Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R01 EY029130 (S.B.) og P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 og Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation og et ubegrænset tilskud til Institut for Oftalmologi og Visuel Videnskab ved Washington University fra Research to Prevent Blindness. J.R. modtog også en bevilling fra University of Health Sciences and Pharmacy til støtte for dette projekt.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Washington University Animal Studies Committee og overholdt ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Fremstilling af specialiserede dele og konstruktion af apparater
<ol><li>Fremstilling af specialiserede dele<ol>
<li>Sonde fabrikation. Hold en glaskapillær i en vinkel som vist i venstre panel i figur 2A. Anbring en flamme fra en cigarettænder ca. 2 cm fra den ene ende, og ho...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

Zonule er et usædvanligt ECM-system, hvor fibre er arrangeret symmetrisk og kan manipuleres identisk ved at forskyde øjenlinsen langs den optiske akse. Rummet kan også let tilgås uden cellulær forstyrrelse, hvilket gør det muligt at studere fibrene i et miljø tæt på deres oprindelige tilstand. Pull-up-teknikken udnytter denne ECM-præsentation til at manipulere de sarte fibre fra mus, et genetisk trækbart system og nøjagtigt kvantificere deres mekaniske egenskaber. Dette har gjort det muligt for os at undersø...

Et hvirveldyrs øje indeholder en levende optisk linse, der hjælper med at fokusere billeder på nethinden1. Linsen er ophængt på den optiske akse af et system af sarte, radialt orienterede fibre, som illustreret i figur 1A. I den ene ende fastgøres fibrene til linseækvator og i den anden til overfladen af ciliarylegemet. Deres længder spænder over afstande fra 150 μm hos mus til 1 mm hos mennesker. Samlet set er disse fibre kendt som zonule af Zinn2, ciliary zonule eller simpelthen zonule. Okulært traume, sygdom og visse genetiske lidelser kan påvirke integriteten af de zoneulære fibre3, hvilket resulterer i deres eventuelle fiasko og ledsagende tab af syn. I mus har fibrene en kerne, der hovedsagelig består af proteinet fibrillin-2, omgivet af en kappe rig på fibrillin-14. Selvom zonefibre er unikke for øjet, har de mange ligheder med elastinbaserede ECM-fibre, der findes andre steder i kroppen. Sidstnævnte er dækket af en fibrillin-1 mantel5 og har lignende dimensioner som zoneulære fibre6. Andre proteiner, såsom latent transformerende vækstfaktor β(LTBP'er) og mikrofibril-associeret glycoprotein-1 (MAGP-1), findes i forbindelse med begge typer fibre7,8,9,10,11. Det elastiske modul af zonende fibre ligger i området 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, der kan sammenlignes med elastinbaserede fibre (0,3-1,2 MPa)17. Disse arkitektoniske og mekaniske ligheder får os til at tro, at enhver indsigt i rollerne af zonule-associerede proteiner kan hjælpe med at belyse deres roller i andre ECM elastiske fibre.
Hovedformålet med at udvikle den metode, der er beskrevet her, er at få indsigt i specifikke zonebaserede proteiners rolle i udviklingen af arvelig øjensygdom. Den generelle tilgang er at sammenligne de viskoelastiske egenskaber af zoneulære fibre i vildtypemus med mus, der bærer målrettede mutationer i gener, der koder for zoneulære proteiner. Mens flere metoder tidligere er blevet brugt til at måle de elasto-mekaniske egenskaber af zoneulære fibre, blev alle designet til øjnene på meget større dyr12,13,14,15,16. Som sådanne modeller er ikke genetisk trækbare; vi søgte at udvikle en eksperimentel metode, der var bedre egnet til musens små og sarte øjne.
Den metode, vi udviklede til vurdering af musens zonefibres viskoelasticitet, er en teknik, vi kalder pull-up-analysen4,18, som opsummeres visuelt i figur 1. En detaljeret beskrivelse af pull-up-metoden og analysen af resultaterne findes nedenfor. Vi begynder med at beskrive apparatets konstruktion, herunder de tredimensionelle (3D)-printede dele, der anvendes i projektet. Dernæst beskriver vi den protokol, der bruges til at opnå og forberede øjnene til eksperimentet. Endelig giver vi trinvise instruktioner om, hvordan man får data til bestemmelse af de viskoelastiske egenskaber af zonelære fibre. I afsnittet Repræsentative resultater deler vi tidligere upublicerede data opnået med vores metode om de viskoelastiske egenskaber af zonefibre fra mus, der mangler MAGP-119, samt et kontrolsæt opnået fra aldersmatchede vildtypedyr. Endelig slutter vi med generelle bemærkninger om fordelene og begrænsningerne ved metoden og forslag til potentielle eksperimenter, der kan belyse, hvordan miljømæssige og biokemiske faktorer påvirker ECM-fibrenes viskoelastiske egenskaber.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elasticitet er afgørende for funktionen af væv som blodkar, muskler og lunger. Denne egenskab er hovedsagelig afledt af den ekstracellulære matrix (ECM), proteinnetværket, der binder celler og væv sammen. Hvordan et ECM-netværks elastiske egenskaber relaterer til dets sammensætning, og om ECM's afslapningsegenskaber spiller en fysiologisk rolle, er spørgsmål, der endnu ikke er behandlet fuldt ud. En del af udfordringen ligger i den komplekse arkitektur i de fleste ECM-systemer og vanskeligheden ved at isolere ECM-komponenter uden at gå på kompromis med deres struktur. En undtagelse er zonule, et ECM-system, der findes i hvirveldyrs øje. Zonule består af fibre hundreder til tusinder af mikrometer i længden, der spænder over det cellefrie rum mellem linsen og øjenvæggen. I denne rapport beskriver vi en mekanisk teknik, der udnytter zonulens højt organiserede struktur til at kvantificere dens viskoelastiske egenskaber og bestemme bidraget fra individuelle proteinkomponenter. Metoden involverer dissektion af et fast øje for at eksponere linsen og zonulen og anvender en pull-up-teknik, der strækker de zoneulære fibre ligeligt, mens deres spænding overvåges. Teknikken er relativt billig, men alligevel følsom nok til at detektere ændringer i viskoelastiske egenskaber af zoneulære fibre hos mus, der mangler specifikke zoneindiske proteiner eller med aldring. Selvom metoden, der præsenteres her, primært er designet til at studere okulær udvikling og sygdom, kan den også tjene som en eksperimentel model til at udforske bredere spørgsmål vedrørende de elastiske ECM's viskoelastiske egenskaber og rollen som eksterne faktorer såsom ionisk koncentration, temperatur og interaktioner med signalmolekyler.

Pull-up-teknikken, der er beskrevet her, giver en ligetil tilgang til bestemmelse af viskoelastiske egenskaber af zoneformede fibre i mus. Kort fortalt bevares museøjet først ved injektion af et fikseringsmiddel ved fysiologisk intraokulært tryk. Denne tilgang opretholder den naturlige inflation i øjet og holder fibrene korrekt forspændte (fiksering blev anset for acceptabel efter foreløbige forsøg viste, at det ikke ændrede fibrenes elasticitet eller styrke væsentligt). Bagsiden af museøjet fjernes derefter ve...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Protokollen beskriver en metode til undersøgelse af ekstracellulær matrixviskoselasticitet og dens afhængighed af proteinsammensætning eller miljøfaktorer. Det målrettede matrixsystem er musezonulen. Metodens ydeevne demonstreres ved at sammenligne den viskoelastiske opførsel af vildtype zonulære fibre med dem, der mangler mikrofibril-associeret glycoprotein-1.

Biologisk forberedelse og mekanisk teknik til bestemmelse af viskoelastiske egenskaber af zonefibre

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Betydningen af vores metode ligger i dens evne til at besvare spørgsmålet, hvad er de viskoelastiske egenskaber ved zoneulære fibre, de fibre, der suspenderer linsen inde i øjet? Den største fordel ved vores teknik er, at den kan kvantificere de viskoelastiske egenskaber af de små og sarte zonefibre fra mus med og uden målrettede genmodifikationer. Mutationer i gener, der koder for mikrofibrilproteiner, ligger til grund for flere arvelige syndromiske tilstande.Ved hjælp af vores teknik kan vi undersøge, hvordan specifikke mutationer ændrer mikrofibrillernes biomekaniske egenskaber. Til at begynde med, efter aflivning af musen, skal du fjerne øjnene ved hjælp af fine tang. Indsæt spidsen af en fikseringsnål gennem øjets væg og placer den i midten af den glasagtige humor, og pas på ikke at beskadige linsen.Overfør forsigtigt det spiddede øje til et rør fyldt med 4% paraformaldehyd og fosfatbufret saltvand. Åbn ventilen, der forbinder nålen med et fikseret reservoir placeret 25 centimeter over prøven, som opretholder et positivt tryk svarende til 15 til 20 millimeter kviksølv i øjet i fikseringsperioden, og lad prøven ordne natten over. Den næste dag skal du fjerne fikseringsnålen og vaske øjet i 10 minutter i fosfatbufret saltvand.Ved at anvende oftalmisk kirurgisk saks og et stereomikroskop, lav et snit i fuld tykkelse i øjets væg nær det optiske nervehoved. Forlæng snittet fremad mod ækvator og derefter rundt om øjets ækvatoriale omkreds, mens du omhyggeligt skåner de sarte ciliære processer og tilhørende zoneformede fibre. Udsæt objektivets bageste overflade ved at fjerne bagsiden af kloden.Fjern det dissekerede øje fra bufferopløsningen ved hjælp af tang og læg det på en tør opgave, der tørres af med hornhinden nedad. Træk forsigtigt hornhinden over overfladen af aftørringen for at tørre den. Påfør en dråbe øjeblikkelig lim på bunden af en 50 millimeter petriskål og fastgør platformen til den.Placer fadet på stereomikroskopets sceneplade, så brønden med limen er i syne. For at rumme øjet i petriskålens platformsbrønde skal du tilføje tre mikroliter instant lim. Placer det forsigtigt i brønden og juster det hurtigt, så bagsiden af linsen vender opad.Tør den udsatte side af linsen ved forsigtigt at blotte med hjørnet af en tørserviet. Til måling af den zoneulære viskoelastiske respons skal du tænde skalaen, placere petriskålen på skalaen og derefter starte skalalogningsprogrammet og kamerasoftwaren. Tænd for servomotorstyringen.Start controllerapplikationen på computeren, og indstil bevægelsesparametrene med trin på 50 mikrometer. Opret 90 graders bøjning i en kapillærstang. Skub den bøjede kapillær ind i kapillærsondeholderen, og stram fastgørelsesskruerne.Til kapillærspidsen tilsættes en lille perle af UV-hærdende lim. Flyt spidsen af kapillærsonden ved hjælp af de manuelle justeringer på manipulatoren, og placer den direkte over toppen af objektivet. Gennem frontinspektion og sidevisning ved hjælp af et mikroskopkamera skal du undersøge, at den nederste del af UV-limen ser ud til at være centreret over toppen af linsen.Mens du kigger gennem kameraet, skal du sænke sondespidsen, indtil UV-limen kommer i kontakt med linsen og dækker 1/3 til 1/2 af dens øvre overflade. Hærd limen ved hjælp af en retningsbestemt næsten synlig UV-lyskilde på 380 til 400 nanometer bølgelængde og en intensitet på ca. en milliwatt. Tilsæt PBS-opløsning til petriskålen, indtil øjet er dækket til en dybde på mindst to millimeter.Placer en cylindrisk linse foran mikroskopet og tæt på petriskålen uden at røre ved den. På samme tid skal du starte logningen i et timerprogram. Tag et billede af øjet og sonden ved hjælp af kameraet.Efter 60 sekunder begynder en 50 mikrometer forskydning. Gentag hvert 60. sekund, indtil eksperimentet er afsluttet som angivet ved brud på alle zonefibre. Gem skaleringslogføringsdataene, når en kørsel er afsluttet, og eksporter dem til et kompatibelt regnearksformat.Gem også de objektivbilleder, der er opnået under kørslen. Importer dataene til et regneark. Brug den første og den sidste skalaaflæsning til at interpolere driften i baggrundsaflæsningen over tid på grund af fordampning og derefter trække den interpolerede baggrund fra aflæsningen i hvert tidspunkt.Efter udførelse af assay og korrigering for fordampning inverteres grafen for de viskoelastiske data. Størrelsen af de øjeblikkelige og afslappede kræfter stiger med hvert trin op til ca. 1.000 sekunder og falder derefter, når de zoneulære fibre begynder at bryde, indtil 1.500 sekunders tidspunkt er nået, når alle fibre er brudt. Til denne demonstration blev det viskoelastiske respons for vildtype og MAGP-1 mangelfulde mus også sammenlignet.På det indledende tidspunkt på nul til 600 sekunder ligner graferne hinanden, hvilket tyder på, at de viskoelastiske egenskaber af de zonelære fibre ikke blev ændret signifikant. Men i MAGP-1 knockout-musen bryder fibrene for tidligt. Zonulære fiberbrudskræfter blev opnået med pull-up-metoden til MAGP-1 versus vildtypemus på en måned og et år gamle stadier.Resultaterne viste, at fibrenes styrke stiger med alderen for mus af vildtypen. Enhver utilsigtet kontakt med petriskålen under disse trin kan få øjenvæggen til at skifte i forhold til øjenlinsen, hvilket potentielt kan beskadige de zoneulære fibre. Dette pull-up-assay hjælper med at identificere proteiner, der bidrager til trækstyrken af mikrofibriller.Vi bruger disse oplysninger til at bygge mere realistiske modeller af det indre af zonefibre.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Protokoller for vurdering radiofrekvens Interaktioner med Guld Nanopartikler og biologiske systemer til ikke-invasiv Hyperthermi Cancer Therapy

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-inducerende Procedure i en<em&gt; In vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

Proksimal afdød Lårben Forberedelse til brudstyrken Test og Quantitative CT-baserede Finite Element Analysis

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Evaluering af Rattens Tunge Mekaniske og Viskoelastiske Egenskaber

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vurdering af de antikoagulerende og anti-inflammatoriske egenskaber i Endothelial celler ved hjælp af 3D cellekultur og ikke-antikoaguleret blod

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanisk Ventilation Boot Camp Curriculum

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Mekanisk Micronization af Lipoaspirates for regenerativ terapi

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Bestemmelse og styring af ekstern effekt under regelmæssig handrim kørestolfremdrift

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

En sonderingsanordning til kvantitativ måling af de mekaniske egenskaber af blødt væv under artroskopi

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...