Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 EY029130 (S.B.) en P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 en de Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), de Marfan Foundation, en een onbeperkte subsidie aan de afdeling Oogheelkunde en Visuele Wetenschappen aan de Washington University van Research to Prevent Blindness. J.R. ontving ook een beurs van de University of Health Sciences and Pharmacy ter ondersteuning van dit project.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Washington University Animal Studies Committee en hielden zich aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek.
1. Fabricage van gespecialiseerde onderdelen en constructie van apparaten
<ol><li>Fabricage van gespecialiseerde onderdelen<ol>
<li>Sonde fabricage. Houd een glazen capillair onder een hoek zoals weergegeven in het linkerdeelvenster van figuur 2A. Pl...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

De zonule is een ongewoon ECM-systeem waarbij vezels symmetrisch zijn gerangschikt en identiek kunnen worden gemanipuleerd door de ooglens langs de optische as te verplaatsen. De ruimte is ook gemakkelijk toegankelijk zonder cellulaire verstoring, waardoor de vezels kunnen worden bestudeerd in een omgeving dicht bij hun oorspronkelijke staat. De pull-up techniek maakt gebruik van deze ECM-presentatie om de delicate vezels van muizen, een genetisch handelbaar systeem, te manipuleren en hun mechanische eigenschappen nauwke...

Het oog van een gewerveld dier bevat een levende optische lens die helpt bij het scherpstellen van beelden op het netvlies1. De lens wordt opgehangen aan de optische as door een systeem van delicate, radiaal georiënteerde vezels, zoals geïllustreerd in figuur 1A. Aan het ene uiteinde hechten de vezels zich aan de evenaar van de lens en aan het andere uiteinde aan het oppervlak van het ciliaire lichaam. Hun lengtes overspannen afstanden variërend van 150 μm bij muizen tot 1 mm bij mensen. Gezamenlijk staan deze vezels bekend als de zonule van Zinn2, de ciliaire zonule of gewoon de zonule. Oculair trauma, ziekte en bepaalde genetische aandoeningen kunnen de integriteit van de zonulaire vezels3 beïnvloeden, wat resulteert in hun uiteindelijke falen en gepaard gaand verlies van gezichtsvermogen. Bij muizen hebben de vezels een kern die voornamelijk bestaat uit het eiwit fibrilline-2, omgeven door een mantel rijk aan fibrilline-14. Hoewel zonulaire vezels uniek zijn voor het oog, vertonen ze veel overeenkomsten met op elastine gebaseerde ECM-vezels die elders in het lichaam worden aangetroffen. De laatste zijn bedekt met een fibrilline-1 mantel5 en hebben vergelijkbare afmetingen als zonulaire vezels6. Andere eiwitten, zoals latent-transformerende groeifactor β-bindende eiwitten (LTBPs) en microfibril-geassocieerd glycoproteïne-1 (MOP-1), worden gevonden in combinatie met beide soorten vezels7,8,9,10,11. De elastische modulus van zonulaire vezels ligt in het bereik van 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, vergelijkbaar met die van op elastine gebaseerde vezels (0,3-1,2 MPa)17. Deze architecturale en mechanische overeenkomsten doen ons geloven dat elk inzicht in de rollen van zonulus-geassocieerde eiwitten kan helpen hun rol in andere ECM-elastische vezels op te helderen.
Het belangrijkste doel van het ontwikkelen van de hier beschreven methode is om inzicht te krijgen in de rol van specifieke zonulaire eiwitten in de progressie van erfelijke oogziekten. De algemene benadering is om de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels in wild-type muizen te vergelijken met die van muizen met gerichte mutaties in genen die coderen voor zonulaire eiwitten. Hoewel verschillende methoden eerder zijn gebruikt om de elasto-mechanische eigenschappen van zonulaire vezels te meten, zijn ze allemaal ontworpen voor de ogen van veel grotere dieren12,13,14,15,16. Als zodanig zijn modellen niet genetisch handelbaar; we probeerden een experimentele methode te ontwikkelen die beter geschikt was voor de kleine en delicate ogen van muizen.
De methode die we hebben ontwikkeld voor het beoordelen van de visco-elasticiteit van zoneulaire vezels bij muizen is een techniek die we de pull-up assay4,18 noemen, die visueel wordt samengevat in figuur 1. Hieronder vindt u een gedetailleerde beschrijving van de pull-upmethode en de analyse van de resultaten. We beginnen met het beschrijven van de constructie van het apparaat, inclusief de driedimensionale (3D) geprinte onderdelen die in het project worden gebruikt. Vervolgens beschrijven we het protocol dat wordt gebruikt voor het verkrijgen en voorbereiden van de ogen voor het experiment. Ten slotte geven we stapsgewijze instructies over het verkrijgen van gegevens voor de bepaling van de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels. In de sectie Representatieve resultaten delen we eerder niet-gepubliceerde gegevens die zijn verkregen met onze methode over de visco-elastische eigenschappen van zoneuze vezels van muizen zonder MOP-119, evenals een controleset die is verkregen van leeftijdsgematchte wilde dieren. Ten slotte sluiten we af met algemene opmerkingen over de voordelen en beperkingen van de methode en suggesties voor mogelijke experimenten die kunnen verduidelijken hoe omgevings- en biochemische factoren de visco-elastische eigenschappen van ECM-vezels beïnvloeden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elasticiteit is essentieel voor de functie van weefsels zoals bloedvaten, spieren en longen. Deze eigenschap is grotendeels afgeleid van de extracellulaire matrix (ECM), het eiwitnetwerk dat cellen en weefsels aan elkaar bindt. Hoe de elastische eigenschappen van een ECM-netwerk zich verhouden tot de samenstelling ervan, en of de relaxatie-eigenschappen van de ECM een fysiologische rol spelen, zijn vragen die nog volledig moeten worden aangepakt. Een deel van de uitdaging ligt in de complexe architectuur van de meeste ECM-systemen en de moeilijkheid om ECM-componenten te isoleren zonder hun structuur in gevaar te brengen. Een uitzondering is de zonule, een ECM-systeem dat voorkomt in het oog van gewervelde dieren. De zone bestaat uit vezels van honderden tot duizenden micrometers die de celvrije ruimte tussen de lens en de oogwand overspannen. In dit rapport beschrijven we een mechanische techniek die gebruik maakt van de sterk georganiseerde structuur van de zone om de visco-elastische eigenschappen te kwantificeren en de bijdrage van individuele eiwitcomponenten te bepalen. De methode omvat dissectie van een vast oog om de lens en de zonulus te belichten en maakt gebruik van een pull-up-techniek die de zonulaire vezels gelijk rekt terwijl hun spanning wordt bewaakt. De techniek is relatief goedkoop maar gevoelig genoeg om veranderingen in visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels te detecteren bij muizen zonder specifieke zonulaire eiwitten of met veroudering. Hoewel de hier gepresenteerde methode voornamelijk is ontworpen voor het bestuderen van oculaire ontwikkeling en ziekte, zou het ook kunnen dienen als een experimenteel model voor het verkennen van bredere vragen met betrekking tot de visco-elastische eigenschappen van elastische ECM's en de rol van externe factoren zoals ionische concentratie, temperatuur en interacties met signaalmoleculen.

De hier beschreven pull-up techniek biedt een eenvoudige benadering voor het bepalen van visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels bij muizen. Kortom, het muizenoog wordt eerst bewaard door injectie van een fixatief bij fysiologische intraoculaire druk. Deze aanpak handhaaft de natuurlijke inflatie van het oog en houdt de vezels goed voorgespannen (fixatie werd aanvaardbaar geacht nadat voorlopige experimenten aantoonden dat het de elasticiteit of sterkte van de vezels niet significant veranderde). De achterkan...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Het protocol beschrijft een methode voor de studie van extracellulaire matrix visco-elasticiteit en de afhankelijkheid ervan van eiwitsamenstelling of omgevingsfactoren. Het beoogde matrixsysteem is de muiszone. De prestaties van de methode worden aangetoond door het visco-elastische gedrag van wild-type zonulaire vezels te vergelijken met die zonder microfibril-geassocieerd glycoproteïne-1.

Biologische voorbereiding en mechanische techniek voor het bepalen van visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Het belang van onze methode ligt in het vermogen om de vraag te beantwoorden, wat zijn de visco-elastische eigenschappen van zonulaire vezels, de vezels die de lens in het oog ophangen? Het grote voordeel van onze techniek is dat het de visco-elastische eigenschappen van de kleine en delicate zonulaire vezels van muizen met en zonder gerichte genmodificaties kan kwantificeren. Mutaties in genen die coderen voor microfibrileiwitten liggen ten grondslag aan verschillende erfelijke syndromale aandoeningen.Met behulp van onze techniek kunnen we onderzoeken hoe specifieke mutaties de biomechanische eigenschappen van de microfibrillen veranderen. Om te beginnen, na het euthanaseren van de muis, verwijder de ogen met een fijne tang. Steek de punt van een fixatiefaald door de wand van het oog en plaats deze in het midden van de glasvochthumor, zorg ervoor dat de lens niet wordt beschadigd.Breng het gespietste oog voorzichtig over naar een buis gevuld met 4% paraformaldehyde en fosfaat gebufferde zoutoplossing. Open de klep die de naald verbindt met een gefixeerd reservoir op 25 centimeter boven het monster dat een positieve druk behoudt die overeenkomt met 15 tot 20 millimeter kwik in het oog tijdens de fixatieperiode en laat het monster 's nachts fixeren. Verwijder de volgende dag de fixatiefaald en was het oog gedurende 10 minuten in fosfaat gebufferde zoutoplossing.Door gebruik te maken van een oogheelkundige chirurgische schaar en een stereomicroscoop, maak een incisie van volledige dikte in de oogwand in de buurt van de oogzenuwkop. Strek de snede naar voren naar de evenaar en vervolgens rond de equatoriale omtrek van het oog terwijl u zorgvuldig de delicate ciliaire processen en bijbehorende zonulaire vezels spaart. Belicht het achterste oppervlak van de lens door de achterkant van de wereldbol te verwijderen.Verwijder het ontleedde oog met een tang uit de bufferoplossing en leg het op een droogtaakdoekje met het hoornvlies naar beneden gericht. Sleep het hoornvlies voorzichtig over het oppervlak van het doekje om het te drogen. Breng een druppel instantlijm aan op de bodem van een petrischaaltje van 50 millimeter en bevestig het platform eraan.Leg de schaal op de podiumplaat van de stereomicroscoop zodat de put met de lijm in zicht is. Om het oog in de plateauputten van de petrischaal te plaatsen, voegt u drie microliter instantlijm toe. Plaats hem voorzichtig in de put en stel hem snel zo af dat de achterkant van de lens naar boven gericht is.Droog de blootgestelde kant van de lens door voorzichtig te deppen met de hoek van een droog doekje. Voor het meten van de zonulaire visco-elastische respons zet u de weegschaal aan, plaatst u de petrischaal op de schaal en start u vervolgens het schaalregistratieprogramma en de camerasoftware. Schakel de servomotorcontroller in.Start de controllertoepassing op de computer en stel de bewegingsparameters in met stappen van 50 micrometer. Maak 90 graden buiging in een capillaire staaf. Schuif het gebogen capillair in de capillaire sondehouder en draai de bevestigingsschroeven vast.Voeg aan de capillaire punt een kleine kraal uv-uithardende lijm toe. Beweeg de punt van de capillaire sonde met behulp van de handmatige aanpassingen op de manipulator en plaats deze direct over de bovenkant van de lens. Door visuele inspectie aan de voorkant en het zijaanzicht met behulp van een microscoopcamera, onderzoekt u of het onderste deel van de UV-lijm gecentreerd over de bovenkant van de lens lijkt.Terwijl u door de camera kijkt, laat u de sondepunt zakken totdat de UV-lijm contact maakt met de lens en 1/3 tot 1/2 van het bovenoppervlak bedekt. Hard de lijm uit met behulp van een directionele bijna zichtbare UV-lichtbron van 380 tot 400 nanometer golflengte en een intensiteit van ongeveer een milliwatt. Voeg PBS-oplossing toe aan de petrischaal totdat het oog bedekt is tot een diepte van ten minste twee millimeter.Plaats een cilindrische lens voor de microscoop en dicht bij de petrischaal zonder deze aan te raken. Start tegelijkertijd het inloggen in een timerprogramma. Maak een foto van het oog en de sonde met behulp van de camera.Begin na 60 seconden met een verplaatsing van 50 micrometer. Herhaal elke 60 seconden totdat het experiment is voltooid, zoals aangegeven door het breken van alle zoneuze vezels. Sla de logboekgegevens op na voltooiing van een run en exporteer deze naar een compatibele spreadsheetindeling.Sla ook de lensfoto's op die tijdens de run zijn verkregen. Importeer de gegevens in een spreadsheet. Interpoleer met behulp van de eerste en de laatste schaalaflezing de afwijking in de achtergrondlezing in de loop van de tijd als gevolg van verdamping en trek vervolgens de geïnterpoleerde achtergrond af van de meting in elk tijdstip.Na het uitvoeren van de test en het corrigeren voor verdamping, wordt de grafiek van de visco-elastische gegevens omgekeerd. De grootte van de ogenblikkelijke en ontspannen krachten neemt toe met elke stap tot ongeveer 1.000 seconden en daalt dan als de zonulaire vezels beginnen te breken totdat het tijdspunt van 1.500 seconden is bereikt wanneer alle vezels zijn gebroken. Voor deze demonstratie werd ook de visco-elastische respons voor wilde type en MOP-1 deficiënte muizen vergeleken.Op de begintijd van nul tot 600 seconden lijken de grafieken op elkaar, wat suggereert dat de visco-elastische eigenschappen van de zonulaire vezels niet significant waren veranderd. In de MOP-1 knock-out muis breken de vezels echter voortijdig. Zonulaire vezelbreekkrachten werden verkregen met de pull-up methode voor MOP-1 versus wild type muizen op een maand en een jaar oud stadium.De resultaten gaven aan dat de sterkte van de vezels toeneemt met de leeftijd voor wilde muizen. Elk accidenteel contact met de petrischaal tijdens deze stappen kan ertoe leiden dat de oogwand verschuift ten opzichte van de ooglens, waardoor de zonulaire vezels mogelijk worden beschadigd. Deze pull-up assay helpt bij het identificeren van eiwitten die bijdragen aan de treksterkte van microfibrillen.We zullen deze informatie gebruiken om meer realistische modellen van het interieur van zonulaire vezels te bouwen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoom-inducerende Procedure in een<em&gt; In Vivo</em&gt; Rat Model en Whole-mount Retina Voorbereiding

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

Proximale Cadaveric Femur Voorbereiding voor Fracture Sterkte Testen en Kwantitatieve CT-gebaseerde Finite Element Analysis

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluatie van de Mechanische en Viscoelastische Eigenschappen van de Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Beoordeling van de anticoagulatie en anti-inflammatoire eigenschappen van endotheliale cellen met behulp van 3D-celkweek en niet-vertonen volbloed

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mechanische ventilatie Boot Camp Curriculum

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Mechanische micronisatie voor Lipoaspirates voor regeneratieve therapie

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Het bepalen en controleren van extern vermogen tijdens regelmatige handrim rolstoelaandrijving

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

Een indringend apparaat voor het kwantitatief meten van de mechanische eigenschappen van zachte weefsels tijdens artroscopie

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...