Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
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Diese Arbeit wurde von NIH R01 EY029130 (S.B.) und P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 und der Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), der Marfan Foundation und einem uneingeschränkten Zuschuss an das Department of Ophthalmology and Visual Sciences der Washington University von Research to Prevent Blindness unterstützt. J.R. erhielt auch ein Stipendium von der Universität für Gesundheitswissenschaften und Pharmazie zur Unterstützung dieses Projekts.

Alle Tierversuche wurden vom Animal Studies Committee der Washington University genehmigt und hielten sich an die ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Herstellung von Spezialteilen und Konstruktion von Apparaten
<ol><li>Herstellung von Spezialteilen<ol>
<li>Sondenfertigung. Halten Sie eine Glaskapillare in einem Winkel, wie in der linken Abbildung 2A dargestellt. Legen Sie eine Flamme aus einem Zigare...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

Die Zonule ist ein ungewöhnliches ECM-System, bei dem die Fasern symmetrisch angeordnet sind und identisch manipuliert werden können, indem die Augenlinse entlang der optischen Achse verschoben wird. Der Raum kann auch ohne zelluläre Störung leicht zugänglich gemacht werden, so dass die Fasern in einer Umgebung in der Nähe ihres ursprünglichen Zustands untersucht werden können. Die Pull-up-Technik nutzt diese ECM-Präsentation, um die empfindlichen Fasern von Mäusen, einem genetisch handhabbaren System, zu manip...

Das Auge eines Wirbeltiers enthält eine lebende optische Linse, die hilft, Bilder auf die Netzhaut zu fokussieren1. Die Linse wird an der optischen Achse durch ein System empfindlicher, radial orientierter Fasern aufgehängt, wie in Abbildung 1A dargestellt. An einem Ende heften sich die Fasern an den Linsenäquator und am anderen Ende an die Oberfläche des Ziliarkörpers. Ihre Längen reichen von 150 μm bei Mäusen bis zu 1 mm beim Menschen. Zusammen sind diese Fasern als die Zonule von Zinn2, die Ziliarzonule oder einfach die Zonule bekannt. Augentraumata, Krankheiten und bestimmte genetische Störungen können die Integrität der zonulären Fasern3 beeinträchtigen, was zu ihrem eventuellen Versagen und dem damit einhergehenden Verlust des Sehvermögens führt. Bei Mäusen haben die Fasern einen Kern, der hauptsächlich aus dem Protein Fibrillin-2 besteht, umgeben von einem Mantel, der reich an Fibrillin-14 ist. Obwohl zonuläre Fasern einzigartig für das Auge sind, haben sie viele Ähnlichkeiten mit Elastin-basierten ECM-Fasern, die anderswo im Körper vorkommen. Letztere sind von einem Fibrillin-1-Mantel5 bedeckt und haben ähnliche Abmessungen wie zonuläre Fasern6. Andere Proteine, wie latent transformierende Wachstumsfaktor-β-bindende Proteine (LTBPs) und Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 (MAGP-1), werden in Verbindung mit beiden Fasertypen gefunden7,8,9,10,11. Der Elastizitätsmodul von Zonularfasern liegt im Bereich von 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, vergleichbar mit dem von Elastin-basierten Fasern (0,3-1,2 MPa)17. Diese architektonischen und mechanischen Ähnlichkeiten führen uns zu der Annahme, dass jeder Einblick in die Rolle von zonuli-assoziierten Proteinen dazu beitragen kann, ihre Rolle in anderen EKVM-Fasern aufzuklären.
Der Hauptzweck der Entwicklung der hier beschriebenen Methode besteht darin, Einblicke in die Rolle spezifischer zonulärer Proteine beim Fortschreiten der erblichen Augenerkrankung zu gewinnen. Der allgemeine Ansatz besteht darin, die viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Wildtypmäusen mit denen von Mäusen zu vergleichen, die gezielte Mutationen in Genen tragen, die für zonuläre Proteine kodieren. Während zuvor mehrere Methoden verwendet wurden, um die elasto-mechanischen Eigenschaften von zonulären Fasern zu messen, wurden alle für die Augen von viel größeren Tieren entwickelt12,13,14,15,16. Da solche Modelle genetisch nicht behandelbar sind; Wir wollten eine experimentelle Methode entwickeln, die besser für die kleinen und empfindlichen Augen von Mäusen geeignet ist.
Die von uns entwickelte Methode zur Beurteilung der Viskoelastizität von Mauszonulafasern ist eine Technik, die wir als Pull-up-Assay4,18 bezeichnen und die in Abbildung 1 visuell zusammengefasst ist. Eine detaillierte Beschreibung der Pull-up-Methode und der Analyse der Ergebnisse finden Sie unten. Wir beginnen mit der Beschreibung der Konstruktion der Apparatur, einschließlich der dreidimensionalen (3D)gedruckten Teile, die im Projekt verwendet werden. Als nächstes beschreiben wir das Protokoll, das zum Erhalten und Vorbereiten der Augen für das Experiment verwendet wird. Schließlich geben wir Schritt-für-Schritt-Anleitungen, wie Sie Daten für die Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern erhalten. Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse teilen wir bisher unveröffentlichte Daten, die mit unserer Methode zu den viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern von Mäusen ohne MAGP-119 gewonnen wurden, sowie einen Kontrollsatz, der von altersangepassten Wildtyptieren erhalten wurde. Schließlich schließen wir mit allgemeinen Bemerkungen zu den Vorteilen und Einschränkungen der Methode und Vorschlägen für mögliche Experimente, die aufklären können, wie Umwelt- und biochemische Faktoren die viskoelastischen Eigenschaften von ECM-Fasern beeinflussen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elastizität ist essentiell für die Funktion von Geweben wie Blutgefäßen, Muskeln und Lungen. Diese Eigenschaft leitet sich hauptsächlich von der extrazellulären Matrix (ECM) ab, dem Proteingeflecht, das Zellen und Gewebe miteinander verbindet. Wie sich die elastischen Eigenschaften eines ECM-Netzwerks auf seine Zusammensetzung beziehen und ob die Relaxationseigenschaften des ECM eine physiologische Rolle spielen, sind Fragen, die noch nicht vollständig geklärt sind. Ein Teil der Herausforderung liegt in der komplexen Architektur der meisten ECM-Systeme und der Schwierigkeit, ECM-Komponenten zu isolieren, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen. Eine Ausnahme ist die Zonule, ein ECM-System, das im Auge von Wirbeltieren vorkommt. Die Zonule besteht aus hunderten bis tausenden Mikrometer langen Fasern, die den zellfreien Raum zwischen Linse und Augenwand überspannen. In diesem Bericht beschreiben wir eine mechanische Technik, die die hochorganisierte Struktur der Zonule nutzt, um ihre viskoelastischen Eigenschaften zu quantifizieren und den Beitrag einzelner Proteinkomponenten zu bestimmen. Die Methode beinhaltet die Dissektion eines festen Auges, um die Linse und die Zonule freizulegen, und verwendet eine Pull-up-Technik, die die Zonularfasern gleichmäßig dehnt, während ihre Spannung überwacht wird. Die Technik ist relativ kostengünstig, aber empfindlich genug, um Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern bei Mäusen ohne spezifische zonuläre Proteine oder mit zunehmendem Alter nachzuweisen. Obwohl die hier vorgestellte Methode in erster Linie für die Untersuchung der Augenentwicklung und -erkrankung konzipiert ist, könnte sie auch als experimentelles Modell dienen, um breitere Fragen zu den viskoelastischen Eigenschaften elastischer ECMs und der Rolle externer Faktoren wie Ionenkonzentration, Temperatur und Wechselwirkungen mit Signalmolekülen zu untersuchen.

Die hier beschriebene Pull-up-Technik bietet einen einfachen Ansatz zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Mäusen. Kurz gesagt, das Mausauge wird zuerst durch Injektion eines Fixiermittels beim physiologischen Augeninnendruck konserviert. Dieser Ansatz behält die natürliche Inflation des Auges bei und hält die Fasern richtig vorgespannt (die Fixierung wurde als akzeptabel angesehen, nachdem vorläufige Experimente gezeigt hatten, dass sie die Elastizität oder Festigkeit der Fasern...

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Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der viskoelastizität der extrazellulären Matrix und ihrer Abhängigkeit von der Proteinzusammensetzung oder Umweltfaktoren. Das zielgerichtete Matrixsystem ist die Mauszonule. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird durch den Vergleich des viskoelastischen Verhaltens von Wildtyp-Zonularfasern mit denen ohne Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 demonstriert.

Biologische Präparation und mechanische Technik zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Die Bedeutung unserer Methode liegt in ihrer Fähigkeit, die Frage zu beantworten, was sind die viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern, den Fasern, die die Linse im Auge schweben? Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie die viskoelastischen Eigenschaften der kleinen und empfindlichen zonulären Fasern von Mäusen mit und ohne gezielte Genmodifikationen quantifizieren kann. Mutationen in Genen, die für Mikrofibrillenproteine kodieren, liegen mehreren vererbten syndromalen Erkrankungen zugrunde.Mit unserer Technik können wir untersuchen, wie spezifische Mutationen die biomechanischen Eigenschaften der Mikrofibrillen verändern. Um zu beginnen, nach dem Einschläfern der Maus, entfernen Sie die Augen mit einer feinen Pinzette. Führen Sie die Spitze einer Fixationsnadel durch die Augenwand und positionieren Sie sie in der Mitte des Glaskörpers, wobei sie darauf achtet, die Linse nicht zu beschädigen.Das aufgespießte Auge vorsichtig in ein Röhrchen geben, das mit 4% Paraformaldehyd und phosphatgepufferter Kochsalzlösung gefüllt ist. Öffnen Sie das Ventil, das die Nadel mit einem fixierten Reservoir verbindet, das sich 25 Zentimeter über der Probe befindet und während der Fixierungszeit einen Überdruck von 15 bis 20 Millimeter Quecksilber im Auge aufrechterhält, und lassen Sie die Probe über Nacht fixieren. Am nächsten Tag entfernen Sie die Fixationsnadel und waschen Sie das Auge für 10 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung.Machen Sie mit einer ophthalmologischen chirurgischen Schere und einem Stereomikroskop einen vollständig dicken Schnitt in der Augenwand in der Nähe des Sehnervenkopfes. Verlängern Sie den Schnitt nach vorne in Richtung Äquator und dann um den Äquatorialumfang des Auges, während Sie die empfindlichen Ziliarfortsätze und die damit verbundenen zonulären Fasern vorsichtig schonen. Belichten Sie die hintere Oberfläche der Linse, indem Sie die Rückseite des Globus entfernen.Entfernen Sie das sezierte Auge mit einer Pinzette aus der Pufferlösung und legen Sie es mit der Hornhaut nach unten auf ein trockenes Aufgabenwischen. Ziehen Sie die Hornhaut vorsichtig über die Oberfläche des Tuchs, um sie zu trocknen. Tragen Sie einen Tropfen Sofortkleber auf den Boden einer 50-Millimeter-Petrischale auf und befestigen Sie die Plattform daran.Legen Sie die Schüssel auf die Bühnenplatte des Stereomikroskops, so dass der Brunnen mit dem Kleber in Sicht ist. Um das Auge in den Plattformschächten der Petrischale unterzubringen, fügen Sie drei Mikroliter Instantkleber hinzu. Legen Sie es vorsichtig in den Brunnen und stellen Sie es schnell so ein, dass die Rückseite des Objektivs nach oben zeigt.Trocknen Sie die belichtete Seite der Linse, indem Sie sie vorsichtig mit der Ecke eines Trockentuchs abtupfen. Um die zonuläre viskoelastische Reaktion zu messen, schalten Sie die Skala ein, legen Sie die Petrischale auf die Waage und starten Sie dann das Skalenprotokollierungsprogramm und die Kamerasoftware. Schalten Sie den Servomotorregler ein.Starten Sie die Controller-Anwendung am Computer und stellen Sie die Bewegungsparameter in 50-Mikrometer-Schritten ein. Erzeugen Sie eine 90-Grad-Biegung in einem Kapillarstab. Schieben Sie die gebogene Kapillare in den Kapillarsondenhalter und ziehen Sie die Sicherungsschrauben fest.Fügen Sie zur Kapillarspitze eine kleine Perle UV-härtenden Klebstoff hinzu. Bewegen Sie die Spitze der Kapillarsonde mit den manuellen Einstellungen am Manipulator und legen Sie sie direkt über die Oberseite des Objektivs. Untersuchen Sie durch die visuelle Inspektion auf der Vorderseite und die Seitenansicht mit einer Mikroskopkamera, ob der untere Teil des UV-Klebstoffs über der Oberseite des Objektivs zentriert erscheint.Während Sie durch die Kamera schauen, senken Sie die Sondenspitze ab, bis der UV-Kleber mit dem Objektiv in Kontakt kommt und 1/3 bis 1/2 seiner Oberseite bedeckt. Härten Sie den Kleber mit einer direktionalen, nahezu sichtbaren UV-Lichtquelle von 380 bis 400 Nanometer Wellenlänge und einer Intensität von etwa einem Milliwatt aus. PbS-Lösung in die Petrischale geben, bis das Auge bis zu einer Tiefe von mindestens zwei Millimetern bedeckt ist.Platzieren Sie eine zylindrische Linse vor dem Mikroskop und in enger Weise an der Petrischale, ohne sie zu berühren. Starten Sie gleichzeitig die Protokollierung in einem Timer-Programm. Machen Sie mit der Kamera ein Foto vom Auge und der Sonde.Nach 60 Sekunden beginnen Sie mit einer Verschiebung von 50 Mikrometern. Wiederholen Sie dies alle 60 Sekunden, bis das Experiment abgeschlossen ist, wie durch das Brechen aller Zonularfasern angezeigt. Speichern Sie die Skalierungsprotokollierungsdaten nach Abschluss eines Laufs und exportieren Sie sie in ein kompatibles Tabellenkalkulationsformat.Speichern Sie auch die während des Laufs erhaltenen Objektivbilder. Importieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle. Interpolieren Sie mit dem ersten und dem letzten Skalenwert die Drift im Hintergrundwert im Laufe der Zeit aufgrund der Verdunstung und subtrahieren Sie dann den interpolierten Hintergrund von der Messung in jedem Zeitpunkt.Nach der Durchführung des Assays und der Korrektur für die Verdampfung wird die Grafik der viskoelastischen Daten invertiert. Die Größe der momentanen und entspannten Kräfte nimmt mit jedem Schritt bis zu etwa 1.000 Sekunden zu und sinkt dann, wenn die zonulären Fasern zu brechen beginnen, bis der 1.500-Sekunden-Zeitpunkt erreicht ist, an dem alle Fasern gebrochen sind. Für diese Demonstration wurde auch die viskoelastische Reaktion für Wildtyp- und MAGP-1-defiziente Mäuse verglichen.Zum Anfangszeitpunkt von null bis 600 Sekunden ähneln sich die Graphen, was darauf hindeutet, dass die viskoelastischen Eigenschaften der zonulären Fasern nicht signifikant verändert wurden. Bei der MAGP-1 Knockout-Maus brechen die Fasern jedoch vorzeitig. Zonuläre Faserbruchkräfte wurden mit der Pull-up-Methode für MAGP-1 im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen in einem Monat und einem Jahr alten Stadien erhalten.Die Ergebnisse zeigten, dass die Stärke der Fasern bei Wildtypmäusen mit zunehmendem Alter zunimmt. Jeder versehentliche Kontakt mit der Petrischale während dieser Schritte kann dazu führen, dass sich die Augenwand relativ zur Augenlinse verschiebt und möglicherweise die zonulären Fasern beschädigt. Dieser Pull-up-Assay hilft bei der Identifizierung von Proteinen, die zur Zugfestigkeit von Mikrofibrillen beitragen.Wir werden diese Informationen verwenden, um realistischere Modelle des Inneren von Zonularfasern zu erstellen.

Research

JoVE Journal

Medicine

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To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Forschung

Medizin

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

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Bestimmung und Steuerung der externen Leistung während des regulären Handrim-Rollstuhlantriebs

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

Ein Sondierungsgerät zur quantitativen Messung der mechanischen Eigenschaften von Weichgeweben während der Arthroskopie

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...