Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av en DoD Breakthrough Award till AMW (BCRP W81XWH-14-1-0425). KCR stöddes delvis av intramural stipendier: Pease Cancer Pre-Doctoral Fellowship och Mary Galvin Burden Pre-Doctoral Fellowship in Biomedical Sciences och University of California, Riverside, intramural awards: Graduate Council Fellowship Committee Dissertation Research Grant och Graduate Division Dissertation Year Program Award. Författarna tackar Gillian M. Wright och Alyssa M. Kumari för hjälp med tidig felsökning av denna metod.

All djurhantering och djurprocedurer godkändes av University of California, Riverside institutional animal care and use committee och var i enlighet med riktlinjer från American Association for Laboratory Animal Care, United States Department of Agriculture och National Institutes of Health. Den beskrivna metoden används C57BL/6 vuxna, kvinnliga möss. Alla djur avlivades genom halshuggning före vävnadsskörd.
OBS: En översikt över protokollet, som använder ett blått färgämne för a...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

De tre segmenten av äggledaren är histologiskt, morfologiskt och funktionellt distinkt1,2,3. Epitelet varierar kraftigt från ena änden av äggledaren till den andra. Ciliated celler dominerar vid fimbrial/infundibular änden, medan sekretoriska celler dominerar i den isthmic regionen1. Även om denna övergripande gradient har erkänts under en tid, har det senaste arbetet avslöjat fler skillnader me...

Murinovidukten liknar funktion och morfologi till det mänskliga äggledaren1. Båda består av en pseudostratified ciliated epitelium, bestående av två historiskt beskrivna epitelial bosatta celler: ciliated celler och sekretoriska celler1,2. Ovidukten har tre klassiskt erkända segment: infundibulum, ampulla och näset. I en ny studie, Harwalkar et al. 3 undersökt oviduct morfologi och genuttryck som leder till expansion av kategorisering av bosatta epitelceller till sju distinkta populationer. Dessutom etablerade de ampullary-isthmus korsningen som ett distinkt segment av oviduct3. Metoden som beskrivs häri, som fokuserar på infundibulum, ampulla och näs, skulle lätt kunna utvidgas till att omfatta den ampullära istmiska korsningen också2,3. Den infundibulära regionen innehåller ostium, eller öppning av ovidukten, och inkluderar fimbrialregionen samt den proximala stjälken. Rör sig mot livmodern, nästa är ampulla, och sedan näset. Ciliated celler är mest framträdande i den distala änden av regionen, proximal till äggstocken eller infundibulum, medan sekretoriska celler är mest framträdande i proximal ände eller näs segmentet1. Till skillnad från det mänskliga äggledaren är murinovidukten en spiralformad struktur som stöds av mesosalpinx, en förlängning av det breda ligamentet peritoneum1,4. Dessutom är musovidukten innesluten i en bursalsäck som ökar sannolikheten för äggcellöverföring till äggledaren4. Ampulla identifieras som platsen för befruktning, från vilken utvecklande embryon passerar in i näset innan de går in i livmodern5. Tubalsegmenten är 200-400 μm i diameter och de längre ampullära och näsregionerna är cirka 0,5-1,0 cm långa4. Oviduct distends under den estrous cykeln och ampulla och infundibulum är mer distensible än isthmus1.
Över spridning av celler, särskilt sekretoriska celler, karakteriserar prekursor skador till serösa tumörer som finns i bäckenhålorna hålighet6. Dessa prekursor serous intraepithelial organskador uppstår i oviduct epitelium endast i fimbrial regionen. det är okänt varför lesion bildas är begränsad till denna region där normalt den dominerande celltypen är ciliated, inte secretory2,7,8. Regionaliteten när det gäller normal fysiologisk funktion, liksom ökat intresse för äggledscancerns oviduktala ursprung9,10,11,12,13, understryker vikten av separat utvärdering av äggledarens segment.
Metoden som beskrivs här beskriver insamlingen av separata oviductal segment för efterföljande nedströms analyser av segment-specifika gen uttryck och funktion av dissociated celler. Traditionellt bearbetas många vävnader för hela RNA-extraktion efter antingen fenol: kloroformmetod eller en komplett extraktionsmetod på kolonnen; Vi fann dock att RNA kvalitet bibehölls samtidigt som det gav tillräcklig avkastning med den beskrivna kombinationsmetoden. Med hjälp av denna metod kan mycket små funktionella segment av äggledaren bearbetas för nedströmsanalyser snarare än att undersöka äggledaren som helhet, vilket kan maskera resultat som är representativa för de olika segmenten14.
Dissociated murine oviductal celler har sällan undersökts av flöde cytometri, troligen på grund av att begränsa cellutbytet från denna vävnad. Ett tillvägagångssätt för att övervinna detta problem har varit att separera celler, odla dem i kultur och sedan stimulera återdifferentiering in vitro för att få lämpliga cellnummer för nedströms cellanalys15,16,17,18. En begränsning till detta tillvägagångssätt är tid ex vivo och förändrad mikromiljön i kultur, som båda sannolikt förändra genuttryck. Det finns också ett antagande att morfologiska re-differentiering har samma transkriptionella och proteomiska signatur som var närvarande i det intakta djuret. Den nuvarande dissociation metoden utformades för att uppnå det högsta antalet epitelial celler i en heterogen oviductal cell population samtidigt upprätthålla en enda cell differentiering. Vidare begränsar den mestadels icke-enzymatiska metoden sannolikt förlusten av cellytans proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Musmodellsystem är oöverträffade för analys av sjukdomsprocesser på grund av deras genetiska manipulabilitet och den låga kostnaden för experimentella behandlingar. Men på grund av sin lilla kroppsstorlek har vissa strukturer, såsom äggledaren med en diameter på 200-400 μm, visat sig vara relativt svåra att studera förutom genom immunohistokemi. Nyligen har immunohistokemiska studier avslöjat mer komplexa skillnader i oviduktsegment än vad som tidigare erkänts; Således är äggledaren indelad i fyra funktionella segment med olika förhållanden av sju distinkta epitelcelltyper. De olika embryological ursprung och förhållanden av epitelial celltyper sannolikt gör de fyra funktionella regionerna differentiellt mottagliga för sjukdom. Till exempel uppstår prekursorskador till serösa intraepithelial carcinom från infundibulum i musmodeller och från motsvarande fimbrial regionen i den mänskliga äggledaren. Protokollet som beskrivs här beskriver en metod för mikrodissection för att dela upp äggledaren på ett sådant sätt att den ger en tillräcklig mängd och renhet av RNA som är nödvändig för nedströmsanalys såsom omvänd transkription-kvantitativ PCR (RT-qPCR) och RNA-sekvensering (RNAseq). Också beskrivs är en mestadels icke-enzymatiska vävnad dissociation metod lämplig för flöde cytometri eller en cell RNAseq analys av fullt differentierade oviductal celler. De beskrivna metoderna kommer att underlätta ytterligare forskning med hjälp av murinovidukten inom reproduktion, fertilitet, cancer och immunologi.

Det beskrivna dissociationsprotokollet ger 100 000-120 000 celler per mus med poolning av båda äggledaren. Metoden är skonsam nog att lämna multikilierade cellgränser intakta, vilket möjliggör en åtskillnad mellan multikilierade celler och sekretoriska celler, och verifierar att matsmältningsmetoden är skonsam nog att förhindra avdifferentiering. Representativa immunofluorescensbilder i figur 5 visar småcellsklumpar efter steg 4.2.1, fixerad i 3 min i 4% paraformaldehyd (PFA)/ DP...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

En metod för mikrodissection av musovidukten som möjliggör insamling av de enskilda segmenten samtidigt som RNA-integriteten upprätthålls presenteras. Dessutom beskrivs icke-enzymatiska oviductal cell dissociation förfarande. Metoderna är lämpliga för efterföljande gen- och proteinanalys av de funktionellt olika oviduktala segmenten och dissocierade oviduktala celler.

Mikrodissection och dissociation av Murine Oviduct: Individuell segmentidentifiering och isolering av encellsceller

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Olika oviduktsegment har distinkta fysiologiska funktioner och är differentiellt mottagliga för patologisk förändring. Identifiering av de olika segmenten i en mycket liten musovidukt är utmanande, liksom produktionen av ett bra utbyte av väldifferentierade celler genom vävnadssociation. I den här videon kommer vi att visa hur man lossar musovidukten, känner igen de olika segmenten så att de kan analyseras individuellt och slutligen hur man producerar ett relativt högt utbyte av differentierade dissocierade celler.En bättre förståelse för den miljö som är specifik för ampulla kan förbättra in vitro-befruktningstekniken. Genom att kontrastera infundibulum med andra segment kan vi bättre förstå infundibulums benägenhet för maligna omvandling. Encells dissociation förfarandet frigör stromal, liksom epitelial celler från oviduct.Vår metod ger också möjligheter att separat analysera immuna, släta muskler och epitelcellbidrag till oviduktens fysiologi och patologi. Att arbeta under ett dissekeringsmikroskop kan vara svårt i början. Jag skulle råda att öva med ett större rör som livmodern för att säkerställa att dina verktyg är tillräckliga för oviduktmikrossektionen.Börja med att fästa en bit tandvax på en Petri-maträtt med lim och låt den torka. Sanera sedan skålen med 70% etanol. Ytan är nu klar för dissekering.Immobilisera Petriskålen som innehåller tandvaxet på den kalla plattformen under ett dissekeringsmikroskop när det är klart för dissekering. Desinficera djurets ventrala yta med 70% etanol. Öppna sedan buk- och bäckenhålan med steril dissekeringssax.Flytta mag-tarmkanalen till ena sidan för att hitta den dorsala bihornala livmodern. Följ varje livmoderhorn rostrally för att hitta varje äggledare och äggstock som är omslutna i livmoderns fettkudde strax under njuren. Punktskatta sedan både laterala ovidukter med äggstockarna och en del av det distala livmoderhornet som fortfarande är fastsatt med dissekeringssax.Skär varje lateralt livmoderhorn med ungefär en till två centimeter av hornet fortfarande fäst vid den hoprullade äggledaren och äggstocken. Sänk ner vävnaden omedelbart i två milliliter kall dissekeringsmedel och fäst sedan livmodervävnaden på tandvaxet med en steril 25 gauge nål för att säkra vävnad för dissekering. Rengör och dissekera äggstocksfettkudden och bindväven för att visualisera äggledaren tydligt.Använd en en milliliter spruta för att dosera en till två droppar steril 1% toluidinblå färglösning och inkubera i 30 sekunder till en minut. Skölj med kallt DPBS och ta sedan bort all vätska. Dra lätt äggstocken från den hoprullade äggledaren.Skär vid bursalamembranet i det breda ligamentet för att ta bort äggstocken från äggledaren utan att kompromissa med tubvävnaden. Hitta den distala fimbrial änden av äggledaren hittade lateralt till livmoderns tubal korsningen. Dra försiktigt röret och skär bort vid mesosalpinx med fjäderform mikrosax för att lossa äggledaren.Skär röret för att producera den infundibulära regionen. Stryk sedan ampullärregionen genom att skära mellan varv två och tre. Slutligen skär du den återstående delen till livmoderns tubalkorsning som är den istemiska regionen.Omedelbart snap frysa de dissekerade vävnadssegmenten i flytande kväve och tillsätt sedan 200 mikroliter av kallt RNA-extraktionsreagens och en-till-en homogeniseringspärlablandning till vävnaden för RNA-isolering. Börja vid fimbrialområdet, skär röret längsgående med fjäderformssax och använd tång som hävstång för att exponera det lysande epitelet. Hacka slitsen öppna delar och den återstående äggledaren i ungefär en till två millimeters segment.Tillsätt sedan fem milliliter varm icke-enzymatisk dissociationsbuffert till vävnaden och inkubera vid 37 grader Celsius. Fluorescerande och faskontrastbilder av ett cellkluster som är positivt för ocklusin, kärnor och acetylerad tubulin visas här. Rött betecknar ocklusin, blått betecknar kärnor och grönt betecknar acetyated tubulin.Den ciliated apikala gränsen förblir intakt genom hela protokollet och tål ytterligare matsmältning till enstaka celler. I dessa representativa bilder visas sammanfogade, röda, blå, faskontrast och gröna kanaler. Efter en kort pronasinkubation är majoriteten av cellerna enkla.Propidiumjodidfärgning visar ungefär 93% livskraft i Brightfield, röd kanal PI-positiv och sammanslagning. Infälld vid sammanslagning visar en intakt cilierad kantlinje på en enda dissocierad cell. Sådana celler har aktivt slagit cilia.Hela RNA bedömdes för avkastning och kvalitet av mikrovolum spektrofotometer och bioanalyzer. Resultaten visar att denna metod ger 800–1 200 nanogram RNA per segment, med undantag för infundibulära prover där sammanslagning från två djur kan vara nödvändig för lämplig avkastning för nedströmsanalyser. De presenterade resultaten för infundibulum är poolade från två djur, totalt fyra infundibular regioner.Detta protokoll uppnår framgångsrikt rent RNA analyserat med en mikrovolum spektrofotometer och en bioanalyzer. Proverna har ett absorptionsförhållande på 260 med 280 nanometer mellan 1,8 och 2, typiskt för rena RNA-nukleotidarter. Bioanalyzing proverna visade hög RNA integritet med bedömda RNA integritetsnummer över sju, lämpligt för nedströms uttryck och sekvensering analys.Kom ihåg att behålla en till två centimeter av livmoderhornet för att fästa tubsystemet på dissekeringsplattformen. Dessutom hjälper användningen av toluidinblå färgämnet vid snabb uncoiling av äggledaren. Ju snabbare uncoiling, desto bättre bevarande och minsta mängd RNA-nedbrytning.Denna metod är tillräcklig för att erhålla RNA av lämplig kvalitet för RNA-sekvensering som möjliggör individuell segmentsekvensering. Cell dissociation är lämplig för encellig sekvensering eller flödescytometri som möjliggör ett mer exakt segment och cellanalys. Metoden hjälper till att flytta fältet bortom helrörsanalys som maskerar skillnader på segment- eller encellsnivå.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murin Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation av erytromyeloidprogenitorer och deras avkomma i musembryo med flödescytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Isolering och kultur av primära epikardiell celler från mänskliga vuxen och fostrets hjärta exemplar

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolering av Murine Spermaogena celler med hjälp av en Violet-Excited Cell-Permeable DNA Bindande Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Cell dissociation från tungan Epitel och Mesenchyme/Bindväv av embryonal dag 12,5 och 8 veckor gamla möss

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Snabb isolering av enstaka celler från mus och mänskliga tänder

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Isolering av murina retinala endotelceller för nästa generations sekvensering

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Identifiering och isolering av sprängbildande enhet och kolonibildande enhet erytroidförfäder från musvävnad genom flödescytometri

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...