av cellene enkle.Propidiumjodidfarging viser omtrent 93 % levedyktighet i Brightfield, rød kanal PI positiv og sammenslåing. Innfelt ved sammenslåing viser en intakt ciliated kantlinje på en enkelt dissosiert celle. Slike celler har aktivt slått cilia.Hele RNA ble vurdert for utbytte og kvalitet av mikrovolumspektrofotometer og bioanalyser. Resultatene viser at denne metoden gir 800 til 1200 nanogram RNA per segment, bortsett fra infundibulære prøver der sammenslåing fra to dyr kan være nødvendig for passende utbytte for nedstrømsanalyser. De presenterte resultatene for infundibulum er samlet fra to dyr, totalt fire infundibulære regioner.Denne protokollen oppnår vellykket ren RNA analysert med et mikrovolumspektrofotometer og en bioanalyse. Prøver har et 260 x 280 nanometer absorpsjonsforhold mellom 1,8 og 2, typisk for rene RNA-nukleotidarter. Bioanalysering av prøvene viste høy RNA-integritet med vurdert RNA-integritetsnummer over syv, egnet for nedstrømsuttrykk og sekvenseringsanalyse.Husk å beholde en til to centimeter av livmorhornet for å feste tubalsystemet til disseksjonsplattformen. I tillegg hjelper bruken av toluidinblå fargestoff i den raske ukoilingen av ovidukten. Jo raskere uncoiling, jo bedre bevaring og minst mengde RNA nedbrytning.Denne metoden er tilstrekkelig til å oppnå RNA av passende kvalitet for RNA-sekvensering som tillater individuell segmentsekvensering. Celledissosiasjonen er egnet for sekvensering av enkeltceller eller strømningscytometri, noe som gir et mer presist segment og celleanalyse. Metoden vil bidra til å flytte feltet utover hele røranalysen som maskerer forskjeller på segmentet eller enkeltcellenivå.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muse Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikasjon av erytromyeloidprogenitorer og deres avkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolasjon og kultur av primære Epicardial celler avledet fra menneskelige voksne og fosterets hjerte prøver

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolering av murine spermatogene celler ved hjelp av en violet-spent celle-gjennomtrengelig DNA bindende fargestoff

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Celledissosiasjon fra tungeepitelet og mesenchyme/bindevev av embryonale dager 12,5 og 8 uker gamle mus

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Rask isolering av enkeltceller fra mus og menneskelige tenner

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Isolering av murine retinale endotelceller for neste generasjons sekvensering

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Identifikasjon og isolering av burst-forming unit og kolonidannende enhet Erytroide forfedre fra musevev ved flowcytometri

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...