Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
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Ce travail a été soutenu par NIH R01 EY029130 (S.B.) et P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 et la Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), la Fondation Marfan, et une subvention sans restriction au Département d’ophtalmologie et de sciences visuelles de l’Université de Washington de Research to Prevent Blindness. J.R. a également reçu une subvention de l’Université des sciences de la santé et de la pharmacie à l’appui de ce projet.

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité d’études animales de l’Université de Washington et ont adhéré à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.
1. Fabrication de pièces spécialisées et construction d’appareils
<ol><li>Fabrication de pièces spécialisées<ol>
<li>Fabrication de sondes. Tenez un capillaire en verre à un angle comme illustré dans le panneau de g...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

La zonule est un système ECM inhabituel où les fibres sont disposées symétriquement et peuvent être manipulées à l’identique en déplaçant la lentille oculaire le long de l’axe optique. L’espace est également facilement accessible sans perturbation cellulaire, ce qui permet d’étudier les fibres dans un environnement proche de leur état natif. La technique pull-up tire parti de cette présentation ECM pour manipuler les fibres délicates de souris, un système génétiquement traitable, et quantifier av...

L’œil d’un vertébré contient une lentille optique vivante qui aide à focaliser les images sur la rétine1. La lentille est suspendue sur l’axe optique par un système de fibres délicates orientées radialement, comme illustré à la figure 1A. À une extrémité, les fibres se fixent à l’équateur de la lentille et, à l’autre, à la surface du corps ciliaire. Leurs longueurs s’étendent sur des distances allant de 150 μm chez la souris à 1 mm chez l’homme. Collectivement, ces fibres sont connues sous le nom de zonule de Zinn2, la zonule ciliaire, ou simplement la zonule. Les traumatismes oculaires, les maladies et certains troubles génétiques peuvent affecter l’intégrité des fibres zonulaires3, entraînant leur échec éventuel et une perte de vision qui l’accompagne. Chez la souris, les fibres ont un noyau composé principalement de la protéine fibrilline-2, entourée d’un manteau riche en fibrilline-14. Bien que les fibres zonulaires soient uniques à l’œil, elles présentent de nombreuses similitudes avec les fibres ECM à base d’élastine trouvées ailleurs dans le corps. Ces dernières sont recouvertes d’un manteau de fibrilline-15 et ont des dimensions similaires à celles des fibres zonulaires6. D’autres protéines, telles que les protéines de liaison β (LTBPs) et la glycoprotéine 1 associée aux microfibrilles (MAGP-1), se trouvent en association avec les deux types de fibres7,8,9,10,11. Le module élastique des fibres zonulaires est compris entre 0,18 et 1,50 MPa12,13,14,15,16, comparable à celui des fibres à base d’élastine (0,3-1,2 MPa)17. Ces similitudes architecturales et mécaniques nous amènent à croire que tout aperçu des rôles des protéines associées aux zonules peut aider à élucider leurs rôles dans d’autres fibres élastiques ECM.
L’objectif principal du développement de la méthode décrite ici est de mieux comprendre le rôle de protéines zonulaires spécifiques dans la progression de la maladie oculaire héréditaire. L’approche générale consiste à comparer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez les souris de type sauvage avec celles des souris porteuses de mutations ciblées dans les gènes codant pour les protéines zonulaires. Bien que plusieurs méthodes aient été utilisées précédemment pour mesurer les propriétés élasto-mécaniques des fibres zonulaires, toutes ont été conçues pour les yeux d’animaux beaucoup plus grands12,13,14,15,16. En tant que tels modèles, ils ne sont pas génétiquement traitables; nous avons cherché à développer une méthode expérimentale mieux adaptée aux petits et délicats yeux des souris.
La méthode que nous avons développée pour évaluer la viscoélasticité des fibres zonulaires de souris est une technique que nous appelons le test pull-up4,18, qui est résumé visuellement dans la figure 1. Une description détaillée de la méthode pull-up et de l’analyse des résultats est fournie ci-dessous. Nous commençons par décrire la construction de l’appareil, y compris les pièces imprimées en trois dimensions (3D) utilisées dans le projet. Ensuite, nous détaillons le protocole utilisé pour obtenir et préparer les yeux pour l’expérience. Enfin, nous fournissons des instructions étape par étape sur la façon d’obtenir des données pour la détermination des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires. Dans la section Résultats représentatifs, nous partageons des données inédites obtenues avec notre méthode sur les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires de souris dépourvues de MAGP-119 ainsi qu’un ensemble de contrôle obtenu à partir d’animaux de type sauvage appariés selon l’âge. Enfin, nous concluons par des remarques générales sur les avantages et les limites de la méthode, et des suggestions d’expériences potentielles qui pourraient élucider comment les facteurs environnementaux et biochimiques affectent les propriétés viscoélastiques des fibres ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

L’élasticité est essentielle à la fonction des tissus tels que les vaisseaux sanguins, les muscles et les poumons. Cette propriété est dérivée principalement de la matrice extracellulaire (ECM), le maillage protéique qui lie les cellules et les tissus ensemble. Comment les propriétés élastiques d’un réseau ECM sont liées à sa composition, et si les propriétés de relaxation de l’ECM jouent un rôle physiologique, sont des questions qui n’ont pas encore été pleinement abordées. Une partie du défi réside dans l’architecture complexe de la plupart des systèmes ECM et la difficulté d’isoler les composants ECM sans compromettre leur structure. Une exception est la zonule, un système ECM trouvé dans l’œil des vertébrés. La zonule comprend des fibres de centaines à des milliers de micromètres de longueur qui couvrent l’espace sans cellule entre la lentille et la paroi oculaire. Dans ce rapport, nous décrivons une technique mécanique qui tire parti de la structure hautement organisée de la zonule pour quantifier ses propriétés viscoélastiques et déterminer la contribution des composants protéiques individuels. La méthode implique la dissection d’un œil fixe pour exposer la lentille et la zonule et utilise une technique de traction qui étire les fibres zonulaires de manière égale pendant que leur tension est surveillée. La technique est relativement peu coûteuse mais suffisamment sensible pour détecter des altérations des propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez des souris dépourvues de protéines zonulaires spécifiques ou avec le vieillissement. Bien que la méthode présentée ici soit conçue principalement pour étudier le développement oculaire et la maladie, elle pourrait également servir de modèle expérimental pour explorer des questions plus larges concernant les propriétés viscoélastiques des ECM élastiques et le rôle de facteurs externes tels que la concentration ionique, la température et les interactions avec les molécules de signalisation.

La technique de traction décrite ici fournit une approche simple pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires chez la souris. En bref, l’œil de souris est d’abord préservé par injection d’un fixateur à la pression intraoculaire physiologique. Cette approche maintient le gonflage naturel de l’œil et maintient les fibres correctement pré-tendues (la fixation a été jugée acceptable après que des expériences préliminaires ont démontré qu’elle ne modifiait pas l’élastici...

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Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Le protocole décrit une méthode pour l’étude de la viscoélasticité de la matrice extracellulaire et de sa dépendance à la composition protéique ou aux facteurs environnementaux. Le système matriciel ciblé est la zonule de souris. La performance de la méthode est démontrée en comparant le comportement viscoélastique des fibres zonulaires de type sauvage avec celles dépourvues de glycoprotéine-1 associée aux microfibrilles.

Préparation biologique et technique mécanique pour déterminer les propriétés viscoélastiques des fibres zozonulaires

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

L’importance de notre méthode réside dans sa capacité à répondre à la question, quelles sont les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires, les fibres qui suspendent le cristallin à l’intérieur de l’œil? Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet de quantifier les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires petites et délicates de souris avec et sans modifications génétiques ciblées. Des mutations dans les gènes codant pour des protéines de microfibrilles sous-tendent plusieurs conditions syndromiques héréditaires.En utilisant notre technique, nous pouvons étudier comment des mutations spécifiques modifient les propriétés biomécaniques des microfibrilles. Pour commencer, après l’euthanasie de la souris, retirez les yeux à l’aide de pinces fines. Insérez la pointe d’une aiguille de fixation à travers la paroi de l’œil et positionnez-la au centre de l’humeur vitrée, en prenant soin de ne pas endommager la lentille.Transférer soigneusement l’œil empalé dans un tube rempli de 4% de paraformaldéhyde et de solution saline tamponnée au phosphate. Ouvrez la vanne reliant l’aiguille à un réservoir fixé situé à 25 centimètres au-dessus de l’échantillon qui maintient une pression positive équivalente à 15 à 20 millimètres de mercure dans l’œil pendant la période de fixation et laissez l’échantillon se fixer pendant la nuit. Le lendemain, retirez l’aiguille de fixation et lavez l’œil pendant 10 minutes dans une solution saline tamponnée au phosphate.En utilisant des ciseaux chirurgicaux ophtalmiques et un stéréomicroscope, faites une incision de pleine épaisseur dans la paroi de l’œil près de la tête du nerf optique. Étendez la coupe vers l’avant vers l’équateur, puis autour de la circonférence équatoriale de l’œil tout en épargnant soigneusement les processus ciliaires délicats et les fibres zonulaires associées. Exposez la surface postérieure de la lentille en retirant l’arrière du globe.Retirez l’œil disséqué de la solution tampon à l’aide d’une pince et placez-le sur une lingette sèche avec la cornée tournée vers le bas. Faites glisser doucement la cornée sur la surface de la lingette pour la sécher. Appliquez une goutte de colle instantanée au fond d’une boîte de Petri de 50 millimètres et fixez-y la plate-forme.Placez le plat sur la plaque de scène du stéréomicroscope afin que le puits avec la colle soit en vue. Pour accueillir l’œil dans les puits de la plate-forme de la boîte de Pétri, ajoutez trois microlitres de colle instantanée. Placez-le soigneusement dans le puits et ajustez-le rapidement de sorte que l’arrière de la lentille soit orienté vers le haut.Séchez le côté exposé de la lentille en épongeant doucement avec le coin d’une lingette sèche. Pour mesurer la réponse viscoélastique zozonulaire, allumez la balance, placez la boîte de Petri sur la balance, puis démarrez le programme d’enregistrement de la balance et le logiciel de la caméra. Allumez le contrôleur du servomoteur.Démarrez l’application du contrôleur sur l’ordinateur et définissez les paramètres de mouvement par incréments de 50 micromètres. Créez une courbure de 90 degrés dans une tige capillaire. Glissez le capillaire plié dans le porte-sonde capillaire et serrez les vis de fixation.À la pointe capillaire, ajoutez une petite perle de colle de durcissement UV. Déplacez l’extrémité de la sonde capillaire à l’aide des réglages manuels du manipulateur et placez-la directement sur le dessus de l’objectif. Grâce à l’inspection visuelle frontale et à la vue latérale à l’aide d’une caméra de microscope, examinez que la partie inférieure de la colle UV semble centrée sur le dessus de l’objectif.En regardant à travers l’appareil photo, abaissez la pointe de la sonde jusqu’à ce que la colle UV entre en contact avec l’objectif et couvre 1/3 à 1/2 de sa surface supérieure. Durcissez la colle à l’aide d’une source de lumière UV directionnelle presque visible de 380 à 400 nanomètres de longueur d’onde et d’une intensité d’environ un milliwatt. Ajouter la solution de PBS à la boîte de Petri jusqu’à ce que l’œil soit recouvert à une profondeur d’au moins deux millimètres.Placez une lentille cylindrique devant le microscope et de près de la boîte de Pétri sans la toucher. Dans le même temps, démarrez la journalisation dans un programme de minuterie. Prenez une photo de l’œil et de la sonde à l’aide de l’appareil photo.Après 60 secondes, commencez un déplacement de 50 micromètres. Répétez toutes les 60 secondes jusqu’à ce que l’expérience soit terminée comme indiqué par la rupture de toutes les fibres zonulaires. Enregistrez les données de journalisation de l’échelle à la fin d’une exécution et exportez-les dans un format de feuille de calcul compatible.Enregistrez également les images de l’objectif obtenues pendant la course. Importez les données dans une feuille de calcul. À l’aide de la première et de la dernière échelle, interpolez la dérive de la lecture d’arrière-plan au fil du temps due à l’évaporation, puis soustrayez l’arrière-plan interpolé de la lecture à chaque point temporel.Après avoir effectué le test et corrigé l’évaporation, le graphique des données viscoélastiques est inversé. L’ampleur des forces instantanées et détendues augmente à chaque pas jusqu’à environ 1 000 secondes, puis diminue à mesure que les fibres zonulaires commencent à se briser jusqu’à ce que le point de temps de 1 500 secondes soit atteint lorsque toutes les fibres sont brisées. Pour cette démonstration, la réponse viscoélastique pour les souris de type sauvage et les souris déficientes en MAGP-1 a également été comparée.Au temps initial de zéro à 600 secondes, les graphiques se ressemblent suggérant que les propriétés viscoélastiques des fibres zonulaires n’ont pas été modifiées de manière significative. Cependant, chez la souris knockout MAGP-1, les fibres se cassent prématurément. Les forces de rupture des fibres zonulaires ont été obtenues avec la méthode pull-up pour MAGP-1 par rapport aux souris de type sauvage à un mois et un an.Les résultats ont indiqué que la force des fibres augmente avec l’âge pour les souris de type sauvage. Tout contact accidentel avec la boîte de Petri au cours de ces étapes peut provoquer un déplacement de la paroi oculaire par rapport au cristallin, endommageant potentiellement les fibres zonulaires. Ce test de traction aide à identifier les protéines qui contribuent à la résistance à la traction des microfibrilles.Nous utiliserons ces informations pour construire des modèles plus réalistes de l’intérieur des fibres zonulaires.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Myo-mécanique Analyse des muscles squelettiques isolés

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Recherche

Médecine

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

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Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

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In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

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Évaluation in vivo des propriétés mécaniques et viscoélastiques de la langue de rat

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Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Évaluation des propriétés anticoagulantes et anti-inflammatoires de cellules endothéliales à l’aide de la Culture cellulaire 3D et sang total Non-anticoagulant

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Ventilation mécanique Boot Camp Curriculum

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Micronisation mécanique de Lipoaspirates pour la thérapie régénérative

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Détermination et contrôle de la puissance externe pendant la propulsion régulière en fauteuil roulant handrim

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

Un dispositif de sondage pour mesurer quantitativement les propriétés mécaniques des tissus mous pendant l’arthroscopie

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...