Name: microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Bu çalışma kısmen AMW'ye DoD Breakthrough Ödülü (BCRP W81XWH-14-1-0425) tarafından desteklendi. KCR kısmen intramural burslarla desteklendi: Pease Cancer Doktora Öncesi Bursu ve Mary Galvin Burden Biyomedikal Bilimler ve Kaliforniya Üniversitesi, Riverside'daki Doktora Öncesi Bursu, intramural ödüller: Lisansüstü Konsey Burs Komitesi Tez Araştırma Hibesi ve Lisansüstü Bölüm Tez Yılı Program Ödülü. Yazarlar Gillian M. Wright ve Alyssa M. Kumari'ye bu yöntemin erken sorun giderilmesinde yardımları için teşekkür eder.

Tüm hayvan taşıma ve prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi, Riverside kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı ve Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakım Derneği, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygundu. Açıklanan yöntem C57BL / 6 yetişkin, dişi fareler kullandı. Tüm hayvanlar doku hasadı öncesinde kafalarının kesilmesiyle ötenaziye tabi edildi.
NOT: Yumurta kanalının verimli bir ...

<ol>
	<li>Stewart, C. A., et al., Kubiak, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse oviduct developmemt in Mouse Development: From Oocyte to Stem Cells. , 247-262 (2012).</li><li>Ford, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviduct+epithelial+cells+constitute+two+developmentally+distinct+lineages+that+are+spatially+separated+along+the+distal-proximal+axis.">Oviduct epithelial cells constitute two developmentally distinct lineages that are spatially separated along the distal-proximal axis.</a> Cell Reports. 36 (10), 109677 (2021).</li><li>Harwalkar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+cellular+heterogeneity+in+the+mouse+oviduct-its+potential+roles+in+reproduction+and+preimplantation+development.">Anatomical and cellular heterogeneity in the mouse oviduct-its potential roles in reproduction and preimplantation development.</a> Biology of Reproduction. 104 (6), 1249-1261 (2021).</li><li>Agduhr, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+structure+and+development+of+the+bursa+ovarica+and+the+tuba+uterina+in+the+mouse.">Studies on the structure and development of the bursa ovarica and the tuba uterina in the mouse.</a> Acta Zoologica. 8 (1), 1 (1927).</li><li>Pulkkinen, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviductal+function+is+critical+for+very+early+human+life.">Oviductal function is critical for very early human life.</a> Annals of Medicine. 27 (3), 307-310 (1995).</li><li>Kindelberger, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepithelial+carcinoma+of+the+fimbria+and+pelvic+serous+carcinoma:+Evidence+for+a+causal+relationship.">Intraepithelial carcinoma of the fimbria and pelvic serous carcinoma: Evidence for a causal relationship.</a> American Journal of Surgical Pathology. 31 (2), 161-169 (2007).</li><li>Ghosh, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genetic+cell+lineage+tracing+reveals+that+oviductal+secretory+cells+self-renew+and+give+rise+to+ciliated+cells.">In vivo genetic cell lineage tracing reveals that oviductal secretory cells self-renew and give rise to ciliated cells.</a> Development. 144 (17), 3031-3041 (2017).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+candidate+precursor+to+serous+carcinoma+that+originates+in+the+distal+fallopian+tube.">A candidate precursor to serous carcinoma that originates in the distal fallopian tube.</a> Journal of Pathology. 211 (1), 26-35 (2007).</li><li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+ovarian+cancer+arises+from+fallopian+tube+in+a+mouse+model.">High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3921-3926 (2012).</li><li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca;Tp53;Pten+models.">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).</li><li>Sherman-Baust, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+engineered+ovarian+cancer+mouse+model+based+on+fallopian+tube+transformation+mimics+human+high-grade+serous+carcinoma+development.">A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development.</a> Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).</li><li>Zhai, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-grade+serous+carcinomas+arise+in+the+mouse+oviduct+via+defects+linked+to+the+human+disease.">High-grade serous carcinomas arise in the mouse oviduct via defects linked to the human disease.</a> Journal of Pathology. 243 (1), 16-25 (2017).</li><li>Karthikeyan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolactin+signaling+drives+tumorigenesis+in+human+high+grade+serous+ovarian+cancer+cells+and+in+a+spontaneous+fallopian+tube+derived+model.">Prolactin signaling drives tumorigenesis in human high grade serous ovarian cancer cells and in a spontaneous fallopian tube derived model.</a> Cancer Letters. 433, 221-231 (2018).</li><li>Shao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+prolactin+receptor+(PRLR)+in+mouse+and+human+fallopian+tubes:+Evidence+for+multiple+regulatory+mechanisms+controlling+PRLR+isoform+expression+in+mice.">Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: Evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice.</a> Biology of Reproduction. 79 (4), 748-757 (2008).</li><li>Alwosaibai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+maintains+the+differentiation+of+mouse+oviductal+epithelium+and+inhibits+the+transition+to+a+stem+cell-like+state.">PAX2 maintains the differentiation of mouse oviductal epithelium and inhibits the transition to a stem cell-like state.</a> Oncotarget. 8 (44), 76881-76897 (2017).</li><li>Peri, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+class+of+interstitial+cells+in+the+mouse+and+monkey+female+reproductive+tracts.">A novel class of interstitial cells in the mouse and monkey female reproductive tracts.</a> Biology of Reproduction. 92 (4), 102 (2015).</li><li>L&#245;hmussaar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+origin+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+using+CRISPR-modification+of+mouse+organoids.">Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids.</a> Nature Communications. 11 (1), 2660 (2020).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+air-liquid+interphase+approach+for+modeling+the+early+embryo-maternal+contact+zone.">An air-liquid interphase approach for modeling the early embryo-maternal contact zone.</a> Scientific Reports. 7, 42298 (2017).</li><li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids.">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2565 (2010).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).</li><li>McGlade, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+physiological+action+of+estrogen+in+mouse+oviducts.">Cell-type specific analysis of physiological action of estrogen in mouse oviducts.</a> The FASEB Journal. 35 (5), 21563 (2021).</li></ol>

Yumurta kanalının üç segmenti histolojik, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı1,2,3'tür. Epitel, yumurta kanalının bir ucundan diğerine büyük ölçüde değişir. Fimbrial/infundibular uçta siliated hücreler baskınken, istik bölgede salgı hücreleri hakimdir1. Bu genel gradyan bir süredir tanınsa da, son çalışmalar oviductal segmentler arasında daha fazla ayrım ortaya çıkardı....

Murin oviduct fonksiyon ve morfoloji olarak insan fallop tüpüne benzer1. Her ikisi de tarihsel olarak tanımlanmış iki epitel yerleşik hücreden oluşan sözde siliated epitelden oluşur: siliated hücreler ve salgı hücreleri1,2. Yumurta kanalının klasik olarak tanınan üç bölümü vardır: infundibulum, ampulla ve isthmus. Yeni bir çalışmada, Harwalkar ve ark. 3, yerleşik epitel hücrelerinin kategorizasyonunun yedi farklı popülasyona genişlemesine yol açan yumurta kanalı morfolojisi ve gen ekspresyasyonu araştırılmıştır. Buna ek olarak, ampullary-isthmus kavşağını oviduct3'ün ayrı bir segmenti olarak kurdular. Burada açıklanan ve infundibulum, ampulla ve isthmus'a odaklanan yöntem, ampullery-isthmic kavşağını da içerecek şekilde kolayca genişletilebilir2,3. İnfundibular bölge ostium veya yumurta kanalının açılmasını içerir ve fimbrial bölgenin yanı sıra proksimal sapı içerir. Rahime doğru ilerlerken, sırada ampulla ve sonra isthmus var. Siliated hücreler en çok bölgenin distal ucunda, yumurtalık proksimal veya infundibulumda öne çıkarken, salgı hücreleri en çok proksimal uçta veya isthmus segmentinde belirgindir1. İnsan fallop tüpünün aksine, murine oviduct, geniş ligament peritonunun bir uzantısı olan mezosalpinx tarafından desteklenen sarmal bir yapıdır1,4. Ek olarak, fare oviduct, oviduct4'e oosit transferi olasılığını artıran bir bursal keseye kaplanmıştır. Ampulla, gelişmekte olan embriyoların uterusa girmeden önce isthmusa geçtiği döllenme yeri olarak tanımlanır5. Tubal segmentler 200-400 μm çapında ve daha uzun ampullery ve isthmus bölgeleri yaklaşık 0.5-1.0 cm uzunluğundadır4. Östrous döngüsü sırasındaki oviduct distendleri ve ampulla ve infundibulum isthmus1'den daha dağılabilir.
Hücrelerin, özellikle de salgı hücrelerinin aşırı çoğalması, pelvik boşlukta bulunan seröz tümörlere öncü lezyonları karakterize eder6. Bu öncül seröz intraepithelial lezyonlar sadece fimbrial bölgede yumurta kanalı epitelinde ortaya çıkar; lezyon oluşumunun neden salgı 2,7,8 değil, normalde baskın hücre tipinin siliated olduğu bu bölge ile sınırlı olduğu bilinmemektedir. Normal fizyolojik fonksiyon açısından bölgesellik ve yumurtalık kanserinin ovidüktal kökenine olan ilginin artması9,10,11,12,13, yumurta kanalı segmentlerinin ayrı ayrı değerlendirilmesinin öneminin altını çizmektedir.
Burada açıklanan yöntem, segmente özgü gen ekspresyonunun ve ayrışmış hücrelerin işlevinin sonraki aşağı akış analizleri için ayrı ovidüktal segmentlerin toplanmasını detaylandırmaktadır. Geleneksel olarak, birçok doku fenolden sonra tüm RNA ekstraksiyonu için işlenir: kloroform yöntemi veya sütun üzerinde tam ekstraksiyon yöntemi; ancak açıklanan kombinasyon yöntemi ile yeterli verim üretilirken RNA kalitesinin korunduğunu tespit ettik. Bu yöntem kullanılarak, yumurta kanalının çok küçük fonksiyonel segmentleri, yumurta kanalını bir bütün olarak araştırmak yerine aşağı akış analizleri için işlenebilir ve bu da farklı segmentlerin sonuç temsilcisini maskeleyebilir14.
Dissositasyonlu murin ovidüktal hücreler, büyük olasılıkla bu dokudan hücre verimini sınırlaması nedeniyle akış sitometrisi tarafından nadiren araştırılmıştır. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir yaklaşım, hücreleri ayrıştırmak, kültürde büyütmek ve daha sonra aşağı akış hücre analizi için uygun hücre numaralarını elde etmek için yeniden farklılaşma in vitrosunu teşvik etmek olmuştur15,16,17,18. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, kültürde ex vivo ve değiştirilmiş mikroçevrim zamanıdır ve her ikisi de gen ekspresyonunun değişmesidir. Morfolojik yeniden farklılaşmanın, bozulmamış hayvanda mevcut olan transkripsiyon ve proteomik imzaya sahip olduğu varsayımı da vardır. Mevcut ayrışma yöntemi, tek hücre farklılaşması sürdürülürken heterojen ovidüktal hücre popülasyonunda en yüksek sayıda epitel hücre elde etmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, çoğunlukla enzmatik olmayan yaklaşım muhtemelen hücre yüzey proteinlerinin kaybını sınırlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB05</td>
			<td>Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.4 mm Stainless steel bead mix</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
			<td>Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td>Cold, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm sterile petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell meshes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-636-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBY24M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate/pack/surface of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Kept at -20C for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/ Ham&#8217;s F12</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-090-CV</td>
			<td>Prepare dissection medium: DMEM/ Ham&#8217;s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine point forceps of choice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G712b</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21422</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoescht 33342</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>4082S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted compound microscope</td>
			<td>Keyence BZ-X700</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-mouse Occludin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>33-1500</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-enzymatic dissociation buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1210U04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6148</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>10220-718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham&#39;s F12, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 348 639 001</td>
			<td>Viability validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab179484</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td>Utilized for on-column purification in text.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring form microdissection scissors</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td>RS-5610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 3 mL bulb pipettors</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J66015</td>
			<td>Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Mallinckrodt Inc.</td>
			<td>3555</td>
			<td>Immunocytochemical validation images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer&#39;s guidelines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microdissection and dissociation of the murine oviduct: individual segment identification and single cell isolation

Fare modeli sistemleri, genetik manipülabillikleri ve deneysel tedavilerin maliyetinin düşük olması nedeniyle hastalık süreçlerinin analizi için eşsizdir. Bununla birlikte, küçük vücut boyutları nedeniyle, 200-400 μm çapındaki yumurta kanalı gibi bazı yapıların, immünhistokimya dışında incelenmesinin nispeten zor olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, immünohistokimyasal çalışmalar, yumurta kanalı segmentlerinde daha önce tanınandan daha karmaşık farklılıklar ortaya çıkarmıştır; böylece, yumurta kanalı yedi farklı epitel hücre tipinin farklı oranlarına sahip dört fonksiyonel segmente ayrılır. Epitel hücre tiplerinin farklı embriyolojik kökenleri ve oranları muhtemelen dört fonksiyonel bölgeyi hastalığa farklı olarak duyarlı hale getirir. Örneğin, seröz intraepithelial karsinomların öncü lezyonları fare modellerindeki infundibulumdan ve insan fallop tüpündeki ilgili fimbrial bölgeden kaynaklanır. Burada açıklanan protokol, mikrodiseksiyonun, ters transkripsiyon-nicel PCR (RT-qPCR) ve RNA dizilimi (RNAseq) gibi aşağı akış analizi için gerekli olan yeterli miktarda ve saflıkta RNA elde etmek için yeterli miktarda ve saflıkta bir şekilde alt bölümlere ayırma yöntemini detaylandırmamaktadır. Ayrıca, akış sitometrisine veya tamamen farklılaştırılmış ovidüktal hücrelerin tek hücreli RNAseq analizine uygun çoğunlukla enzimatik olmayan bir doku ayrışma yöntemidir. Açıklanan yöntemler, üreme, doğurganlık, kanser ve immünoloji alanında murine yumurta kanalını kullanarak daha fazla araştırmayı kolaylaştıracaktır.

Açıklanan ayrışma protokolü, her iki yumurta kanalının birikmesiyle fare başına 100.000-120.000 hücre sağlar. Yöntem, çok siliated hücre kenarlıklarını bozulmadan bırakacak kadar naziktir, çok siliated hücreler ve salgı hücreleri arasında bir ayrım sağlar ve sindirim yönteminin farklılaşmayı önleyecek kadar nazik olduğunu doğrular. Şekil 5'teki temsili immünofluoresans görüntüleri, %4 paraformaldehit (PFA)/ DPBS'de 3 dakika sabitlenen, %1 sığır serum a...

Watch this Scientific Journal Video about Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation at JoVE.com

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.

Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

Farklı yumurta kanalı segmentleri farklı fizyolojik fonksiyonlara sahiptir ve patolojik değişime farklı olarak duyarlıdır. Çok küçük bir fare yumurta kanalındaki farklı segmentlerin tanımlanması, doku ayrışması ile iyi ayırt edilmiş hücrelerin iyi bir veriminin üretilmesi gibi zordur. Bu videoda, fare yumurtalığının nasıl çözüleceğini, farklı segmentlerin tek tek analiz edilebilmesi için nasıl tanınacağını ve son olarak, farklılaştırılmış ayrışmış hücrelerin nispeten yüksek veriminin nasıl üretileceğini göstereceğiz.Ampullaya özgü ortamın daha iyi anlaşılması in vitro fertilizasyon tekniklerini geliştirebilir. Ayrıca, infundibulum'u diğer segmentlerle karşılaştırarak, infundibulumun kötü huylu dönüşüm eğilimini daha iyi anlayabiliriz. Tek hücreli ayrışma prosedürü stromal ve epitel hücrelerini yumurta kanalından kurtarır.Yöntemimiz ayrıca bağışıklık, düz kas ve epitel hücre katkılarını fizyolojiye ve yumurta kanalı patolojisine ayrı ayrı analiz etme fırsatları sağlar. Diseksiyon mikroskobu altında çalışmak ilk başta zor olabilir. Aletlerinizin oviduct mikrodiseksiyon için yeterli olduğundan emin olmak için rahim gibi daha büyük bir tüple pratik yapmanızı tavsiye ederim.Petri kabına yapışkanlı bir diş cilası parçası yapıştırarak ve kurumasını izin vererek başlayın. Daha sonra yemeği% 70 etanol ile sterilize edin. Yüzey artık diseksiyona hazır.Diseksiyona hazır olduğunuzda, diş balmumunu içeren Petri kabını diseksiyon mikroskobu altında soğuk platformda hareketsiz hale getirin. Hayvanın ventral yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra steril diseksiyon makası ile karın ve pelvik boşluğu açın.Dorsal bihornal uterusun yerini bulmak için gastrointestinal sistemi bir tarafa hareket ettinin. Böbreğin hemen altındaki rahim yağ yastığında zarflanmış her bir yumurtalığı ve yumurtalığı bulmak için her bir rahim boynuzu rostral olarak takip edin. Daha sonra hem yumurtalıklarla birlikte lateral oviducts hem de diseksiyon makası kullanılarak hala bağlı distal rahim boynuzu bir kısmını kesin.Her bir lateral rahim boynuzu, hala sarmal yumurtalığa ve yumurtalığa bağlı olan boynuzun yaklaşık bir ila iki santimetresi ile kesin. Dokuyu hemen iki mililitre soğuk diseksiyon ortamına batırın, ardından diseksiyon için dokuyu sabitlemek için steril 25 kalibrelik bir iğne ile rahim dokusunu diş mumumuna yapıştırın. Yumurta kanalını net bir şekilde görselleştirmek için yumurtalık yağ yastığını ve bağ dokusunu temizleyin ve parçalara ayırın.Bir ila iki damla steril% 1 toluidin mavi boya çözeltisi dağıtmak ve 30 saniye ila bir dakika boyunca kuluçkaya yatmak için bir mililitre şırınna kullanın. Soğuk DPBS ile durulayın ve ardından tüm sıvıyı çıkarın. Yumurtalığı sarmal yumurtalıktan hafifçe çekin.Tubal dokudan ödün vermeden yumurtalığı yumurtalıktan çıkarmak için geniş bağdaki bursal zarı kesin. Rahim tubal kavşağına yanal bulunan yumurta kanalının distal fimbrial ucunu bulun. Tüpü yavaşça çekin ve yumurta kanalını aşamak için yaylı mikro makasla mezosalpinkste kesin.Infundibular bölgeyi üretmek için tüpü kesin. Daha sonra ampullery bölgesini iki ve üç dönüş arasında keserek tüketime edin. Son olarak, kalan kısmı istimik bölge olan rahim tubal kavşağına kesin.Parçalanmış doku segmentlerini sıvı nitrojene hemen dondurun ve ardından RNA izolasyonu için dokuya 200 mikrolitre soğuk RNA ekstraksiyon reaktifi ve bire bir homojenizasyon boncuk karışımı ekleyin. Fimbrial bölgeden başlayarak, tüpü yaylı makasla uzunlamasına kesin ve luminal epitelleri açığa çıkarmak için kaldıraç olarak epips kullanın. Yarık açık kısımları ve kalan yumurta kanalını yaklaşık bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın.Daha sonra dokuya beş mililitre sıcak enzimatik olmayan ayrışma tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Occludin, nüklei ve asetilasyonlu tubulin için pozitif bir hücre kümesinin floresan ve faz kontrast görüntüleri burada gösterilmiştir. Kırmızı occludin, mavi çekirdekleri ve yeşil asetillenmiş tübulin anlamına geliyor.Siliated apikal kenarlık protokol boyunca bozulmadan kalır ve tek hücrelere daha fazla sindirime dayanır. Bu temsili görüntülerde birleştirilmiş, kırmızı, mavi, faz kontrastı ve yeşil kanallar gösterilir. Kısa bir pronaz inkübasyonundan sonra, hücrelerin çoğunluğu tektir.Propidium iyodür boyama Brightfield, kırmızı kanal PI pozitif ve birleştirmede yaklaşık% 93 canlılık gösterir. Birleştirmedeki içe, tek bir ayrışmış hücrede bozulmamış bir sınır gösterir. Bu tür hücreler aktif olarak cilia'yı dövüyor.Tüm RNA mikrovolum spektrofotometre ve biyoanalyzer tarafından verim ve kalite için değerlendirildi. Sonuçlar, bu yöntemin, aşağı akış tahlilleri için uygun verim için iki hayvandan havuzlamanın gerekli olabileceği infundibular örnekler dışında segment başına 800 ila 1.200 nanogram RNA verdiğini göstermektedir. Infundibulum için sunulan sonuçlar, toplam dört infundibular bölgeden olmak üzere iki hayvandan toplanmaktadır.Bu protokol, bir mikrovolum spektrofotometresi ve bir biyoanalyzer ile analiz edilen saf RNA'yı başarıyla elde eder. Örnekler, saf RNA nükleotid türlerinin tipik bir örneği olan 1,8 ila 2 arasında 260 ila 280 nanometre emilim oranına sahiptir. Numunelerin biyoanalizesi, aşağı akış ekspresyözü ve sıralama analizi için uygun olan yedinin üzerinde değerlendirilen RNA bütünlük sayısı ile yüksek RNA bütünlüğü gösterdi.Tubal sistemi diseksiyon platformuna yapıştırmak için uterus boynuzundan bir ila iki santimetre tutmayı unutmayın. Ek olarak, toluidin mavi boyasının kullanımı, yumurta kanalının hızlı bir şekilde geri tepmesine yardımcı olur. Ne kadar hızlı geri tepme, koruma ve en az RNA bozulması o kadar iyi olur.Bu yöntem, bireysel segment dizilimine izin vererek RNA dizilimi için uygun kalitede RNA elde etmek için yeterlidir. Hücre ayrışması, daha hassas bir segment ve hücre analizi sağlayan tek hücreli sıralama veya akış sitometrisi için uygundur. Yöntem, segment veya tek hücre düzeyindeki farklılıkları maskeleyen tüm tüp analizinin ötesine geçmesine yardımcı olacaktır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Rapid Isolation of Single Cells from Mouse and Human Teeth

Fare ve İnsan Dişlerinden Tek Hücrelerin Hızlı İzolasyonu

Mouse and human teeth represent challenging organs for quick and efficient cell isolation for single-cell transcriptomic or other applications. The dental ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...