Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Эта работа была частично поддержана премией Министерства обороны США за прорыв AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR был частично поддержан очными стипендиями: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship и Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences and University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant и Graduate Division Dissertation Year Program Award. Авторы благодарят Джиллиан М. Райт и Алиссу М. Кумари за помощь в раннем устранении неполадок этого метода.

Все процедуры обращения с животными и их процедуры были одобрены Калифорнийским университетом, институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Риверсайде и соответствовали руководящим принципам Американской ассоциации по уходу за лабораторными животными, Мин...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

Три сегмента яйцевода гистологически, морфологически и функционально различны1,2,3. Эпителий сильно варьируется от одного конца яйцевода к другому. Реснитчатые клетки доминируют на фимбриальном/инфундибулярном конце, в то время как се?...

Мышиный яйцевод похож по функциям и морфологии на человеческую фаллопиеву трубу1. Оба состоят из псевдостратифицированного реснитчатого эпителия, состоящего из двух исторически описанных эпителиальных резидентных клеток: реснитчатых клеток и секреторных клеток1,2. Яйцевод имеет три классически признанных сегмента: инфундибулум, ампулла и перешеек. В недавнем исследовании Harwalkar et al. 3 исследовали морфологию яйцеводов и экспрессию генов, что привело к расширению категоризации резидентных эпителиальных клеток до семи различных популяций. Кроме того, они установили ампуллярно-перешеечное соединение как отдельный сегмент яйцевода3. Способ, описанный в настоящем описании, который фокусируется на инфундибуле, ампуле и перешейке, может быть легко расширен, чтобы включить ампуллярно-истмическое соединение, а также2,3. Инфундибулярная область содержит остиум, или отверстие яйцевода, и включает в себя фимбриальную область, а также проксимальный стебель. Двигаясь в сторону матки, далее идет ампулла, а затем перешеек. Реснитчатые клетки наиболее заметны в дистальном конце области, проксимально к яичнику или инфундибулу, в то время как секреторные клетки наиболее заметны в проксимальном конце или сегменте перешейка1. В отличие от человеческой фаллопиевой трубы, мышиный яйцевод представляет собой спиральную структуру, поддерживаемую мезосальпинксом, продолжением широкой связки брюшины1,4. Кроме того, яйцевод мыши заключен в бурсальный мешок, что увеличивает вероятность переноса ооцитов в яйцевод4. Ампула определяется как место оплодотворения, из которого развивающиеся эмбрионы переходят в перешеек перед попаданием в матку5. Трубные сегменты имеют диаметр 200-400 мкм, а более длинные ампулярии и перешейки составляют примерно 0,5-1,0 см в длину4. Яйцевод растягивается во время эстрального цикла, а ампулы и инфундибулы более различимы, чем перешеек1.
Чрезмерная пролиферация клеток, особенно секреторных клеток, характеризует поражения предшественников серозных опухолей, обнаруженных в полости малого таза6. Эти предшественники серозных интраэпителиальных поражений возникают в эпителии яйцевода исключительно в области малоберцов; неизвестно, почему образование поражения ограничено этой областью, где обычно преобладающий тип клеток является реснитчатым, а не секреторным2,7,8. Региональность с точки зрения нормальной физиологической функции, а также повышенный интерес к яйцеводному происхождению рака яичников9,10,11,12,13 подчеркивают важность отдельной оценки сегментов яйцевода.
Метод, описанный здесь, детализирует сбор отдельных сегментов яйцевода для последующего анализа экспрессии специфических для сегмента генов и функции диссоциированных клеток. Традиционно многие ткани обрабатываются для экстракции всей РНК либо по фенолу: метод хлороформа, либо метод полной экстракции на колонке; однако мы обнаружили, что качество РНК поддерживалось при получении достаточного выхода с помощью описанного комбинированного метода. Используя этот метод, очень маленькие функциональные сегменты яйцевода могут быть обработаны для последующего анализа, а не для исследования яйцевода в целом, что может маскировать результаты, репрезентативные для различных сегментов14.
Диссоциированные мышиные клетки яйцеводов редко исследовались с помощью проточной цитометрии, скорее всего, из-за предельного выхода клеток из этой ткани. Один из подходов к преодолению этой проблемы заключался в диссоциации клеток, выращивании их в культуре, а затем стимуляции редифференцировки in vitro для получения соответствующих номеров клеток для последующего анализа клеток15,16,17,18. Ограничением этого подхода является время ex vivo и измененная микросреда в культуре, оба из которых, вероятно, изменяют экспрессию генов. Существует также предположение, что морфологическая редифференцировка имеет ту же транскрипционную и протеомную сигнатуру, что и у интактного животного. Современный метод диссоциации был разработан для достижения наибольшего количества эпителиальных клеток в гетерогенной популяции яйцеводных клеток при сохранении дифференцировки одиночных клеток. Кроме того, в основном неферментативный подход, вероятно, ограничивает потерю белков клеточной поверхности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Мышиные модельные системы не имеют себе равных для анализа процессов заболевания из-за их генетической манипулируемости и низкой стоимости экспериментального лечения. Однако из-за их небольшого размера тела некоторые структуры, такие как яйцевод диаметром 200-400 мкм, оказались относительно трудными для изучения, кроме как с помощью иммуногистохимии. В последнее время иммуногистохимические исследования выявили более сложные различия в сегментах яйцеводов, чем было признано ранее; таким образом, яйцевод делится на четыре функциональных сегмента с различным соотношением семи различных типов эпителиальных клеток. Различное эмбриологическое происхождение и соотношение типов эпителиальных клеток, вероятно, делают четыре функциональные области дифференцированно восприимчивыми к болезням. Например, поражения-предшественники серозных интраэпителиальных карцином возникают из инфундибулума в мышиных моделях и из соответствующей фимбриальной области в фаллопиевой трубе человека. Протокол, описанный здесь, детализирует метод микродиссекции для разделения яйцевода таким образом, чтобы получить достаточное количество и чистоту РНК, необходимых для последующего анализа, такого как обратная транскрипционно-количественная ПЦР (RT-qPCR) и секвенирование РНК (RNAseq). Также описан в основном неферментативный метод диссоциации тканей, подходящий для проточной цитометрии или одноклеточного анализа RNAseq полностью дифференцированных клеток яйцевода. Описанные методы будут способствовать дальнейшим исследованиям с использованием мышиного яйцевода в области репродукции, фертильности, рака и иммунологии.

Описанный протокол диссоциации дает 100 000-120 000 клеток на мышь с объединением обоих яйцеводов. Метод достаточно мягкий, чтобы оставить многореснитчатые клеточные границы нетронутыми, что позволяет проводить различие между мультиреснитчатыми клетками и секреторными клетками и проверят...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Представлен способ микродиссекции яйцевода мыши, позволяющий собирать отдельные сегменты при сохранении целостности РНК. Кроме того, описана процедура неферментативной диссоциации клеток яйцевода. Методы подходят для последующего генного и белкового анализа функционально различных сегментов яйцеводов и диссоциированных клеток яйцевода.

Микродиссекция и диссоциация мышиного яйцевода: идентификация отдельных сегментов и изоляция одиночных клеток

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Различные сегменты яйцеводов имеют различные физиологические функции и дифференциально подвержены патологическим изменениям. Идентификация различных сегментов в очень маленьком мышином яйцеводе является сложной задачей, как и получение хорошего выхода хорошо дифференцированных клеток путем диссоциации тканей. В этом видео мы продемонстрируем, как размотать яйцевод мыши, распознать различные сегменты, чтобы их можно было анализировать по отдельности, и, наконец, как получить относительно высокий выход дифференцированных диссоциированных клеток.Лучшее понимание окружающей среды, специфичной для ампулы, может улучшить методы экстракорпорального оплодотворения. Кроме того, сравнивая инфундибулум с другими сегментами, мы можем лучше понять склонность инфундибулы к злокачественной трансформации. Процедура одноклеточной диссоциации высвобождает стромальные, а также эпителиальные клетки из яйцевода.Наш метод также дает возможность отдельно анализировать вклад иммунных, гладкомышечных и эпителиальных клеток в физиологию и патологию яйцевода. Работа под рассеченным микроскопом поначалу может быть затруднена. Я бы посоветовал практиковать с большей трубкой, такой как матка, чтобы убедиться, что ваши инструменты адекватны для микродиссекции яйцевода.Начните с прикрепления куска зубного воска к чашке Петри с помощью клея и дайте ему высохнуть. Затем продезинфицируйте блюдо 70% этанолом. Теперь поверхность готова к рассечению.Обездвижите чашку Петри, содержащую зубной воск, на холодной платформе под рассеченным микроскопом, когда она будет готова к рассечению. Продезинфицируйте вентральную поверхность животного 70% этанолом. Затем вскрывают брюшную и тазовую полость стерильными рассеченными ножницами.Переместите желудочно-кишечный тракт в одну сторону, чтобы найти дорсальную двурогую матку. Следуйте за каждым маточным рогом рострально, чтобы найти каждый яйцевод и яичник, которые окутаны жировой подушкой матки чуть ниже почки. Затем иссекайте оба боковых яйцевода с яичниками и часть дистального рога матки, все еще прикрепленную с помощью ножниц для рассечения.Отрежьте каждый боковой рог матки примерно одним-двумя сантиметрами рога, все еще прикрепленными к спиральному яйцеводу и яичнику. Погрузите ткань сразу в два миллилитра холодной рассеченной среды, затем прикрепите ткань матки к стоматологическому воску стерильной иглой 25 калибра, чтобы закрепить ткань для рассечения. Очистите и рассекните жировую прокладку яичников и соединительную ткань, чтобы четко визуализировать яйцевод.Используйте один миллилитр шприца, чтобы дозировать одну-две капли стерильного 1%-толуидинового синего раствора красителя и инкубировать в течение 30 секунд до одной минуты. Смойте холодным DPBS, а затем удалите всю жидкость. Слегка вытяните завязь из спирального яйцевода.Разрезать на бурсальной мембране в широкой связке, чтобы удалить яичник из яйцевода без ущерба для трубной ткани. Найдите дистальный фимбриальный конец яйцевода, найденный латерально к маточному трубному соединению. Аккуратно потяните трубку и отрежьте мезосальпинкс пружинными микроножницами, чтобы размотать яйцевод.Отрежьте трубку, чтобы получить инфундибулярную область. Затем иссекают ампуллярную область, разрезая между вторым и третьим оборотами. Наконец, отрежьте оставшуюся часть до маточных труб, которое является истмической областью.Немедленно заморозьте рассеченные сегменты ткани в жидком азоте, а затем добавьте 200 микролитров реагента для экстракции холодной РНК и смесь шариков гомогенизации один к одному в ткань для выделения РНК. Начиная с краевой области, перерезайте трубку продольно пружинными ножницами и используйте щипцы в качестве рычага для обнажения просветного эпителия. Измельчите разрезанные участки и оставшийся яйцевод примерно на один-два миллиметровых сегмента.Затем добавьте к ткани пять миллилитров теплого неферментативного диссоциативного буфера и высиживают при 37 градусах Цельсия. Здесь показаны флуоресцентные и фазово-контрастные изображения клеточного кластера, положительного на окклюдин, ядра и ацетилированный тубулин. Красный обозначает окклюдин, синий обозначает ядра, а зеленый обозначает ацетилированный тубулин.Реснитчатая апикальная граница остается неповрежденной на протяжении всего протокола и выдерживает дальнейшее переваривание одиночных клеток. На этих репрезентативных изображениях показаны объединенные, красный, синий, фазовый контраст и зеленый каналы. После кратковременной проназной инкубации большинство клеток единичны.Окрашивание йодидом пропидия показывает примерно 93% жизнеспособность в Brightfield, красный канал PI положительный и слияние. Вставка при слиянии показывает неповрежденную реснитчатую границу на одной диссоциированной клетке. Такие клетки имеют активно бьющиеся реснички.Вся РНК оценивалась на выход и качество с помощью микрообъемного спектрофотометра и биоанализатора. Результаты показывают, что этот метод дает от 800 до 1 200 нанограмм РНК на сегмент, за исключением инфундибулярных образцов, где объединение двух животных может быть необходимо для соответствующего выхода для последующих анализов. Представленные результаты для инфундибулума объединены из двух животных, в общей сложности четыре инфундибулярных региона.Этот протокол успешно достигает чистой РНК, проанализированной с помощью микрообъемного спектрофотометра и биоанализатора. Образцы имеют коэффициент поглощения 260 на 280 нанометров между 1,8 и 2, типичный для чистых видов нуклеотидов РНК. Биоанализ образцов показал высокую целостность РНК с оцененным числом целостности РНК выше семи, подходящим для последующей экспрессии и анализа секвенирования.Не забудьте сохранить один-два сантиметра маточного рога, чтобы прикрепить трубную систему к платформе рассечения. Кроме того, использование красителя толуидинового синего помогает в быстром раскручивании яйцевода. Чем быстрее раскручивается, тем лучше сохранность и наименьшее количество деградации РНК.Этот метод достаточен для получения РНК соответствующего качества для секвенирования РНК, что позволяет проводить секвенирование отдельных сегментов. Диссоциация клеток подходит для секвенирования одной клетки или проточной цитометрии, что позволяет проводить более точный анализ сегментов и клеток. Метод поможет вывести поле за пределы анализа всей трубки, который маскирует различия на уровне сегмента или одной клетки.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Идентификация эритромиелоидных прародителей и их потомство в мышечном эмбрионе методом проточной цитометрии

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Диссоциация клеток из эпителия языка и мезенхимы/соединительной ткани эмбриональных мышей 12,5 и 8 недель

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Быстрая изоляция одиночных клеток из зубов мышей и человека

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Выделение эндотелиальных клеток мышиной сетчатки для секвенирования следующего поколения

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Идентификация и выделение лопающих и колониеобразующих эритроидных предшественников из мышиной ткани с помощью проточной цитометрии

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...